Sıçan gözlerinin içine insan retina Pigment epitel hücrelerinin Trans-scleral Subretinal nakli için rafine bir protokol geliştirilmesi

Summary

Subretinal enjeksiyon kök hücre replasman tedavisi için yaşa bağlı makula dejenerasyonu preklinik çalışmalarda yaygın olarak uygulanmıştır. Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz daha az riskli, tekrarlanabilir ve tam olarak değiştirilmiş subretinal enjeksiyon tekniğini hücrelerin sıçan gözlerinin içine sunmak için trans-scleral yaklaşım yoluyla tanımlamak.

Abstract

Yaşa bağlı makula dejenerasyonu (AMD) gibi dejeneratif retinal hastalıkları geri döndürülemez görme kaybı dünya çapında önde gelen nedenidir. AMD bir monolayer işlevsel olarak destekleyen ve anatomik olarak sinirsel retina kaydırma hücre vardır retina pigment epitel (RPE) hücresi dejenerasyonu ile karakterizedir. Sigara neovasküler AMD (kuru AMD) için mevcut farmakolojik tedaviler yalnızca hastalık ilerleme yavaş ama vizyon, roman tedavi stratejileri belirleme amaçlı çalışmalar gerektiren geri yükleyemezsiniz. Dejeneratif RPE hücrelerinin sağlıklı hücreleri tutar söz ile kuru AMD gelecekte tedavi etmek için eski yerine koymak. Kök hücre kaynaklı RPE hücrelerinin nakli subretinal enjeksiyon tekniği uygulanacağı hayvan modellerin subretinal boşluğa dahil AMD için kök hücre yerine tedavilerin geniş preklinik çalışmaları. En sık preklinik bu hayvan çalışmalarda kullanılan iğne ucunun doğrudan görselleştirme eksikliği nedeniyle zor yapılan ve kez retina zarar görmesine neden trans-scleral rota üzerinden yaklaşımdır. Vitre alternatif bir yaklaşımla iğne Bitiş pozisyonu doğrudan gözlem için sağlar, ancak daha fazla göz doku rahatsız gibi cerrahi travma yüksek risk taşır. Biz başarıyla ve tutarlı bir şekilde RPE hücrelerinin sıçan subretinal boşluğa teslim ve aşırı retina zarar görmemesi için tanımlanmış iğne açılardan ve derinliklerden kullanan bir daha az riskli ve tekrarlanabilir değiştirilmiş trans-scleral enjeksiyon yöntemi geliştirdik. Bu şekilde teslim hücreleri daha önce en az 2 ay süreyle Cerrahlar Kraliyet Koleji (RCS) köstebeğiyle etkili olmak gösterilmiştir. Bu teknik sadece hücre transplantasyonu için aynı zamanda küçük moleküller veya gen tedavileri teslim etmek için kullanılabilir.

Introduction

İnsan retina göz fonksiyonları arka ışık duyusal mendil bulunan ve vizyon algı kritik bir rol oynamaktadır. Retina hücre fonksiyon bozukluğu veya hücre ölümü bu nedenle görme sorunları veya kalıcı körlüğe neden olur. Dejenerasyon veya disfonksiyon farklı katmanları retina hücreleri içeren bozukluklar arasında AMD en yaygın türü ve gelişmiş ülkelerde ^{Yaşlılarda geri dönüşü olmayan körlük önde gelen nedenidir olan dejeneratif retina hastalıkları olarak bilinir 1,2}. AMD patolojik süreç RPE katman ve sırayla RPE destek photoreceptor fizyoloji, sinirsel retinal atrofi ve vizyon kaybı^{3yol bozar temel Bruch'ın membran arasında "drusen" birikmesi ile ilişkili. 4,5}. Şimdiye kadar tedavisi yok mu için Gelişmiş (neovasküler olmayan) AMD kuru. Kök hücre tedavisi rejeneratif tıp yeni bir paradigma olarak ortaya çıkması işlevsel olmayan ölü ya da diri RPE hücrelerinin sağlıklı hücrelere kök hücre kaynaklı yerine umut getiriyor. Nitekim, dikim geniş preklinik çalışmaları kök hücre (örneğin, insan embriyonik kök hücre)-türetilmiş RPE hücrelerinin RPE dejeneratif hayvan modelleri içine-si olmak be gerçekleştirilen^6,7bazıları için ilerledi, klinik çalışmalarda^8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Son zamanlarda, kök hücre insan RPE katmanda insan RPE kök hücreleri (hRPESCs), ikamet alternatif kaynağı bizim lab tarafından tespit edildi ve hRPESC türetilen-RPE hücre (hRPESC-RPE) ekimi tedavisi preklinik çalışmalarda AMD için kullanılmakta olan ^{10 , 11 , 12 , 13}.

Subretinal enjeksiyon tekniği grubumuza dahil olmak üzere birden çok grubu tarafından yukarıda belirtilen preklinik çalışmalarda uygulanır. Hayvanlarda subretinal enjeksiyon için iki genel yaklaşım vardır: trans-vitreal ve trans-scleral. Trans-vitreal yaklaşım ön göz nüfuz eder, tüm vitreal kavite lens bitişik haçlar ve geri dön subretinal ulaşmak için göz retina nüfuz olarak doğrudan iğne sonuna gözlemlemek için güçlü olmak cerrah avantajı vardır alan^14,15,16. Ancak, bu iki konum (anterior ve posteiror), retinada engellemeden objektifin zarar riski taşımaktadır ve iğne geri çektiği zaman içinde hücrelerin geri Vitre neden olabilir gerektirir. Buna ek olarak, trans-sklera yaklaşım, prensip olarak, retina ve camsı katılımı önler ve geri tepme göz çıkar. Pigmentli Rodents, cerrah başlangıçta sklera penetrasyonu gözlemleyebilirsiniz, ancak Pigmentli koroid içine geçiş sonra iğne sonunda artık görünmez. Olmadan doğrudan gözlem, retina ihlal yaygındır ve retina diseksiyon ve hücre ve/veya kan teslim Vitre içine neden olabilir. Ayrıca, göz yüzeyi kavisli çünkü hangi iğne açılardan ve derinliklerden trans-scleral enjeksiyonu için en etkili olduğunu bilmek çok zor.

Görüntülenmeyecektir bu makalede, biz bir trans-scleral subretinal enjeksiyon yöntemi ile optik Koherens ayrıntılı bir inceleme enjeksiyon yeri, sağlayan tomografi (OCT), ameliyat sonrası değerlendirme kullanımı haberdar tanıtmak. Bizim trans-scleral enjeksiyon tekniği tanımlanmış yerlere, açılardan ve derinliklerden enjeksiyon iğneler çok düşük cerrahi travma ve yüksek güvenilirlik üretmek için kullanır. Burada, özellikle hRPESC-RPE hücrelerinin enjeksiyon RCS sıçan, önceden klinik manken insan AMD subretinal boşluğa göstermektedir. Bu enjeksiyon yöntemi ile biz başarılı bir şekilde ve sürekli olarak hRPESC-RPE hücrelerinin RCS sıçan gözleri çok yüksek başarı oranı ile subretinal boşluğa teslim. Enjeksiyon hücrelerinin daha önce RCS photoreceptors korunması en az 2 ay sonra enjeksiyon¹³sonuç bulundu. Bu yordam diseksiyon mikroskop altında gerçekleştirilir ve öğrenmesi kolay. İki kişi (bir cerrah ve asistan) enjeksiyon gerçekleştirmesini gerektirir ve her hayvan için enjeksiyon zamanı ortalama 5 dakikadan daha az. Tanımlanmış açılardan ve derinliklerden enjeksiyon iğneler için OCT başarılı subretinal enjeksiyon ulaşmak kullanılamaz nerede laboratuarlar için mümkün kılar. Bu son derece tekrarlanabilir subretinal erişim sağlar ve sadece hücre transplantasyonu için ama aynı zamanda uyuşturucu teslim ve gen tedavileri için kullanılabilir.

Protocol

Tüm yordamları hayvanları içeren kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC), State University of New York Albany adlı tarafından onaylanmıştır.

1. ön enjeksiyon hazırlık

1. HRPESC-RPE hücre süspansiyon hazırlanması
   Not: Aşağıdaki adımların tümünü steril doku kültürü mahallede gerçekleştirilen ve temel steril tekniği ile aşinalık gereklidir.
   1. Birincil hRPE hücreleri izole insan donör gözleri 50-90 yıl ve kültür hücreleri 24-şey tabak¹²yaşında. Hücreleri geçiş 1, cryopreserve, gerektiği gibi tezcan ve kültür 2 (P2) hücreleri için 4-5 hafta (şekil 1A) enjeksiyon için geçiş.
   2. Kültür orta¹² kaldır ve yavaşça durulama wells 500 µL ile iki kez 1 X Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz kalsiyum ve magnezyum olmadan önceden ısınmış (1 x DPBS-CMF) 1 ekleyerek X DPBS-CMF 1.000 µL pipet kullanarak ve bir vakum kullanarak kaldırma kuyu içine.
   3. 300 µL tripsin/Dnaz her şey için ekleyin. HRPESC-RPE hücrelerinde tripsin/Dnaz (4 kU Dnaz başına 1 mL % 0.25 tripsin-EDTA) 37 ° C'de hücreler ayırmak için 4 dk için kuluçkaya.
   4. Onlar yuvarlak olmadığını görmek için mikroskop altında hücreleri denetleyin. Eğer onlar henüz kadar yuvarlak değil tripsin/Dnaz bir ek 2 min için hücrelerde kuluçkaya devam'i tıklatın.
   5. Sonra hücreleri yuvarlanır, 1.000 µL pipet kuyu müstakil hücrelerden triturate ve Önceden ısıtılmış kültür tripsin/Dnaz devre dışı bırakabilirsiniz için orta, eşit hacmi ile 15 mL konik tüp içine müstakil hücreleri içeren tripsin/Dnaz aktarmak için kullanabilirsiniz.
   6. Wells Önceden ısıtılmış 1 ile durulayın X DPBS-CMF yavaşça yukarı ve aşağı, özellikle de; nesnelerin çevresinde pipetting tarafından daha sonra bu hücreler için önceki konik tüp ekleyin.
   7. 286 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de konik tüp santrifüj kapasitesi.
   8. Süpernatant çıkarın ve 1 mL kültür orta hücrelerle resuspend.
   9. Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
   10. 286 x g 4 ° C'de hücreler cips için 5 min için de santrifüj kapasitesi.
   11. Süpernatant kaldırmak ve hücre içinde steril dengeli tuz çözüm ((1 µL birimindeki 50.000 hücreleri subretinal enjeksiyon sırasında teslim etmek) BSS) 50. 000 hücre/µL adlı resuspend.
   12. Son hücre süspansiyon (CS) bir 1.7-mL microcentrifuge tüp ve tutmak bir buz-su karışımı içine enjeksiyon kullanım kadar transfer.
2. Hücre enjektör hazırlanması
   1. Steril bir 33'lik eğimli iğne iğne şırınga ve sıkıca enjektör montajı vida yerleştirin.
   2. Enjektörü % 100 etanol ile 5 - 6 kez yıkayın.
   3. Enjektörü % 70 etanol ile 5 - 6 kez yıkayın.
   4. Enjektör BSS ile 5 - 6 kez yıkayın.
   5. Enjektör iğne 600 µm (şekil 1B) diseksiyon mikroskop altında iğne ucu uzak bir konumda steril siyah marker kalemle işaretlemek.
   6. Enjektör micromanipulator enjeksiyon için yerleştirin.

2. subretinal enjeksiyon

1. Cerrahi alan ve hayvan hazırlık
   1. 4-5 hafta eski RCS ispiyoncu (60-100 g) tartmak ve isoflurane buharı teslim sistemi kullanarak anestezi.
      Not: Anestezi tutmak isoflurane akış hızı % 5 ikna etmek için. Anestezi derinliği pençeleri basarak onaylayın ve sonra akış oranını azaltmak için anestezi bakım için % 2-3 ameliyat sırasında.
   2. Sahne Alanı'ndaki bir steril cerrahi alanını ayarlamak diseksiyon mikroskop altında bir Isıtma yastığı ile steril ameliyat örtüsü yerleştirin.
   3. Fareyi cerrahi alan transfer ve anestezi korumak için isoflurane sisteme bağlı bir burun konisi fare yer.
   4. Gazlı bez ile sıçan vücudunu örtecek. Sıçan ayak tam anestezi onaylamak için çimdik.
2. Mikroskop altında Trans-scleral subretinal enjeksiyon
   1. Bir damla göz kayganlaßtırıcı sıçan unoperated göz kulak uygulama.
   2. Enjeksiyon, onun kafasına doğru cerrah'ın sağ kolu ve cerrah doğru sırt için tavan karşı karşıya onun sol gözü ile sağ yan üzerine fareyi getirin.
   3. Küçük makasla gözünü kapat herhangi bir bıyık kırpın.
   4. Göz yıkama sol gözü geçici tarafındaki küçük bir miktar damla ve burun kenarındaki aşırı göz durulama için pamuklu aplikatör ile toplamak.
   5. Öğrenci %1 tropicamide ve % 2.5 phenylephrine (taze % 10 phenylephrine yapılan ameliyat günü steril % 0,9 salin sulandrarak) ile her bir damlası uygulayarak bir sonrası enjeksiyon OCT sınavı için genişletmek.
   6. 4 - 6 kez göz çevresindeki deri yavaşça çekin göz biraz proptosed daha kolay erişim için bölgeler için limbus arka olacağı göz kapağı açmak için.
   7. Bir damla göz yıkama uygulamak ve gözün nemli tutmak.
   8. Yavaşça CS (1.1.12 adımda hazırlanan) triturate ve enjektör 1.2 µL CS ile yükleyin. Ekstra 0.2 µL enjeksiyon geri tepme için telafi etmek için kullanılır.
      Not: Hakkında bizim ölçümleri dayalı 5.000-8.000 hücreleri hücre kaybı yaklaşık % 10-16 eşittir 50.000 hücre/µL enjeksiyonu ile geri tepme içinde kaybolur ve bu hücre kaybı telafi etmek için fazladan 0.2 µL CS enjekte ettiler.
   9. CS ile bir micromanipulator dolu enjektör yerleştirin (veya tutmak bir yardımcınız olabilir) dikey RPE hücreleri kolayca süspansiyon lavabo eğilimindedir.
   10. %0,5 proparacaine (yerel topikal anestezi) bir damla göz kulak uygulamak ve aşırı bir pamuklu aplikatör ile kaldırmak.
       Not: Bu adım Korneal refleks bastırmak ve göz sonraki adımları sırasında yanıp sönmesini önlemek.
   11. Forseps limbus için posterior konjonktiva kavrama göz nasally döndürmek ve bir "çadır" to make konjonktiva kaldırmak için kullanın.
   12. Konjonktiva içinde küçük bir açılış yapmak ve alttaki sklera maruz "çadır" üst kesilmiş makas kullanın.
   13. Forseps limbus yanındaki kalan konjonktiva kenar boşluğunu kenarına kavrama ve masa üstü (şekil 1 c) göre yaklaşık 30 derece açılı gözbebeği eksendir göz nasally döndürme için kullanın. Devam eden konjonktiva marjı sürükleyici iğne ekleme sırasında karşı bir güç sağlamak ve en uygun açılı göz korumak için gereklidir.
   14. Hücre enjeksiyon için bir pilot delik yapmak, 1,200-1,500 µm yukarı dönük olacak şekilde ipucu açılmasıyla limbus posterior, steril eğimli 31'lik insülin iğne sonuna yerleştirin.
   15. Böylece 10-15 derecenin üzerinde sklera (bir hayali uçak için amaçlanan enjeksiyon yerinde teğet) insülin iğne açısını ayarlayın. Yavaş yavaş sklera-koroid tesisin yaklaşık 500 µm iğne derinliği için nüfuz. Pigmentli köstebeğiyle iğne sonuna 'Pigmentli koroid altında kaybolur'. Burada kullanılan insülin iğne marka için iğne ucu konik 500 µm mesafedir.
   16. Dikkatli bir şekilde (çok küçük efüzyonu kan görülebilir) insülin iğne geri alıyorum.
   17. Eğer aşırı kanama kaydetti, bir göz mızrak delik temizlemek için gerekirse uygulanabilir. Bir gemi mızrak uygulama gösterir sonra devam eden kanama zarar görmüş olabilir.
   18. RPE hücre dolu enjektör iğne pilot delik aşağı ve sklera, yerel yüzey göre yaklaşık 10-15 derecelik bir açıyla bakacak şekilde açılması ile rehberlik.
   19. Yavaşça enjektör iğne subretinal alanına erişmeye yaklaşık 500 µm derinliğe pilot deliğe yerleştirin. Orada-meli var olmak a 100 µm sınır siyah kalem işareti kenarı iğne Pigmentli koroid tarafından (şekil 1 c ve 1 D) yöneticiliğini noktası arasındaki hakkında.
   20. Yavaşça uygun cilt hücrelerinin (yaklaşık 1.2 µL) enjekte pistonu enjektör şırınganın bunalıma girmek için yardımcı'yı sor. Asistan olarak karşı bir güç pistonu üzerinde presler sağlamak hazır olun.
       Not: Önceki sahte uygulama ile yardımcı cerrah ve Yardımcısı ile bu adım gerekli deneyimi sağlar.
   21. Görsel olarak kalem üzerinde odaklanan sırasında kenar işaretlemek, enjektör yerde 25-30 s için basılı tutun ve sonra yavaş yavaş enjektör geri çek. Geri tepme az miktarda yaygın olarak görülmektedir.
       Not: Hiçbir geri tepme gözlem yapılırsa bir intravitreal enjeksiyon olabilir. Geri tepme mühür veya altında sklera doldurma hücreleri aracılığıyla görürseniz, enjeksiyon çok sığ.
   22. Hücre sızma steril göz yıkama ile enjeksiyon sitesinden 3 kez durulama ve aşırı bir pamuklu aplikatör ile toplamak.
   23. Bir damla göz kayganlaßtırıcı çalışan göz kulak uygulama ve fare transplante hücrelerin konumunu ve subretinal bleb boyutunu incelemek için OCT istasyona aktarın.

3. sonrası enjeksiyon tedavisi

1. Ateş düşürücü ve ağrı kesici tedavi
   1. Buprenorfin 0.1 mg/kg vücut ağırlığı subkutan ağrıyı azaltmak için serum fizyolojik içinde adlı enjekte.
   2. Deksametazon 1.6 mg/kg vücut ağırlığı serum fizyolojik içinde iltihap denetimi için mayi enjeksiyonla (IP) enjekte et.
2. Hayvan Kurtarma
   1. Fare kurtarma kafes vücut ısısını korumak için a ısı lamba altında dönün.
   2. Kanaması belirtileri için işletilen göz gözlemlemek.
   3. Anesteziden gelir sağlamak için fareyi gözlemlemek.
   4. Kurtarılan hayvan için taze bir kafes dönmek ve kafes bir ameliyat kartı ile bayrak ve günlük sıkıntı, oküler kanama veya kornea opaklıklar belirtisi izlemek. Endişeleri varsa veteriner hemen bildir.

Results

Bu makalede açıklanan yöntemi kullanarak, biz sürekli olarak hRPESC-RPE hücrelerinin RCS fareler subretinal uzaya tam konumunu, açı ve enjektör iğne dokusuna (şekil 1B-D ekleme derinliği kontrol ederek teslim ). Hemen aşağıdaki nakli, OCT sınava enjeksiyon yeri ve Transplante hücreleri tarafından oluşturulan subretinal bleb gözlemlemek için gerçekleştirildi. Ameliyat sonrası OCT değerlendirme enjeksiyonları ve retina hasar ya da kanama için izleme kalites...

Discussion

Bu makalede tasvir subretinal enjeksiyon tekniği nerede enjektör iğne sinirsel retina zarar veya vitreus kavite rahatsız olmadan göz duvar dış katmanlarını (sklera-koroid-RPE kompleksi) nüfuz trans-scleral yolu üzerinden gerçekleştirilir. Bir alternatif trans-vitreal yaklaşım objektif hasar kemirgenler objektif kaplayan vitreus kavite çoğunluğu bu yana katarakt için önde gelen bir potansiyel riski vardır. Bu yönteme göre bizim teknik daha az riskli ve enjektör iğne subretinal uzay ulaşmak için tüm Vitrifiye boşluğu gitme...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
% 0.25 Tripsin-EDTA (1x)	Yaşam Teknolojileri	25200-072
DNAse I	Sigma	DN-25
1xDulbecco' s Kalsiyum içermeyen Fosfat Tamponlu Salin & Magnezyum (1xDPBS-CMF)	Corning Cellgro	431219
Steril Dengeli Tuz Çözeltisi (BSS)	Alcon	00065079550
Steril göz yıkama	Moore Medical	75519
Steril %0,9 tuzlu su	Hospira	488810
Proparakain Hidroklorür Oftalmik Çözelti (%0,5)	Akorn	17478026312
Tropicamid Oftalmik Solüsyon, USP (% 1)	Bausch & Lomb	24208058559
Fenileferin Oftalmik Solüsyon, USP (%10) stok	Bausch & Lomb	42702010305	Bu,% 2.5 Fenileferin
Buprenex	Patterson	433502
Deksametazon	APP İlaç	63323051610
% 100 Etanol	Thermo Scientific	615090040
% 70 etanol	Ricca Chemical Company	2546.70-5
Steril GenTeal Kayganlaştırıcı Göz Jeli	Novartis 78042947
Steril Systane Ultra Kayganlaştırıcı Göz Damlası	Alcon	00065143105
hRPESC-RPE hücreleri	Ticari olarak		Hücre izolasyonu ve bakımı için lütfen "Referans #12"ye bakın.
24 oyuklu plakalar	Corning	3526
Konik tüpler (15 ml)	Sarstedt	62554002
O-ringli mikrosantrifüj kapağı	LPS inc	L233126
Kapaksız Mikrosantrifüj tüpleri (1.7 ml)	LPS inc	L233041
Santrifüj	Eppendorf	5804R
Steril alkollü mendil	McKesson	58-204
Steril pamuk uçlu aplikatörler	McKesson	24-106-2S
Steril Weck-Cel mızraklar	Beaver-Visitec International
Steril cerrahi örtüler	McKesson	25-515
Gazlı Bez	McKesson	16-4242
Nanofil şırınga (10 ul)	Dünya Hassas Aletler	Nanofil
Nanofil eğimli 33 gauge iğne	Dünya Hassas Aletler	NF33BV-2
İnsülin şırınga iğneleri 31 gauge	Becton Dickinson	328418
Sıçan dişli forseps	Dünya Hassas Aletler	555041FT
Vannas Mikro Diseksiyon Yaylı Makas	Roboz	RS-5602
Sirkülasyon suyu T pompası	Stryker	TP700
Isıtma yastığı	Kent Scientific	TPZ-814
Hayvan anestezi sistemi	Dünya Hassas Aletler	EZ-7000
Terazi	Ohaus	PA1502
Stereo mikroskop	Zeiss	Stemi 2000
Mikroskop ışık kaynağı	Schott	ACE serisi
Bioptigen Envisu Spektral Alan Oftalmik Görüntüleme Sistemi	Bioptigen	R2210
Steril siyah işaretleyici kalem	Viscot Industries	1416S-100
Minyatür ölçüm ölçeği	Ted Pella Inc	13623
Kızılötesi Güneşlenme Spot Lambası	EXO-TERRA	PT2144	Bu, ameliyat sonrası iyileşme aşamasında hayvanlar için bir ısıtma lambası olarak kullanılır.