Yöntem makalesi

Tarama Transmisyon Elektron Tomografi ile hazırlanması ve Kalın Biyolojik Örneklerinin Gözlem

DOI:

10.3791/55215

⸱

12 Mart 2017

 ,  , 
1Institut Curie, INSERM U1196, Campus Universitaire d'Orsay, 2Institut Pasteur, Trypanosome Cell Biology Unit, Department of Parasites & Insect Vectors, INSERM U1201

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, kalın biyolojik örneklerin taramalı transmisyon elektron tomografisini gerçekleştirmek için bir numune hazırlama protokolünü ve özel görüntüleme koşullarını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, bir taramalı transmisyon elektron mikroskobu kullanarak daha fazla gözlem için kalın biyolojik örneklerin hazırlanmasına yönelik bir protokolü açıklar. Ayrıca, transmisyon elektron tomografisini tarayarak kalın biyolojik örneklerin 3D yapısını incelemek için bir görüntüleme yöntemini de açıklar. Numune hazırlama protokolü, numunenin kimyasal ajanlar kullanılarak sabitlendiği, ağır atom tuzu kontrast yapıcı bir ajan ile muamele edildiği, bir dizi etanol banyosunda dehidre edildiği ve reçineye gömüldüğü geleneksel yöntemlere dayanmaktadır. Transmisyon elektron mikroskobu taranarak kalın numuneleri gözlemlemek için özel görüntüleme koşulları daha sonra açıklanır. Numunenin bölümleri, çeşitli odak düzlemlerinde birkaç görüntünün toplanmasını içeren bir odak yöntemi kullanılarak gözlemlenir. Bu, numune boyunca çeşitli yüksekliklerde odak içi bilgilerin kurtarılmasını sağlar. Bu özel toplama modeli, tomografi verilerinin toplanması sırasında her eğim açısında gerçekleştirilir. Ardından, tüm farklı odak düzlemlerinden gelen odak içi bilgileri birleştiren tek bir görüntü oluşturulur. Daha sonra klasik bir eğim serisi veri kümesi oluşturulur. Yöntemin avantajı, eğim serisi hizalama ve rekonstrüksiyonun standart aletler kullanılarak gerçekleştirilebilmesidir. Odak içi görüntülerin toplanması, odaktaki numunenin tüm yapısal ayrıntılarını içeren bir 3D hacmin yeniden yapılandırılmasına olanak tanır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1970'lerin başından beri, tomografi yaygın biyolojik örneklerin 1, 2, 3 yapısal karakterizasyonu için kullanılmıştır transmisyon elektron mikroskobu (TEM) yaklaşımları. Transmisyon elektron tomografi Temyizinizi hücre mimarisi ve makromoleküler kompleksler ve proteinlerin yapı organellerin ultrastrüktürü arasında, nanometre ölçeğinde biyolojik yapıların geniş bir çalışma için kullanılabilir olmasıdır. Bununla birlikte, elektron tomografisi çok kalın örnekleri (daha büyük 0,5 um) incelemek için kullanılabilir olabilir. Nitekim, kalın örnekleri düşük sinyal-gürültü oranı (SNR) görüntüler oluşturmak, çok dağınık elektronlar üretir. Buna ek olarak, tomografi eğim açısı ile artan numunenin belirgin kalınlıkta, eğimli örneklerin görüntüleri koleksiyonu içerir. Hatta inelastik saçılma filtre edilebilir olsa daEnerji filtreleri kullanarak, yüksek SNR görüntüler için gerekli elektron kritik miktarı ancak TEM ulaşılır. Bu nedenle, kalın biyolojik örnekler sadece 4 kesit kullanılarak incelenmiştir.

onlar kesilir bazı düşürebilir, ve diğerleri kendi karmaşıklığını anlamak için kendi bütünlüğü içinde çalışılması gereken: Bazı numuneler dilimlenmiş edilemez. Alternatif bir yaklaşım, tarama modu 5, 6, 7, 8 TEM kullanmaktır. transmisyon elektron mikroskobu (STEM) tarayarak olarak, elektronların optik yol, geleneksel TEM farklıdır. Elastik dağılmış olan koyu alan (DF) detektörü ile optik eksenden belirli bir açı ile toplanabilir ise saçılma olmadan örnek geçen elektronlar, parlak-alan (BF) detektörü 9 optik eksen üzerinde toplanabilir.KÖK diğer avantajı odaklanmış bir elektron ışını görüntüleri piksel-piksel toplama sağlayan numunenin yüzeyi taranır olmasıdır. Numune 10 geçerken elektron ışını genişletir olsa da, bu özel koleksiyon düzeni geleneksel TEM daha esnek olmayan dağınık elektron daha az duyarlıdır. Ayrıca, bu suretle TEM oluşabilir kromatik sapmaları kaçınarak STEM hiçbir objektif sonrası numune vardır. BF detektörü esas unscattered elektronlar algılaması için Kamera boyu ayarlanabilir. Kalın örnekleri incelemek için DF dedektörü kullanılarak, çünkü yanlış görüntüler üretir çoklu saçılma, tavsiye edilmez. Bunun yerine, BF detektörü 11 kullanılabilir. KÖK yüksek SNR görüntüler üretmek mümkün olmakla birlikte, kalın elde edilebilir derinlemesine bilgi miktarını azaltarak, çünkü TEM kıyasla nispeten yüksek ışın yakınsama nispeten düşük derinliği-of-field vardırnumuneler. odakta bilgi sadece birkaç nanometre bir odak düzlemi kaynaklanan şekilde yakınsama açısı 30 Mrad kadar yüksek olabilir sapmaları düzeltilmiş KÖK mikroskobu, durumunda, derinliği alanı kadar düşük olabilir . Paralel mod elektron ışını ayarlama derinliğini alan elektron ışınının çözünürlüğü 12 zararına artırır. Bununla birlikte, bu kurulum her zaman mümkün değildir.

Bir yakınsak elektron demeti kullanımı için gerekli olan zaman, tek bir kalın örnekleri incelenirken derinliğini alan elektron ışını arttırmak teknikleri kullanmak gerekir. Son çalışmalar içinde odak bilgileri 13, 14 maksimum miktarda kurtarmak için numune boyunca çeşitli odak düzlemleri birden fazla görüntü alımını bildirdi. İki çalışmalar, farklı odak düzlemleri bilgi işlemek için farklı yolları açıklanmaktadır. Hovden ve diğ.Çeşitli odak düzlemleri toplanmıştır görüntüleri Fourier uzayında birleştirildi ve nihai imar 13 dönüşümü 3D ters Fourier doğrudan elde edilmiştir. Bunun aksine, Dahmen ve ark. Gerçek uzayda çeşitli odak düzlemleri 14 3D hacmini yeniden bir yakınsak ışın yeniden motorunu geliştirdi. Laboratuvarımız ayrıca kalın biyolojik örneklerin görüntüleme için bir yöntem geliştirdi. Bizim stratejimiz, biz çeşitli odak düzlemleri içinde odak olan bilgileri birleşti ve bir paralel ışın projektörü 15 kullanarak gerçek uzayda son 3D hacmini yeniden ki yukarıda anlatılan iki yöntemden farklı oldu. Amacımız, kolaylıkla bir elektron mikroskobu laboratuarda yapılabilir bir yöntem geliştirmektir. Bu amaçla, geleneksel tomografi deneylerin zaman çerçevesi ile karşılaştırılabilir zaman sınırlı bir miktarda, odak görüntüleri toplamak amaçlanmıştır. Ayrıca, önerilen yöntem chizalama ve yeniden yazılım farklı tipleri ile kullanılmak üzere uyarlanabilir ould.

2015 15 bizim yayın bağlamda, görselleştirmek ve derinliği alanının kurtarma karakterize etmek istedim, bu yüzden biz 25 mrad büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. Burada, 2015 yılında 15 laboratuvarda geliştirilen yönteme göre STEM yoluyla odak görüntüleme gerçekleştirmek için bir adım-adım protokolü mevcut ve biz 2015 verileri işlendi nasıl sunuyoruz. Bu yöntem kalın (750 nm) biyolojik numune boyunca birçok odak düzlemleri gelen odak bilgileri kurtarır ve yüksek kaliteli 3D rekonstrüksiyon sağlar. Uygun durumlarda, diğer gruplar tarafından kullanılan yöntemlerden karşı bu metodoloji farklılıklar da sunulmuştur.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dikkat: kullanmadan önce çeşitli reaktif malzeme güvenliği veri sayfaları (MSDS) başvurun. Numune hazırlama sırasında kullanılan kimyasalların çeşitli ve / veya üreme için, toksik, kanserojen, mutajen bulunmaktadır. örnek işlerken davlumbaz altında kişisel koruyucu donanım (eldiven, laboratuvar önlüğü, tam uzunlukta pantolon ve kapalı ayak ayakkabılar) ve çalışmayı kullanma. Ultramikrotomla örnek kesit keskin aletlerin kullanımını gerektirir ve bu araçların dikkatli kullanılması zorunludur. Aşağıdaki açıklanan adımların, yazarlar örnek, bir hücre kültürü örneği olduğu varsayılmaktadır. Protokol örnek tipi, özellikle santrifüj adımlarına göre modifiye edilmesi gerekebilir.

Tamponlar ve Karışımların hazırlanması 1.

  1. Fosfat tamponlu tuz (PBS) çözeltisi hazırlayın (137 mM NaCI, 2.7 mM KCI, 10 mM Na-2 HPO 4 ve 1.76 mM KH 2 PO 4).
  2. % 30,% 50 ve% 70 et içeren çözümleri hazırlayınNumune dehidrasyon için PBS içinde HANOL. yavaş yavaş etanol konsantrasyonları artan inkübe edilmesiyle örnek dehidratasyon gerçekleştirin.
  3. (Süksinik anhidrür (9 mL), metil-5-norbornen-2,3-dikarboksilik (11 ml) ve 2,4,6-tris dodesenil bisfenol-A- (epiklorohidrin) (20 mL) karıştırılarak epoksi reçine hazırlanması dimetilaminometil) fenol (0.7 mL); Diğer karışım oranları reçine arzu edilen sertliğine bağlı kullanılabilir.
  4. Örnek yerleştirilmesi için etanol içinde% 30,% 50, ve% 70 epoksi reçine içeren çözeltiler hazırlayın. yavaş yavaş reçine artan konsantrasyonlarda ile inkübe edilmesiyle reçine katıştırma gerçekleştirin.
    NOT: Bu şekilde hazırlanan solüsyonlardan hacimleri incelenmiştir numune tipine bağlıdır. Daha çözeltileri hücre kültürleri için daha dokular için ihtiyaç vardır.

Örnek 2. Fiksasyon ve Renklendirme

  1. x g 5,000 5 dakika boyunca hücre kültürü santrifüj. aynı koşullar kullanılarak, aşağıdaki santrifüj tümünü gerçekleştirebilir.
  2. Süpernatant atılır ve% 4 paraformaldehid ve% 2 glutaraldehid ile, PBS (1 mL) içinde yeniden süspanse hücre pelletini düzeltin. 30 dakika (Şekil 1A), oda sıcaklığında inkübe edin. Alternatif olarak, bir gecede ya da hafta sonu 4 ° C'de hücreleri saptamak.
  3. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak tespit edici maddeler uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın.
  4. Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca PBS (1 mL) içinde% 1 OsO 4 örnek sonrası düzeltin.
  5. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve tam olarak OsO 4 kaldırmak için, PBS (1 mL) ile pelet 3 kez yıkayın. Petrol ve ıskarta olarak OSO 4 devre dışı bırakın.
  6. Bir kontrast maddesi olarak PBS (1 mL) içinde% 2'lik üranil asetat ilave edilir ve oda sıcaklığında (Şekil 1B), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  7. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant kaldırmak ve bağlanmamış uranil ac uzaklaştırmak için PBS (1 mL) ile pelet 3 kere yıkayınasetatın; uranil asetat radyoaktif elementler içerir ve radyoaktif atık adanmış bir bin atılmalıdır.
    Not: Örnek ölçülerine uygun bir bekleme süresi değiştirilebilir. örneğin tespit ve doku örnekleri gibi kalın örneklerde, boyama için, uzun inkübasyon süreleri gerektirir. Daha uzun inkübasyon süreleri de dehidrasyon ve katıştırma adımlar için daha iyi olabilir. Uranil asetat Gadolinyum tuzlar içeren bir "uranil-az" bir çözüm ile değiştirilebilir.

3. Numune Dehidrasyon

  1. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve% 30 etanol ile PBS içinde 4 ° C'de (1 mL) içinde (Şekil 1C), 30 dakika boyunca örnek inkübe edin.
  2. giderek artan etanol konsantrasyonları ile (% 50,% 70, ve% 100'e kadar) çözümlerini kullanarak adımı tekrarlayın 3.1. Bu dehidrasyon adımları sırasında, numune saklama amaçlı 4 ° C 'de örnek muhafaza.
  3. Santrifüj işleminden sonra, supernat atmakAnt ve saf etanol (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; 4 ° C'de bir gece inkübe edilir.

4. Reçine Gömme

  1. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve oda sıcaklığında (Şekil 1D) 30 dakika boyunca% 30 epoksi reçine (1 mL) ile etanol içinde pelletini.
  2. giderek artan epoksi reçine konsantrasyonları ile çözümlerini kullanarak adımı yineleyin 4,1 (% 50,% 70, ve% 100'e kadar).
  3. Santrifüj işleminden sonra, süpernatant atılır ve saf epoksi reçinesi (1 mL) içinde tekrar süspansiyon pelet; Gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir. reçine polimerizasyonu tetikleyebilir DMP-30 sertleşme varlığı; Bu olursa, epoksi reçine iki toplu, ile bir ve DMP-30 olmadan birini hazırlamak.
  4. Santrifüj işleminden sonra, saf epoksi reçinesi 200 uL plastik bir kapsül içinde (bir sertleştirici içeren) pelet tekrar süspansiyon; Numune plastik kapsül altında olmalıdır.

5. Reçine Polimerizasyon

  1. ben48 saat boyunca 60 ° C'ye ayarlanmış bir inkübatörde örneği içeren plastik kapsül ncubate; reçine diğer tür farklı ayarlarla polimerize olabilir.
  2. inkübatör kapsülü çıkartın ve reçine polimerize olduğunu doğrulamak; Sert bir yüzeye bastırılır eğer reçine zor olmalı.
  3. örnek içeren polimerize reçinenin üzerine (sertleştirici ihtiva eder) saf epoksi reçinesi ekleme; reçine bu ekstra katman daha kolay örnek kesmek için yapacaktır. 48 saat boyunca 60 ° C 'de kapsül inkübe edin.

6. Numune Kesit

  1. Numune üste doğru olacak şekilde numune tutucu örnek ters monte edin ve ultramicrotome kırpma blok üzerine sabitleyin. Sıkıca ultramicrotome için düzeltme bloğu sabitlemek için kolu kilitleyin.
  2. Bir jilet veya benzeri keskin kesme aleti kullanılarak, polimerize reçine ayırmak için plastik kapsül kesip. örnek içeren böylece reçinenin kesinbir piramit yaklaşık şeklindeki reçine Ed. Tüm plastik kapsül kaldırmak için gerek yoktur; Sadece polimerize örnek kaplayan kısmını kaldırın.
  3. kapsül ve kırpma blok kapalı numune tutucu alın ve ultramicrotome hareketli koluna monte edin.
  4. bıçak blokta bir düzeltme bıçağı takın ve doğru bir piramit yüzleri kırpın. dürbün kullanımı piramit için mükemmel bir şekil vermek için tavsiye edilir; piramit daha iyi bölümler olacak.
  5. kırpma bıçağı çıkar ve daha kalın 0.5 mikron olan bölümleri kesmek için kullanılabilecek bir histoloji bıçakla değiştirin.
  6. uygun miktarda su ile histolojik bıçağının küvet doldurduktan sonra, numunenin yüzeyine bıçağın kesici kenar getirmek ve bıçak piramit dik dilim böylece kapsülün hatve açısını ayarlamak için dürbün kullanın.
  7. İstenilen göre kesme hızını ayarlayınkesit kalınlığı homojen bölümleri kurtarmak için.
  8. su üzerinde bölüm şamandıra edelim ve bir döngü ile balık.
  9. filtre kağıdı üzerine yerleştirilmiş olan bir elektron mikroskobu bakır ızgara doğru döngü hareket ettirin.
    NOT: Izgara onun hydrophilicity artırmak için önceden tedavi edilmiş olması gerekirdi. Bu ızgara kaplama kalem ile gerçekleştirilebilir.
  10. Nedeniyle filtre kağıdı su emilimi, bölüm ızgara dönelim. Elektron mikroskobu yerleştirmeden önce birkaç dakika kurumaya bırakın.

Through-odak Tilt-serisi 7. Tasarım

  1. sabit odak aralıklarla aracılığıyla odak görüntüleri toplayın.
    NOT: aracılığıyla odak tilt serisi tilt-serisi her eğim açısı toplanır aracılığıyla odak görüntülerin bir dizi oluşur. Bütün odaklama genliği, tüm numune kalınlığının karşılamak için yeterli olmalıdır.
  2. Odak aralığı değerini belirler. aralığı d eşitseepth-of-field, odak tüm örnek toplamak; Bu ayar mümkün olan en yüksek örnekleme temsil eder. aralık derinliği alanında büyükse, numunenin bazı bölümleri numunenin bazı kısımları odak tahsil edilmeyecektir, yani odak elde edilmeyecektir.
  3. derinliğini alan elektronun dalga boyu arasında bir elektron ışını ve elektron ışını yakınsama yarı açısı hesaplanır. Elektronların dalga boyu doğrudan ivme gerilimine bağlı iken, elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan yakınsama yarı açı kullanmak veya bilinen numune 16 kırınım deseninden deneysel olarak belirler. Elektronlar bir dalga boyu l hızlandırılmış Çünkü bir elektron mikroskobu a bir yakınsama yarı açı ile örnek vurmak, derinliği alanını (DOF) belirlemek için aşağıdaki denklemi kullanın:

    figure-protocol-1
  4. dizaynBütün odak genlik maksimal belirgin kalınlıkta örnek kapsayacak şekilde odak serisi (yani en yüksek hızıyla).
    NOT: Odak genlik fazla 2.19 mikron olmalı böylece A 0,75 mikron kalınlığında numune, 70 ° hızıyla 2.19 mikron belirgin bir kalınlığa sahip olacak. Yukarıda belirlenen odak aralığı 50 nm'ye eşit ise, bu örnek için, bu maksimum belirgin kalınlıkta örnek kapak 44 görüntü (2.19 um / 50 nm) gerektirecektir. Bütün odak genlik odak adım sayısı ile çarpılır odak aralığının değerine eşittir. En yüksek eğim (θ) 'de, örnek görülür kalınlığı şu şekilde tanımlanır:

    figure-protocol-2

8. Örnek Görüntüleme

NOT: KÖK modunda bir elektron mikroskobu kurmak için nasıl açıklamak için bu protokol kapsamı dışındadır; Bu bilgilerin çoğunu bulunabilir in referans el kitabı elektron mikroskobu üreticisi tarafından sağlanan. Ancak, aşağıdaki noktalara dikkat edin: i) spot büyüklüğü istenen büyütme göre seçilmelidir; ii) Ronchigram iyi hizada olmalıdır; ve iii) BF modunda, kamera uzunluğu dedektörün iyi aydınlatma korurken unscattered elektronları seçmek için ayarlanması gerekir. elektron mikroskobu bakır ızgaralar üzerinde biriken reçine bölümleri küçülmesini önlemek için görüntü alımı öncesinde ışıklı olmalıdır. Reçine büzülme ve şarj etkileri görüntü alımı sırasında eleştirilmiştir olabilir. Şarj etkiler ortaya çıktığında bir objektif lens açıklığı kullanımı örnek istikrarı geliştirmek olabilir. Ancak, KÖK kurulumları özelinde, objektif diyafram HAADF görüntüleme modu ile uyumlu değildir ve çok küçük objektif delikler BF görüntüleme modu ile uyumlu değildir.

  1. Düşük büyütme (STEM olarak 20,000X civarında) kullanılarak, numune göz atabilir ve ilgi bölgeyi bulun.
  2. t ayarlayınörnek dönerken ilgi bölge sürüklenip kalmaması o yüksekliği (Z ekseni) eucentric.
  3. ilgi nesnesi tüm eğim aralığı boyunca görünür kalacaktır emin olun.
  4. Çünkü içinden odak tilt-serisi sırasında elde edilen görüntü önemli sayıda, otomatik toplama yazılımı kullanın. Ya bir ticari çözüm kullanmak ya da istenirse özel bir veri toplama yazılım tasarımı. yazılım programı üç aşağıdaki adımları gerçekleştirmek mümkün olduğundan emin olun:
    1. Parça ve standart eğim serisi toplama düzeni olarak odaklanır.
    2. ile odak görüntüler numunenin Z-pozisyonunda örtüşüyor emin olun.
    3. Otomatik olarak her eğim açısında aracılığıyla-fokal görüntüleri bir dizi kazanır.
  5. Yazılım programı aracılığıyla odak tilt-serisinin ana parametreleri vermek (yani, odak aralıkları, fokal adım, asgari eğim açısı, maksimum eğim açısı, eğim adım ve tarama hızı).
  6. BaşlamaYazılım programı bitirmek için görüntü toplama süreci ve bekleyin.

9. Görüntü İşleme

NOT: Bu protokol, through-fokal tilt serisi işleme ImageJ eklentileri 17 kullanılarak gerçekleştirilir. Ek Veriler 1 hizalama adım (Turboreg) ve üç odak değerleri ile tasarlanmış aracılığıyla odak tilt-serisi için de odak bilgisini (Alan Genişletilmiş Derinliği) birleştirmek için bir ImageJ makro gösterir.

  1. Aynı eğim açısı (yani yoluyla-odak görüntüler) toplanan görüntüleri hizalayın. görüntüler aynı olarak odak bilgiye sahip olmadığı için, onlar uyum için aynı özellikleri liman yok; komşu görüntüleri ikişer ikişer hizalayarak hizalama işlemini (yani, ilk yakın odak değerleri ile bir piramidal hiyerarşi, aşağıdaki) Turboreg 18, bir ImageJ eklentisi kullanarak.
  2. Sürekli her eğim açısında aracılığıyla odak görüntülerin uyum doğrulayın.görsel denetim geliştirmek için hizalanmış aracılığıyla odak görüntüleri Stack.
    NOT: yığının üzerinden tarama yaparken sadece bölge odakta hareket etmelidir. Bir sonraki adım, farklı görüntüleri odak bilgilerin geri kazanımı oluşur çünkü doğru hizalama, en önemli şeydir.
  3. Alan 19, bir ImageJ eklentisi Genişletilmiş derinliği kullanarak odakta olan bilgileri birleştirmek; Bu sonuçta görüntüleri yığından tek bir görüntü oluşturur. Çeşitli ayarlar derinliği alanında kurtarma sırasında kullanılan, ancak görüntü bilgilerini korumak için en yüksek ayarlarını kullanmak olabilir.
    NOT: tilt-serisi şimdi eğim açısı başına tek bir görüntü oluşur, içinde odak bilgilerini içeren her bir görüntü ile odak görüntüleri kurtarıldı.
  4. veri işlemek.
    NOT: Veri artık standart eğim serisi azaltılmış beri uyum ve yeniden inşası için standart araçlar kullanılabilir. Bu protokolde, TomoJ bizized veri hizalama ve veri yeniden 20, 21. TomoJ nasıl kullanılacağı hakkında daha fazla detay orijinal yayın 22 bulunabilir.
  5. tilt-serisi ince ayarı gerçekleştirin.
    NOT: İyi bir strateji doğru görüntüler arasında vardiya izlemek için referans belirteç olarak altın boncuk kullanmaktır. altın boncuk örnek eklenemez halinde, yerel minimum de kullanılabilir.
  6. hizalanmış verilerin 3D rekonstrüksiyon gerçekleştirin; çeşitli algoritmalar gerçek uzayda veya Fourier uzayında, avantaj ve sınırlamaları ile her rekonstrüksiyon gerçekleştirmek için kullanılabilir.
  7. tilt-serisi son hizalama kötüyse, ilk adımları optimize ederek bazı iyileştirmeler yapmak. Nihai 3D rekonstrüksiyon bulanık ya da deforme görünüyorsa hizalama adımlarını yinelemek; Uygulamada, toplanan odak düzlemleri daha fazla sayıda, daha iyi kontrast ve 3 boyutlu rekonstrüksiyon ayrıntıları.
    NOT: SeVeral yazılım programları aracılığıyla odak tilt-serisi işlemek için kullanılabilir. Ancak, bu protokolde kullanılan araçlar seçildi çünkü, bizim deneyim, onlar en iyi performansı. Turboreg 18 odak gradyanı mevcut olduğu zaman görüntüleri hizalama açısından iyi performans gösterdi. Daha fazla bilgi adanmış web sitesinde 23 bulunabilir. Diğer araçlar görünür piksel değişiklikler sonuçlandı oysa Alan eklentisi 19 Genişletilmiş Derinlik, farklı görüntüleri de-odak bilgileri kurtarma açısından çok iyi bir performans. Daha fazla bilgi, özellikle ilgili senaryo yazma, bu adanmış web sitesinde 24 bulunabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bizim çalışmamızda, elektronlar alan emisyon silah transmisyon elektron mikroskobu 200 kV hız verilmiştir. Görüntüler 20 uS bekleme süresi kullanılarak KÖK BF modunda toplanmıştır. ile odak tilt-serisinin tasarımı ile ilgili olarak, biz bir 750 nm kalınlığında biyolojik numune bile elektron ışınının derinliği alan olmasına rağmen sadece ultrastrüktürel çalışma için tatmin edici sonuçlar verdi nm 150 o odak aralıkları bulundu 3 nm beri 25 mrad çok büyük bir yakınsama yarı açı kullanılır. ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, biz aracılığıyla odak tomografi STEM kullanarak kalın biyolojik örnekler üzerinde 3D analizlerini gerçekleştirmek için bir adım-adım kılavuz ile birlikte geleneksel numune hazırlama protokol mevcut. Biyolojik örneklerin reçine gömme yıllardır 26 için kullanılır olmuştur, ve örneklerin farklı uyarlanmış alternatif protokoller literatürde 27 boyunca bulunabilir. Bunun aksine, STEM görüntüleme kalınlıkta numuneler yeni bir teşebbüse odak-boyunca yöntemleri kullan...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklayacak herhangi bir çıkar çatışmamız yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma iki ANR hibesi (ANR-11-BSV8-016 ve ANR-10-IDEX-0001-02) tarafından finanse edilmiştir. Ayrıca, kimyasal görüntüleme ekipmanlarına erişim sağladığı için PICT-IBiSA'ya da teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Fosfat Tamponlu TuzluSalamin Sigma-AldrichP4417
EtanolSigma-Aldrich2860
Epoksi reçineEMS14120
ParaformaldehitSigma-AldrichP6148Yaklaşık 60 ° C.
'de ısıtılan PBS'ye paraformaldehit tozu ekleyin PFA tozu görünmeyene kadar 1 N NaOH ekleyerek pH'ı artırın.
GluteraldehitSigma-AldrichG5882 
Osmiyum TetroxydeEMS19150
Uranil AsetatSigma-Aldrich73943
Jelatin KapsülEMS70110
Kırpma ve Histo bıçaklarıLFG DağıtımDiatom elmas bıçaklar
Elektron Mikroskobu bakır ızgaraLFG DağıtımG200-Cu
Izgara Kaplama KalemiLFG Dağıtım70624
Numune TutucuJEOLEM-21311 HTR
Elektron MikroskobuJEOLJEM-2200FS

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. De Rosier, D. J., Klug, A. Reconstruction of three dimensional structures from electron micrographs. Nature. 217 (5124), 130-134 (1968).
  2. Gan, L., Jensen, G. J. Electron tomography of cells. Q Rev Biophys. 45 (1), 27-56 (2012).
  3. Lucic, V., Rigort, A., Baumeister, W. Cryo-electron tomography: the challenge of doing structural biology in situ. J Cell Biol. 202 (3), 407-419 (2013).
  4. Al-Amoudi, A., et al. Cryo-electron microscopy of vitreous sections. EMBO J. 23 (18), 3583-3588 (2004).
  5. Koguchi, M., et al. Three-dimensional STEM for observing nanostructures. J Electron Microsc (Tokyo). 50 (3), 235-241 (2001).
  6. Midgley, P. A., Weyland, M. 3D electron microscopy in the physical sciences: the development of Z-contrast and EFTEM tomography. Ultramicroscopy. 96 (3-4), 413-431 (2003).
  7. Sousa, A. A., Azari, A. A., Zhang, G., Leapman, R. D. Dual-axis electron tomography of biological specimens: Extending the limits of specimen thickness with bright-field STEM imaging. J Struct Biol. 174 (1), 107-114 (2011).
  8. Sousa, A. A., Leapman, R. D. Development and application of STEM for the biological sciences. Ultramicroscopy. , 38-49 (2012).
  9. Ercius, P., Muller, D. Incoherent bright field STEM for imaging and tomography of ultra-thick TEM cross-sections. Microsc Microanal. 15, (2009).
  10. Hyun, J. K., Ercius, P., Muller, D. A. Beam spreading and spatial resolution in thick organic specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 1-7 (2008).
  11. Aoyama, K., Takagi, T., Hirase, A., Miyazawa, A. STEM tomography for thick biological specimens. Ultramicroscopy. 109 (1), 70-80 (2008).
  12. Biskupek, J., Leschner, J., Walther, P., Kaiser, U. Optimization of STEM tomography acquisition--a comparison of convergent beam and parallel beam STEM tomography. Ultramicroscopy. 110 (9), 1231-1237 (2010).
  13. Hovden, R., et al. Breaking the Crowther limit: combining depth-sectioning and tilt tomography for high-resolution, wide-field 3D reconstructions. Ultramicroscopy. 140, 26-31 (2014).
  14. Dahmen, T., et al. Combined scanning transmission electron microscopy tilt- and focal series. Microsc Microanal. 20 (2), 548-560 (2014).
  15. Trepout, S., Messaoudi, C., Perrot, S., Bastin, P., Marco, S. Scanning transmission electron microscopy through-focal tilt-series on biological specimens. Micron. 77, 9-15 (2015).
  16. Weyland, M., Muller, D. A. Tuning the convergence angle for optimum STEM performance. FEI Nanosolutions. 1 (24), (2005).
  17. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  18. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  19. Forster, B., Van De Ville, D., Berent, J., Sage, D., Unser, M. Complex wavelets for extended depth-of-field: a new method for the fusion of multichannel microscopy images. Microsc Res Tech. 65 (1-2), 33-42 (2004).
  20. Messaoudii, C., Boudier, T., Sanchez Sorzano,, O, C., Marco, S. TomoJ: tomography software for three-dimensional reconstruction in transmission electron microscopy. BMC Bioinformatics. 8, 288(2007).
  21. Sorzano, C. O., et al. Marker-free image registration of electron tomography tilt-series. BMC Bioinformatics. 10, 124(2009).
  22. Messaoudi, C. , Available from: http://cmib.curie.fr/fr/download/softwares/TomoJ (2016).
  23. Thevenaz, P. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg (2016).
  24. Forster, B. , Available from: http://bigwww.epfl.ch/demo/edf/ (2016).
  25. Kohl, L., Bastin, P. The flagellum of trypanosomes. Int Rev Cytol. 244, 227-285 (2005).
  26. Luft, J. H. Improvements in epoxy resin embedding methods. J Biophys Biochem Cytol. 9, 409-414 (1961).
  27. Mielanczyk, L., Matysiak, N., Michalski, M., Buldak, R., Wojnicz, R. Closer to the native state. Critical evaluation of cryo-techniques for Transmission Electron Microscopy: preparation of biological samples. Folia Histochem Cytobiol. 52 (1), 1-17 (2014).
  28. Hovden, R., Xin, H. L., Muller, D. A. Extended depth of field for high-resolution scanning transmission electron microscopy. Microsc Microanal. 17 (1), 75-80 (2011).
  29. Dahmen, T., et al. The Ettention software package. Ultramicroscopy. 161, 110-118 (2016).
  30. Murata, K., et al. Whole-cell imaging of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae by high-voltage scanning transmission electron tomography. Ultramicroscopy. 146, 39-45 (2014).
  31. Kizilyaprak, C., Daraspe, J., Humbel, B. M. Focused ion beam scanning electron microscopy in biology. J Microsc. 254 (3), 109-114 (2014).
  32. Kubota, Y. New developments in electron microscopy for serial image acquisition of neuronal profiles. Microscopy (Oxf). 64 (1), 27-36 (2015).
  33. Levin, B. D., et al. Nanomaterial datasets to advance tomography in scanning transmission electron microscopy. Sci Data. 3, 160041(2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Elektron MikroskobuNumune Haz rlamaOdak Ge i li G r nt lemeE im Serisi Hizalama3D Rekonstr ksiyonRe ine G mmeUltramikrotomiYak nsak I n Modu

İlgili makaleler