Yöntem makalesi

Kıkırdak Yenileme için 3D Manyetik Kök Hücre Toplama ve Biyoreaktör Olgunlaşma

DOI:

10.3791/55221

⸱

27 Nisan 2017

 ,  , 
1Laboratoire Matière et Systèmes Complexes (MSC), UMR 7057 CNRS and University Paris Diderot

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kök hücrelerden kondrogenezis kültür koşulları ince ayar gerektirir. Burada, hücreleri yoğunlaştırmak için bir manyetik yaklaşım sunmak, önemli bir adım kondorjenez başlatmak için. Buna ek olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma hücresel yapıların mekanik uyarma uygulanır ve kıkırdak hücre dışı matris üretimini artırdığını göstermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kıkırdak mühendislik, doğal dokusuna benzer bir in vitro fonksiyonel implant oluşturmada zorluklar nedeniyle bir sorun olmaya devam etmektedir. Son zamanlarda otolog değiştirmeler geliştirilmesi için araştırdı bir yaklaşım kondrositlere kök hücrelerin farklılaşmasını içerir. Bu kondorjenez gereklidir kök hücre sıkıştırılması derecesi başlatmak için; Bu yüzden, hücre çekicilerin olarak minyatür bir manyetik alan kaynakları kullanılarak, kalın yapı iskeleleri ve iskele içermeyen içinde hem de manyetik olarak yoğunlaştırma hücrelerin uygulanabileceğini göstermiştir. Bu durum, manyetik yaklaşım, aynı zamanda, toplam füzyon kılavuz ve skafold içermeyen, organize oluşturmak için kullanılan, üç boyutlu (3D) boyut olarak birkaç milimetre dokular. gelişmiş bir boyuta sahip ek olarak, manyetik tahrikli füzyonuyla oluşturulan doku kolajen II ekspresyonunda önemli bir artış mevcuttur, ve benzer bir gelişme agrekan ifadesi için gözlemlendi. doğal kıkırdak kuvvetleri t tabi tutuldu olarakşapka onun 3D yapısını etkilemiş, dinamik olgunlaşma da yapıldı. mekanik uyaran sağlayan bir biyo-reaktör, 21 günlük bir süre boyunca kültüre manyetik ekildi iskeleleri kullanılmıştır. Biyoreaktör olgunlaşma ölçüde cellularized iskele içine kondrojenezi geliştirilmiş; Bu koşullar altında elde edilen hücre dışı matris, kolajen II ve agrekan zengin oldu. Bu çalışma, geliştirilmiş kondrojenik farklılaşması, her iki iskele içermeyen ve polisakarid iskeleleri için bir biyo-reaktör içinde etiketlenmiş kök hücrelerin manyetik yoğunlaştırılması ve dinamik olgunlaşma yenilikçi potansiyel özetlenmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik nanopartiküller zaten manyetik rezonans görüntüleme (MRI) için kontrast ajanları olarak klinikte kullanılmaktadır ve bunların tedavi edici uygulamalar genişleyen tutun. Örneğin, son zamanlarda etiketli hücreler implantasyonu, 1, 2, 3 ve belirlenen bir alanda bir dış manyetik alan kullanılarak in vivo olarak manipüle edilebilir ve yönlendirilebilir ve / veya muhafaza gösterilmiştir. Rejeneratif tıpta, vasküler dokuda 5, 6, 7, kemik 8 ve kıkırdak 9 içeren in vitro 4 organize dokular, mühendislikten geçirilmesi için de kullanılabilir.

Eklem kıkırdağı zarar meydana geldiğinde çok sınırlı bir hücre dışı matris bileşenlerinin tamiratlar, avasküler bir ortamda batırılır. Bu nedenle, Araştırma, Forh anda anzasının bulunduğu yere implante edilebilir hyalin kıkırdak değiştirmeleri mühendisliği odaklanmıştır. Diğer kondrosit 12, 13 içine ayırt etmek mezenkimal kök hücreler (MSC) kapasitesini vurgulamak sırasında bir otolog değiştirme üretmek için, bir araştırma grupları, bir hücre kaynağı 10, 11 otolog kondrositlerin kullanılmasını araştırmaktadır. Onların kemik iliği örneklemesi oldukça basittir ve bunların fenotipi 14 kaybetme riski sağlıklı kondrosit kurbanını gerektirmez burada değinmeyecek önceki çalışmalarda, biz, MSC seçildi.

Kök hücrelerin kondrojenik farklılaşma başlatılması için gerekli erken adım onların yoğunlaşma olduğunu. Hücre kümeleri genellikle santrifüj veya mikrokütle kültürü 15 kullanılarak oluşturulur; Bununla birlikte, bu yoğunlaştırma yöntemleri neither kalın iskeleler de agrega füzyon kontrol etmek için potansiyeli olan, hücre kümeleri oluşturmak için potansiyel göstermektedir. Bu makalede, MSC manyetik etiketleme ve manyetik cazibe kullanarak kök hücrelerin yoğuşmalı için yenilikçi bir yaklaşım açıklar. Bu teknik, bir milimetre çaplı kıkırdak doku 9 elde etmek üzere bir diğeri ile agrega füzyon yoluyla iskele-3D yapıları oluşturmak üzere kanıtlanmıştır. kalın ve büyük yapı iskeleleri manyetik tohumlama da işlenmiş doku boyutunu artırmak implantasyon için daha kolay bir şekilde faydalı olan bir şekil tasarımı ve kıkırdak tamir klinik uygulamalar için potansiyel çeşitlendirilmesi olasılığını sağlamıştır. Burada, doğal polisakaritler, pullulan ve dekstran oluşan gözenekli yapı iskeleleri içine MSC manyetik tohumlama için ayrıntılarıyla protokolü, iskeleler, daha önce kök hücreleri 16, 17 sınırlandırmak için kullanılmaktadır. Kondrojenik farklılaşma finall olduy hücrelerin yüksek yoğunluğa sahip tohumlanmış iskelesinin matris çekirdek içine sürekli besin ve gaz yayılmasını sağlamak için bir biyo-reaktörde gerçekleştirilmiştir. hücrelere besin, kondrojenik büyüme faktörleri ve gaz sağlamanın yanı sıra, biyoreaktör mekanik stimülasyonu sundu. Genel olarak, bir biyo-reaktör içinde dinamik olgunlaşma ile birlikte kök hücreleri sınırlandırmak için kullanılan manyetik teknolojisi, belirgin kondrojenik farklılaşma artırabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Manyetik Cihazların 1. İnşaat

Not: Hücre ekimi için kullanılan cihazlar, uygulamaya bağlı olarak değişir (Şekil 1). Manyetik uçları (çapı 750 mm), çok ince olmalıdır, böylece agrega oluşturmak için, hücrelerin sayısı, 2.5 x 10 5 / agrega ile sınırlıdır. 1.8 cm 2/7 mm kalınlığında iskeleleri tohum için, mıknatısların daha büyük (Çapı 3 mm) olması gerekir ve skafold gözeneklerinin içinden hücre göçünü sağlayacaktır.

  1. Agregat oluşumu için mikro-mıknatıs olan bir cihaz yapımı (Şekil 1A)
    1. alüminyum plakalar içinden bir 0.8 mm matkap ile mikro-delikleri (3 cm çapında ve 6 mm kalınlığında) konur.
    2. plakanın her deliğe, bir manyetik uç (çapı 750 mm) yerleştirin.
    3. doygunluk manyetizasyonu sağlayan kalıcı bir neodim mıknatıs, üzerinde bu disketi yerleştirin.
  2. iskele tohumlama için bir cihazın İnşaat ( Şekil 1 B)
    1. 2.4 cm2 kareler halinde sert polistiren kesin.
    2. 1.6 cm2 'lik bir yüzey alanı üzerinde eşit mesafede 9, küçük mıknatıslar (çap 3 mm uzunluğunda ve 6 mm) takın.
    3. Kalıcı neodim mıknatıs üzerinde bu cihazı yerleştirin.

2. Kök Hücre Etiketleme

NOT: 30 dakika (5 ± 0.4 pg demir / hücre) tohum için 0.2 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir Kök hücreleri, 30 dakika boyunca (2.6 ± 0.2 pg demir / hücre) agregatlar oluşturması için 0.1 mM manyetik nano partiküller ile etiketlenmiştir iskeleleri. Bu nanoparçacık konsantrasyonları ve inkübasyon süreleri, daha önce kullanılmış, MSC ve diğer hücreler 18, 19 için yayınlanan ve nanopartiküller ne hücre canlılığı veya MSC farklılaşma kapasitesi etkilenmiş olduğu tespit edilmiştir edilmiştir. kök hücre ile bu buluşa katılan demir kütlesi tek ce ile ölçüldüII magnetophoresis 19, 20.

  1. Civarındaki kadar 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde tam mezenkimal kök hücre büyüme ortamı (MSCGM) Kültür mezenkimal kök hücreler (MSC) (~% 90) birbirine kaynaşma seviyesine kadar.
  2. Glutaminsiz Roswell Park Memorial Institute (Kan numuneleri) modifiye edilmiş serumsuz McCoy'un 5A ortamında ve 5 ihtiva eden: 0.1 ya da 0.2 mM maghemit sitrat-kaplı demir oksit (8 nm çapında ana γFe 2 O 3) karıştırılması ile, manyetik işaretleme çözeltisi hazırlayın mM sodyum sitrat.
  3. , Orta atın glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı ile hücrelerin durulama ve 150 cm2'lik kültür şişesi, tüm hücreleri karşılamak için gerekli olan minimum hacim başına demir oksit nanopartiküllerinin çözeltisi 10 ml.
  4. 37 ° C'de 30 dakika karıştırıldı ve% 5 CO2 inkübe edin ve daha sonra nanoparçacık solüsyonu atın. nan içselleştirme glutamin içermeyen serumsuz RPMI ortamı 5 dakika boyunca durulamaoparticles hala plazma membranına bağlı.
  5. RPMI ortamı atılır ve kap başına tam MSCGM ortamı 25 ml. 37 ° C'de gece boyunca inkübe edilir ve% 5 CO2.

3. Manyetik Hücre Ekme

  1. Taze 50 uM L-askorbik asit 2-fosfat, 0.1 uM deksametazon, 1 mM sodyum piruvat, 0.35 mM L-prolin,% 1 evrensel kültürü eklenerek Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (DMEM), L-glutamin ile, yüksek glukoz kullanılarak kondrojenik ortamı hazırlamak insülin, insan transferrin ve selenik asit (ITS-karışımlar) ve 10 ng / ml, transforme edici büyüme faktörü-beta 3 (TGF-β3) içeren ek.
  2. 5 dakika boyunca 260 x g'de% 0.05 150 cm2'lik kültür şişesi başına tripsin-EDTA ve santrifüj ayrışmış hücreleri 8 mL kullanılarak manyetik hücre ayırın. orta aspire ve yeniden süspansiyon haline hücreleri sayın.
  3. Her iki manyetik cihazların üstünde bir cam tabanlı hücre kültürü Petri kabı (35 mm) yerleştirin.
  4. magnetically agrega başı (yatırılabilir 16 agrega kadar) 2.5 x 10 5 etiketli hücreler ihtiva eden mümkün olan en küçük bir hacmi (en fazla 8 uL) yatırma yavaşça Petri kabı kondrojenik orta 3 mL ekleyin ve agregatlar oluştururlar. Bu sferoidler oluşmasına izin vererek, taşımadan 20-30 dakika süreyle Petri kabı bırakın ve daha sonra 37 ° C'de ve% 5 CO2 inkübatörü içinde, 16 agrega içeren Petri kabı da dahil olmak üzere, komple bir cihaz yerleştirin.
  5. Form kontrolü agrega aynı protokolü takip ve TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla tam orta yerine.
    1. 3D toplam yapı üretmek 8 çiftleri oluştururlar ve füzyon başlatmak için günde 8 temas eden 2 agrega yerleştirin. Gün 11, 4 dördüz oluşturmak üzere 2 çift durumlar birleştirme. Son olarak, nihai bir yapı elde etmek günde 15 4 dördüz kaynaştırmak.
    2. Aynı zamanda, x 10 5 2.5 santrifüjleme ile bir araya toplanırlar 260 ° kök hücreleri etiketli15; ya da TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 1.5 mL, 15 ml tüpler içinde 5 dakika boyunca gr (numune ve kontrol için, sırasıyla).
  6. Tohum iskeleleri manyetik olarak için, bir Petri kutusu içine her kurutuldu iskele yerleştirin. Pullulan / dekstran 21 yapılmış polisakarit gözenekli iskeleleri kullanın. Her bir yapı iskelesi için, TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamın 350 uL 2 x 10 6 etiketli kök hücreleri sulandırmak ve dikkatli bir şekilde bir yapı iskeleti içine hücreleri pipetle.
    1. iskele içinde tam hücre penetrasyonu imkan vermek için 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin ve daha sonra yavaşça veya Petri kabı (sırasıyla numune ya da kontrol için,), TGF-p3 olmadan kondrojenik orta 3 ml.
    2. Iskele gözenekler ve sınırlandırılması yolu ile hücre göçü için izin vermek üzere 2 ila 4 gün boyunca CO, 37 ° C'de, manyetik cihazda cellularized iskele inkübe ve% 5.
  7. Aynı zamanda, özellıklerı tohum 2 x 10 6 Yukarı etiketli kök hücreler aynı yöntemi izleyerek ve pozitif kontroller olarak eşit seri başı iskeleleri elde etmek mıknatıs olmadan inkübe edin.

Kondrositlere 4. Farklılaşma

NOT: 4 günlük kuluçkadan sonra, mıknatıslar kaldırıp kondrojenik olgunlaşmasını ya bir Petri kabı (statik koşullar) veya bir biyoreaktör (dinamik koşullar) içinde devam ediyor. Negatif kontrol numuneleri TGF-p3 olmadan kondrojenik ortamla statik koşullarda olgunlaştırılır.

  1. Statik koşullarda, aynı Petri kabındaki cellularized iskele veya agrega tutun. 21 gün boyunca haftada iki kez kondrojenik orta değiştirin.
  2. Dinamik koşullarda, biyoreaktör hazırlayın.
    1. üreticinin protokolüne uygun olarak uygun uzunlukta silikon tüp kesin.
    2. 500 ml'lik kültür odası, boru, 2-yollu rotatorlar ve kafesler: tüm malzemeleri otoklava.
    3. steril microbio içine biyoreaktör parçaları yerleştirinMantıksal güvenlik istasyonu. Üreticinin talimatlarını takip 2 yönlü rotatörlerde ve kültür odasına boru bağlayın.
    4. Dikkatle steril bir spatula kullanılarak sterilize kafeslerin içine cellularized iskele aktarın. kafes başına 2 iskeleleri yerleştirin. kafesleri hazır olduğunda, daha fazla rotasyon sırasında hareket onları tutmak için kapağın iğne içine yerleştirin. kondrojenik ortam ile kültür odası doldurun ve kafesleri içeren kapak ile kapatın.
  3. kondrojenik ortamla boru doldurmak için ve hava kabarcıklarını yok etmek için peristaltik pompa açın.
  4. Yerleştirin ve biyoreaktör motora doldurulur odasını güvenceye ve kolun ve odanın her iki rotasyonları kontrol eden bilgisayar, açın.
  5. kol ve bölme her iki dakika başına 5 dönüş (rpm) bir dönme hızı uygulanır. cellularized iskelelerinin sürekli beslenmesi için 10 rpm'de bir akış hızında peristaltik pompa ayarlayın.

5. RNA Ekstraksiyonu ve gen ekspresyonu analizi

Not: RNA ekstraksiyonu önce, bir enzimatik solüsyon ile iskeleleri sindirimi.

  1. pululanaz, 100 uL (40 U / mL) ve serum içermeyen DMEM ortamı 850 mL dekstranaz 50 uL (60 mg / ml) eklenerek enzimatik solüsyon 1 mL hazırlayın.
  2. Serum içermeyen DMEM ortamı ile iki kez iskeleleri durulayın orta atmak ve iskele başına enzimatik çözeltisinin 800 uL ekleyin. , hafifçe çalkalanarak 37 ° C'de 15-30 dakika süreyle inkübe edilir.
  3. iskele tamamen çözülür, dikkatli bir şekilde orta aspire, 10 dakika boyunca 300 x g 'de bir 1,5-ml tüp hücreleri ihtiva eden çözelti, santrifüj transferi x 1 steril fosfat-tamponlu tuzlu su (PBS), santrifüj ile iki kez durulama 300 x g'de 10 dakika ve RNA izolasyon çözeltisi içinde hücreler yeniden askıya.
  4. , Agrega RNA çıkarmak RNA izolasyonu çözeltisi içinde sferoidler yerleştirmek için veTamamen RNA ekstraksiyonu yapılmadan önce bir homojenleştirici kullanarak ezmek.
  5. Üreticinin talimatlarına uygun olarak, toplam RNA ekstraksiyonu için bir kit kullanılarak RNA izole edilir.
  6. DNTP karışımı 1 uL (10 mM), 40 U / ml RNaz inhibitör rastgele primerler 250 ng kullanılarak, üreticinin talimatlarına uygun olarak, ters transkriptaz kullanılarak toplam RNA 400 ng tamamlayıcı DNA sentez; reaksiyonun nihai hacmi, 20 uL'dir. Reaksiyonun sonunda, 100 uL nihai hacim elde etmek üzere damıtılmış su 80 uL ekleyin.
  7. kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) için, 10 x seyreltildi cDNA ile, örneğin agrekan (AGC) ve kolajen II'ye (Col II) ilgi konusu genlerin, göreceli ifade miktarını belirlemek için bir floresan madde içeren bir PCR karışımı kullanılır. referans gen ribozomal protein, büyük, P0 (RPLP0) ile gen ekspresyonunun seviyelerini normalize. AACT formülü - 2 ile hesaplamalar gerçekleştirin, AACT = ACt farklı durumun burada - Kontrol koşulu ACt anlamına gelir ve her bir ACt ilgi konusu genin, CT temsil eder - referans gen (RPLP0) arasında CT.
  8. ortalama değerler ortalama (SEM) ± standart hata olarak istatistiksel ölçümleri belirler. n ≥ 2 bağımsız deneylerle analizi gerçekleştirin. santrifüj edilmiş peletler ve manyetik füzyonları (* p <0.05) arasında istatistiki farklılıklarını analiz etmek için, Student t-testi kullanın. Kontrol skafold farklı yapı iskeleleri arasında istatistiksel farklılıkları (* p <0.05) analiz etmek için bir Kruskal-Wallis testi (tek yönlü ANOVA parametrik olmayan) ile önem belirler.

6. Histolojik Analiz

  1. Steril 1 x PBS ile cellularized iskeleleri veya agregaların durulayın, oda sıcaklığında 1 saat için% 10 formalin çözeltisi içinde çözmek ve 1 x PBS ile yıkayın.
  2. , PBS çıkarın optimum kesmeye örnekleri gömmekg sıcaklık bileşiği (OCT), ve sıvı azot içine daldırılmış bir izopentan küveti içinde dondurulur. -20 ° C'de örnek saklayın. agregatlar veya cellularized İskele 12 um 8 mikron cryosections elde etmek için bir kriyostat ile örnekleri kesilir.
  3. tolüen kullanılarak açıklık,% 100 etanol ile dehidre musluk suyu ile durulayın, 2 dakika süre ile% 0.5 toluidin mavisi çözeltisi ile cryosections Leke ve ışık mikroskopi için bir montaj ortamı ile montaj slaydları.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İlk olarak, gruplar ayrı ayrı 2.5 x 10 5 etiketli kök hücreleri (Şekil 2A) biriktirilmesiyle mikro mıknatıslar kullanılarak oluşturulabilir. Bu tek agregalar (girişlerinin boyu yaklaşık olarak 0.8 mm), daha sonra ardışık manyetik indüklenen füzyon daha büyük yapılar sayesinde içine birleştirilebilir. Örneğin, kondrojenik olgunlaşma 8. günde, agrega çiftleri oluşturmak üzere çiftler halinde temas halinde yerleştirilmiştir; quadruplets 2 ikili birleştirme ile 11...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan teknikler manyetik nanopartiküllerin içselleştirilmesi güvenmek çünkü hücrelerin içinde lokalize bir kez Birincisi, bir önemli konu nanopartiküllerin sonucudur. Demir nanopartikullerin potansiyel toksisite veya maruz kalma 19, 22 boyutları, kaplama ve zamana bağlı olarak bozulmuş farklılaşma kapasitesi tetikleyebilir doğrudur. Kapsüllenmiş demir nanopartiküllerin magnetoferritin şeklinde, biyolojik manyetik nano parçacık 24...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar biyoreaktör sağlamada yardımcı olan QuinXell Teknolojileri ve CellD, özellikle Lothar Grannemann Dominique Ghozlan kabul etmek istiyorum. Biz pullulan / dekstran polisakkarit iskeleleri ile bize sağladığı Catherine Le Visage, teşekkür ederim. Bu çalışma, Avrupa Birliği (ERC-2014-ağırlık merkezi projesi Matisse 648779) tarafından ve AgenceNationalede la Recherche (ANR), Fransa (MagStem proje ANR-11 SVSE5) tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Demir oksit (maghemit) nanopartikülleri (γ-Fe2O3)PHENIX - University Paris 6C. Mé tarafından yapılmış ve verilmiştir; nagerOrtalama 8.1 nm çap ve negatif yüzey yükü
Polisakkarit Pullulan/Dekstran iskeleleriLIOAD - University NantesC. Le Visage tarafından yapılmış ve verilmiştir.Alkali koşullarda 75:25 pullulan / dekstran karışımından hazırlanmıştır (10  M NaOH). Gözeneklilik: 185-205  &mikro; m; Kalınlık: 7  Mm; Yüzey alanı: 1.8  cm2.
TisXell Rejenerasyon SistemiQuinXell TechnologiesQX900-002500 mL kültür odacıklı çift eksenli biyoreaktör 
İskeleler için kafes: Histosette II M492 VWR720-0909
Mezenkimal Kök Hücre (MSC)LonzaPT-2501Üç bağımsız parti kullanılmıştır
MSCGM BulletKit ortamıLonzaPT-3001Tam ortam için, sağlanan BulletKit'i (serum, glutamin ve antibiyotik içeren)
Glutamax ILife Technologies31966-021DMEM Sodyum piruvat yok, HEPES yok
RPMI ortamı 1640, Glutamin yokYaşam Teknolojileri31870-025Sodyum piruvat yok, HEPES
yok CaCl2 MgCl olmadan PBS2Life Technologies14190-094
%0,05 Tripsin-EDTA (1x)Yaşam Teknolojileri25300-054
Penisilin (10.000  U/mL) / Streptomisin (10.000  &mikro; g/mL)Yaşam Teknolojileri15140-122
ITS Premiks Evrensel Kültür Takviyesi (20x)Corning354352
Sodyum piruvat çözeltisi 100 mMSigmaS8636
L-Askorbik Asit 2-fosfatSigmaA8960Konsantre çözeltiyi (25 mM) damıtılmış suda doğaçlama olarak hazırlayın
L-ProlineSigmaP5607Damıtılmış suda seyreltilmiş 175 mM stok çözeltisini hazırlayın ve 4  ° C
DeksametazonSigmaD4902Etanol% 100 seyreltilmiş 1 mM stok çözeltisini hazırlayın ve -20 ° C'de saklayın; ° C
TGF-beta 3 proteini 10  &mikro; gInterchim30R-AT028
Tri-sodyum sitratVWR33615.2681  Damıtılmış suda seyreltilmiş M stok çözeltisi ve 4  °
Bacillus acidopullulyticusSigmaP2986'dan
Chaetomium erraticumSigma'dan Dekstranaz D0443
NucleoSpin RNA Ekstraksiyon KitiMacherey-Nagel740955.5
SuperScript II Ters TranskriptazYaşam Teknolojileri18064-014
Rastgele Astar - Heksamer PromegaC1181500 ve mikro; g / mL: Seyreltilmiş 1/2 kullanın ve 1 & mikro koyun; Örnek başına L
: Ribonükleaz inhibitörüPromegaN251140 U/&mikro'daki rekombinant RNA'lar; L: 1 ve mikro koy; Örnek başına L
PCR nükleotid dNTP karışımı (10  her biri mM)Roche10842321
SyBr Green PCR Master MixLife4368708
Step One Plus Gerçek Zamanlı PCR SistemÖmrü Teknolojileri4381792
Formalin çözeltisi %10 nötr tamponluSigmaHT5012
OCT çözeltisiVWR361603E
İzopentanSigmaM32631
Toluidin mavisi OVWR1.15930.0025
Etanol mutlakVWR20821.310
ToluenVWR1.08323.1000
Montaj ortamı PertexHistolab840
RPLP0 qPCREurogentec5'-TGCATCAGTAC
CCCATTCTATCAT-3' için astar;
5'-AAGGTGTAATC
CGTCTCCACAGA-3'qPCR
Eurogenteciçin Aggrecan Primer' için 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5'Kollajen
II Astarı; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5'
ile MSCGM ortamına ekleyin C Pullulanaz Technologies 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; qPCR Eurogentec 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Naumova, A. V., Modo, M., Moore, A., Murry, C. E., Frank, J. A. Clinical imaging in regenerative medicine. Nat Biotechnol. 32 (8), 804-818 (2014).
  2. Edmundson, M., Thanh, N. T., Song, B. Nanoparticles based stem cell tracking in regenerative medicine. Theranostics. 3 (8), 573-582 (2013).
  3. Di Corato, R., et al. High-resolution cellular MRI: gadolinium and iron oxide nanoparticles for in-depth dual-cell imaging of engineered tissue constructs. ACS Nano. 7 (9), 7500-7512 (2013).
  4. Xu, F., et al. Three-dimensional magnetic assembly of microscale hydrogels. Adv Mater. 23 (37), 4254-4260 (2011).
  5. Kito, T., et al. iPS cell sheets created by a novel magnetite tissue engineering method for reparative angiogenesis. Sci Rep. 3, 1418(2013).
  6. Mironov, V., Kasyanov, V., Markwald, R. R. Nanotechnology in vascular tissue engineering: from nanoscaffolding towards rapid vessel biofabrication. Trends Biotechnol. 26 (6), 338-344 (2008).
  7. Mattix, B. M., et al. Janus magnetic cellular spheroids for vascular tissue engineering. Biomaterials. 35 (3), 949-960 (2014).
  8. Henstock, J., El Haj, A. Controlled mechanotransduction in therapeutic MSCs: can remotely controlled magnetic nanoparticles regenerate bones? Regen Med. 10 (4), 377-380 (2015).
  9. Fayol, D., et al. Use of magnetic forces to promote stem cell aggregation during differentiation, and cartilage tissue modeling. Adv Mater. 25 (18), 2611-2616 (2013).
  10. Bartlett, W., et al. Autologous chondrocyte implantation versus matrix-induced autologous chondrocyte implantation for osteochondral defects of the knee: a prospective, randomised study. J Bone Joint Surg Br. 87 (5), 640-645 (2005).
  11. Batty, L., Dance, S., Bajaj, S., Cole, B. J. Autologous chondrocyte implantation: an overview of technique and outcomes. ANZ J Surg. 81, 18-25 (2011).
  12. Song, L., Baksh, D., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cell-based cartilage tissue engineering: cells, scaffold and biology. Cytotherapy. 6 (6), 596-601 (2004).
  13. Boeuf, S., Richter, W. Chondrogenesis of mesenchymal stem cells: role of tissue source and inducing factors. Stem Cell Res Ther. 1 (4), 31(2010).
  14. Kock, L., van Donkelaar, C. C., Ito, K. Tissue engineering of functional articular cartilage: the current status. Cell Tissue Res. 347 (3), 613-627 (2012).
  15. Schon, B. S., et al. Validation of a high-throughput microtissue fabrication process for 3D assembly of tissue engineered cartilage constructs. Cell Tissue Res. , (2012).
  16. Robert, D., et al. Magnetic micro-manipulations to probe the local physical properties of porous scaffolds and to confine stem cells. Biomaterials. 31 (7), 1586-1595 (2010).
  17. Luciani, N., et al. Successful chondrogenesis within scaffolds, using magnetic stem cell confinement and bioreactor maturation. Acta Biomaterialia. 37, 101-110 (2016).
  18. Wilhelm, C., Gazeau, F. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials. 29 (22), 3161-3174 (2008).
  19. Fayol, D., Luciani, N., Lartigue, L., Gazeau, F., Wilhelm, C. Managing magnetic nanoparticle aggregation and cellular uptake: a precondition for efficient stem-cell differentiation and MRI tracking. Adv Healthc Mater. 2 (2), 313-325 (2013).
  20. Wilhelm, C., Gazeau, F., Bacri, J. C. Magnetophoresis and ferromagnetic resonance of magnetically labeled cells. Eur Biophys J. 31 (2), 118-125 (2002).
  21. Autissier, A., Le Visage, C., Pouzet, C., Chaubet, F., Letourneur, D. Fabrication of porous polysaccharide-based scaffolds using a combined freeze-drying/cross-linking process. Acta Biomater. 6 (9), 3640-3648 (2010).
  22. Singh, N., Jenkins, G. J. S., Asadi, R., Doak, S. H. Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews. 1, (2010).
  23. Lee, J. H., Hur, W. Scaffold-free formation of a millimeter-scale multicellular spheroid with an internal cavity from magnetically levitated 3T3 cells that ingested iron oxide-containing microspheres. Biotechnol Bioeng. 111 (5), 1038-1047 (2014).
  24. Mattix, B., et al. Biological magnetic cellular spheroids as building blocks for tissue engineering. Acta Biomaterialia. 10 (2), 623-629 (2014).
  25. Mazuel, F., et al. Massive Intracellular Biodegradation of Iron Oxide Nanoparticles Evidenced Magnetically at Single-Endosome and Tissue Levels. ACS Nano. 10 (8), 7627-7638 (2016).
  26. Kim, J. A., et al. High-throughput generation of spheroids using magnetic nanoparticles for three-dimensional cell culture. Biomaterials. 34 (34), 8555-8563 (2013).
  27. Shimizu, K., Ito, A., Honda, H. Enhanced cell-seeding into 3D porous scaffolds by use of magnetite nanoparticles. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 77 (2), 265-272 (2006).
  28. Sensenig, R., Sapir, Y., MacDonald, C., Cohen, S., Polyak, B. Magnetic nanoparticle-based approaches to locally target therapy and enhance tissue regeneration in vivo. Nanomedicine (Lond). 7 (9), 1425-1442 (2012).
  29. Waldman, S. D., Couto, D. C., Grynpas, M. D., Pilliar, R. M., Kandel, R. A. Multi-axial mechanical stimulation of tissue engineered cartilage: review. Eur Cell Mater. 13, 66-74 (2007).
  30. Takahashi, I., et al. Compressive force promotes sox9, type II collagen and aggrecan and inhibits IL-1beta expression resulting in chondrogenesis in mouse embryonic limb bud mesenchymal cells. J Cell Sci. 111 (14), 2067-2076 (1998).
  31. Campbell, J. J., Lee, D. A., Bader, D. L. Dynamic compressive strain influences chondrogenic gene expression in human mesenchymal stem cells. Biorheology. 43, 455-470 (2006).
  32. Vunjak-Novakovic, G., et al. Bioreactor cultivation conditions modulate the composition and mechanical properties of tissue-engineered cartilage. J Orthop Res. 17 (1), 130-138 (1999).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kondrojenik Diferansiyasyonskelet Yap s z DokularPolisakkarit skelelerManyetik KondansasyonDinamik Olgunla maKollajen II EkspresyonuAgrekan EkspresyonuK k H cre aretleme

İlgili makaleler