Burada, normal gelişimi bozmadan canlı zebra balığı embriyolarının arka vücut gelişiminin uzun süreli hızlandırılmış görüntülemesine izin veren çok yönlü bir montaj yöntemi sunuyoruz.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Zebra balığı Kalkınma Uzun Süreli Görüntüleme için A yönlü Montaj Yöntemi
Bu makalede
Özet
Özet
Zebra balığı embriyolar nedeniyle erişilebilirlik ve optik şeffaflık kolaylığı karmaşık morfogenetik süreçleri incelemek için ideal bir deneysel sistem sunuyoruz. Özellikle, arka gövde uzama çoklu doku deformasyonları vücut ekseninin büyük bir kısmı oluşumunu yönlendirmek için birlikte hareket hangi embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Uzun vadeli time-lapse görüntüleme ile bu süreci gözlemlemek için yeterli destek mikroskop ve iktisap transferi sırasında doğru yönde örnekleri korumak için izin veren bir montaj tekniği kullanmak gerekir. Buna ek olarak, montaj aynı zamanda normal gelişimini etkilemeden arka gövde bölgenin büyümesi için yeterli hareket özgürlüğü sağlamak zorundadır. Son olarak, çeşitli görüntüleme set-up üzerinde görüntüleme izin montaj yönteminin çok yönlülüğü de belirli bir ölçüde olması gerekir. Burada, arka gövde elongatio gelişimini görüntüleme için bir montaj tekniği sunmakn Zebra balığı D. rerio içinde. Bu teknik uzatmak ve normalde geliştirmek için arka gövde bölgeyi dışarı çıkarken, baş ve yolk kesesi bölgeleri neredeyse tamamen agaroz dahildir şekilde embriyoların montaj içerir. Biz bu dik, ters ve dikey ışık sayfalık mikroskopisi set-up için adapte edilebilir gösterecektir. Bu protokol posterior vücut için görüntüleme için embriyolar montaj odaklanırken, kolayca zebrabalıkları gelişmenin birden yönlerini canlı görüntüleme için adapte edilebilir.
Giriş
Arka gövde uzama embriyo vücut eksenine büyük bir kısmını oluşturmak üzere uzandığı tarafından embriyonik gelişiminde önemli bir süreçtir. Bu, birden fazla hücre davranışları Bireysel dokular düzeyinde morfonogenezi oluşturmak için koordineli hareket hangi kompleks morfogenetik işlemin örneğidir. Bu diferansiyel doku deformasyonları sonra bütün yapı düzeyinde posterior vücudun uzamasını oluşturmak için birlikte hareket. Bu süreçler kontrollü ve gelişme sırasında koordine nasıl anlamak için, (moleküller, hücreler, hücre popülasyonlarının ve dokuların düzeyinde yani), birden ölçeklerde bu süreçleri takip etmek gerekir ve tüm yapının morfonogenezi doğrudan iliş....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Çözelti Hazırlanması ve çekti Cam İğne
- 20 mM Tris pH 8.8 içinde 4 mg / mL Tricaine (3-amino-benzoik asit etil ester, aynı zamanda adı etil 3-aminobenzoat) içindeki bir 25x stok çözeltisi yapmak ve bu çözelti, pH 4 mL mağaza tarafından 7. kısım en getirmek -20 ° C.
NOT: anestetik Tricaine böylece kas seğirmesi ve hareketi 6 engelleme nöral voltaj bağımlı sodyum kanalları tercihen hareket eder. - E3 embriyo ortam içinde 0.17 mg / ml'lik bir nihai konsantrasyonda Tricaine bir çalışma çözeltisi yapın. 7
NOT: Bu çözeltinin pH değeri sürüklenir olarak hazırlıksız bir şekilde çalışma çöz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Yukarıda özetlenen protokol uzun vadeli time lapse görüntüleme için zebra balığı embriyolarının montajı için çok yönlü bir teknik ayrıntıları. Bunun bir örneği, Şekil 2A ve / görüntü, Şekil 1 'animasyon gösterilir. Embriyolar mRNA photoconvertible floresan protein kikumeGR kodlayan 1 hücre aşamasında enjekte edilmiştir. 10X objektif bir ters konfokal mikroskop, yukarıda tarif edilen ve 12 saat boyunca görüntülenmiş olarak 15 hücre gruplarının aşaması.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu montaj tekniği embriyoların mikroskop ve çoklu uzunluk ölçeklerinde arka gövde uzama aşağıdaki amaçlayan üzerinde uzun vadeli zaman atlamalı görüntüleme deneyleri transferi sırasında hareketsiz tutulması sağlar. her iki dik olarak ters çevrilmiş mikroskop set up üzerinde görüntüleme sağlar ve bir öneri, bu daha dikey yönlendirilmiş SPIM uyarlanabilir nasıl yapılması ile Ayrıca, çok yönlüdür.
Bu protokol kritik bir adım, bu yapının normal gelişimini sağlayan önemli olan arka gövdesini çevr.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Estelle Hirsinger: Institut Pasteur ve Agence Nationale de la Recherche'den (ANR-10-BLAN-121801 DEVPROCESS) temel finansman. Estelle Hirsinger, Centre National de la Recherche Scientifique'den (CNRS) bir akademisyendir. Benjamin Steventon, Agence Nationale de la Recherche (ANR- 10-BLAN-121801 DEVPROCESS), ardından bir Roux bursu (Institut Pasteur) ve ardından bir AFM-Téléthon bursu (sayı 16829) tarafından finanse edildi. Şu anda bir Wellcome Trust / Royal Society Sir Henry Dale Bursu tarafından destekleniyor.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| SARF MALZEMELER | |||
| Cam tabanlı tabaklar | Mattek | P35-1.5-10-C | 35 mm Petri kabı, 10 mm mikro kuyu. No. 1.5 kapak camı |
| Enjeksiyon iğneleri için kılcal damarlar | Sutter | BF 120-94-10 | Filamentli, OD 1,20 mm, ID 0,94 mm, uzunluk 10 cm olan orosilikat cam kullanıyoruz. Bununla birlikte, filament iğneleri gerekli değildir ve çoğu enjeksiyon standart iğnesi işe yaramalıdır. |
| Mikro neşter | Tüy | P-715 | Plastik saplı Mikro Tüy tek kullanımlık oftalmik neşter |
| Pastör Pipetleri | 230 mm | ||
| uzunluğundaREAKTİFler | |||
| Trikain | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| Düşük erime noktalı agaroz | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| < güçlü > EKİPMANLAR< / güçlü > | |||
| İnce forseps ve nbsp; | GÜZEL BİLİM ARAÇLARI GMBH | 11252-30 | Dumont #5 |
| İğne çektirmesi ve nbsp; | Sutter | P97 | Isıtma filament iğne çektirme |
| Binoküler diseksiyon mikroskobu | Leica | S8 Apo |
Kaynaklar
- Graeden, E., Sive, H. Live Imaging of the Zebrafish Embryonic Brain by Confocal Microscopy. J Vis Exp. (26), e1-e2 (2009).
- Delaune, E. A., François, P., Shih, N. P., Amacher, S. L. Single-Cell-Resolution Imaging of the Impact of Notch Signaling and Mitosis on Segmen....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
