Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevsel bir değerlendirilmesi sinir ve kas arasındaki iletişimi ilgili gerekli bilgileri sağlar. Burada biz kapsamlı bir şekilde kullanarak iki farklı kas-sinir hazırlıklar, yani soleus siyatik ve diyafram frenik NMJ ve kas işlevselliğini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevselliği motor nöron ve kas arasındaki iletişimi, yaşlanma ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi Engelli olduğu hastalıklar okurken çok önemli bir rol oynar. Burada iki tür elektriksel stimülasyon birleştirerek NMJ işlevselliği ölçmek için kullanılan bir deneysel protokol tarif: doğrudan kas zarı stimülasyon ve stimülasyon sinir aracılığıyla. Bu iki farklı elektrodlar kas cevaben karşılaştırılması işlev düzeyinde fonksiyonel kas düşüş yol olası değişiklikler NMJ içinde tanımlamak için yardımcı olabilir.
Ex vivo hazırlıkları iyi kontrollü çalışmalar için uygundur. Burada tarif biz kas ve NMJ işlevselliği soleus siyatik sinir hazırlık ve diyafram frenik sinir hazırlık birkaç parametrelerini ölçmek için yoğun bir iletişim kuralı. Protokol yaklaşık 60 dakika sürer ve kesintisiz bir ısmarlama aracılığıyla yapılır seğirme Kinetik özellikleri, sinir ve kas elektrodlar için güç frekanslı ilişki ve iki parametre NMJ işlevselliği için belirli Yani neurotransmission yetmezliği ve intratetanic yorgunluk ölçer yazılım. Bu metodoloji hasar soleus ve diyafram kas-sinir hazırlıkları SOD1G93A transgenik fare, ubiquitously mutant antioksidan enzim süperoksit dismutaz 1 (SOD1) overexpresses ALS deneysel bir model kullanarak bulmak için kullanıldı.
Giriş
Nöromüsküler kavşak (NMJ) kas fiber motor endplate ve motor nöron axon terminal arasında bağlantı oluşturduğu bir kimyasal synapse var. Kas ve sinir arasındaki iletişim, yaşlanma veya amyotrofik lateral skleroz (ALS) gerçekleştiği sırada bozulmuş olduğunda çok önemli bir rol oynamaya NMJ gösterilmiştir. Kas ve sinir bir çift yönlü yol1,2' olarak, NMJ kusurları kas defektleri dan ayrı olarak ölçmek için güçlü olmak onların Fizyopatolojik Interplay yeni görüşler sağlayabilir. Gerçekten de, bu işlevsel değerlendirme morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azaltmak değerlendirmek için yardımcı olabilir.
Kas contractile yanıt sinir stimülasyonu ve onun membran doğrudan uyarılması tarafından uyarılmış aynı kas yanıt elde edildi karşılaştırılması NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm evlenme teklif etti. Gerçekten de, sinyal membran stimülasyon geçer tarafından neurotransmission beri iki contractile yanıt-e doğru tüm farklılıkları NMJ değişikliklere atfedilen. Bu yaklaşım yaygın olarak fareler3,4,5,6,7için önerilen ve ayrıca fare modelleri8tarihinde,9,10,11,12bilgi toplamak için kullanılır.
Burada, tüketim ve soleus siyatik ve diyafram frenik hazırlıkları iki kas-sinir hazırlıklar, yani sınamak için bir yordam ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bir özel kullanarak yazılım, biz tasarlanmış işlevsellik, NMJ ve kas karakterize birkaç parametre ölçümü birleştirir sürekli bir test Protokolü böylece NMJ hasar kapsamlı bir değerlendirme ayrı ayrı bu kas verimli. Özellikle, protokol seğirme gücü, kas Kinetik, kuvvet-frekans eğrisi için doğrudan ve sinir elektrodlar, hem bir ateş ve tetanic sıklık ve intratetanic yorgunluk7neurotransmission başarısızlık13 ölçer.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm hayvan deneyleri, Roma Sapienza Üniversitesi-Histoloji ve Tıbbi Embriyoloji Birimi etik kurulu tarafından onaylanmış ve İtalyan Hayvanları Koruma Yasası'nın güncel versiyonuna uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. Deneysel düzenek
- 1 aktüatör/transduser, 2 stimülatör, 1 in-vitro kas aparatı, 1 preparat doku banyosu, 1 vakumlu elektrot, 1 dijital osiloskop, 1 stereomikroskop, 1 soğuk ışık aydınlatıcısı, 1 veri toplama kartı, 1 konnektör bloğu ve bir kişisel bilgisayardan oluşan deneysel sistemi kurun.
NOT: Burada komut yazılımı LabView ile programlanmış olup stimülasyonların yüksek esneklik, doğruluk ve tekrarlanabilirliğini garanti edecek şekilde tasarlanmıştır. Her stimülasyon için kullanıcı; darbe genişliğini, frekansı, süreyi seçebilir ve stimülasyonun membrana mı yoksa sinir yoluyla mı iletileceğine karar verebilir. Kullanıcı ayrıca her stimülasyon öncesindeki dinlenme süresinin uzunluğunu da seçebilir.
2. Soleus ve diyafram kaslarının NMJ kontraktil özelliklerinin değerlendirilmesi
- Sistemin ısıtılması
- Krebs Ringer tamponunu14 hazırlayın ve montaj düzeneğinin banyosuna ve preparat doku banyosuna yerleştirin. Preparat doku banyosuna, 4 ml silikon ile hazırlanmış 60 mm'lik bir kap yerleştirin.
- Sirkülasyonlu su banyosunu açın ve sıcaklığı soleus kası için 30 °C'ye, diyafram kası için ise 27 °C'ye ayarlayın.
- Her iki banyoya %95 O2 - %5 CO2 karışımının akışını sağlayın.
- Aktüatör/transduseri ve iki puls stimülatörünü açın; akım değerlerini membran stimülasyonu için 300 mA'ya ve sinir stimülasyonu için 5 mA'ya ayarlayın.
NOT: 300 mA akım değerinin, çözeltiye D-tubokurarin eklendiğinde sinir dallarında herhangi bir anlamlı kontraksiyon oluşturmadığı daha önce gösterilmiştir15. 5 mA akım değeri, çözelti aracılığıyla indüklenen membran stimülasyonu ile bir çakışma yaratmadan, kası sinir üzerinden stimüle etmek için gereken akım miktarına karşılık gelir. Vakum elektrodu ile kas arasındaki mesafe sinir uzunluğuna bağlı olduğundan, bu akım değeri her deneyden önce, aşağıda açıklandığı şekilde dikkatle ayarlanmalıdır.
- Soleus ve diyafram diseksiyonu
- Acıyı en aza indirmek için fareyi servikal çıkık yöntemiyle sakrifiye edin ve test edilecek kasları derhal şu şekilde çıkarın.
- Soleus-siyatik preparasyonu, diseksiyonu ve kurulumu
- Fare bacağına %70 etanol püskürtün ve bacağı örten deriyi çıkarın. Makasla bacağın üst kısmında bir insizyon yapın ve ardından deriyi sıkıca çekin. Aşil tendonunu tibiadan ayırın ve ardından Aşil tendonunu makasla kesin.
- Tendonu bir pensle sıkıca tutun ve gastroknemius kasını soleus ile birlikte nazikçe çekin. Soleus'un proksimal tendonu açığa çıktığında, Aşil tendonunu tutmaya devam ederek tüm baldırı makasla kesin. Doku örneğini derhal preparat doku banyosuna yerleştirin.
- Preparat banyosunu stereomikroskobun altına yerleştirin ve baldırı 0,20 mm çapında paslanmaz çelik pinler kullanarak silikon kaba sabitleyin. Bir pens kullanarak soleus'un proksimal tendonunu tutun ve siyatik innervasyonu açığa çıkarmak için nazikçe çekin.
- İnnervasyon açığa çıktığında (Şekil 1), sinirin yaklaşık 5 mm'lik kısmını açığa çıkarmak için çevre dokuları dikkatlice temizleyin. Siniri kesmek için ince uçlu bir makas kullanın. Soleus'u proksimal tendondan bir pensle sıkıca tutarken, tekrar çekin ve Aşil tendonunu makasla keserek çıkarın.
- Aktüatör/transduserin kolundaki delikten bir naylon tel geçirin. Telin ucunda bir kement oluşturun ve kas, montaj düzeneğinin banyosuna ulaşana kadar teli geri çekmeden önce Aşil tendonunu kavrayın. Proksimal tendonu sabit klempe sabitleyin ve naylon teli kolun etrafına bağlayın. Kasın çözeltide dengelenmesini bekleyin.
- Başlangıç optimal uzunluğunu (L0) belirleyin.
- Öncelikle, kası 10 mN ön yükleme yapacak şekilde gerin (bu değer, deneyimlere dayanarak maksimum seğirme kuvvetini garanti eder). Ardından, ön yüklemeyi değiştirmek için kası nazikçe gerin ve bir dizi tekil puls ile stimüle edin. Maksimum seğirme kuvveti ölçüldüğünde optimal uzunluğa ulaşılmış olur.
- Diyafram-frenik preparasyonu, diseksiyonu ve kurulumu
- Fare derisine %70 etanol püskürtün. Sternum üzerinden makasla bir insizyon yaparak ve deriyi sıkıca çekerek diyafram kasını örten deriyi çıkarın.
- Makasla, sternumun altından abdomeni yatay olarak kesin; bağırsakları ve organları bir pens yardımıyla nazikçe çıkarın. Omurgayı kesmek için kalın uçlu bir makas kullanın.
- Kaburgaları sternumun yaklaşık 1 cm üzerinden kesin ve yatay olarak devam edin. Dış organları bir pensle nazikçe çıkarın ve diyaframı içeren dairesel bir kaburga halkası elde etmek için omurgayı kesin.
- Preparasyonu Krebs Ringer tamponu içeren bir kapta yıkayın ve ardından üst tarafı yukarı, sternum tarafı öne bakacak şekilde preparat doku banyosunun içindeki silikon kaba yerleştirin.
- Stereomikroskop kullanarak akciğerleri ve kalan organları dikkatlice çıkarın; frenik sinir sağ tarafta görülecektir (Şekil 2A).
- Diyafram boyunca yaklaşık 2 mm'lik bir halka bırakacak şekilde kaburgaları düzeltin.
- Pens kullanarak, frenik sinir innervasyonuna karşılık gelen noktada diyafram merkezi tendonuna bir adet 0,20 mm çapında paslanmaz çelik pin, ilgili diyafram şeridini belirlemek için aynı eksen üzerindeki kaburgalara ise başka bir pin sabitleyin.
- Diyaframı düzlemek için seçilen şeridin her iki yanındaki merkezi tendona iki ek pin ve kaburgalara iki pin daha sabitleyin. Gerekirse, frenik siniri çevre bağ dokusundan pens yardımıyla temizleyin.
- Kavisli bir bıçak kullanarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi bir tendon-kas-kaburga şeridi belirlemek için diyaframı innervasyonun her iki yanından kesin.
- Aktüatör/transduserin kolundaki delikten bir naylon tel geçirin. Telin ucunda bir kement oluşturun ve kas, montaj düzeneğinin banyosuna ulaşana kadar teli geri çekmeden önce tendonu kavrayın.
- Kaburgaları sabit klempe sabitleyin ve naylon teli kolun etrafına bağlayın.
- Kasın çözeltide dengelenmesini bekleyin ve başlangıç optimal uzunluğunu (L0) belirleyin.
- Kası 5 mN ön yükleme yapacak şekilde gerin. Ön yüklemeyi değiştirmek için kası nazikçe gerin ve bir dizi tekil puls ile stimüle edin. Maksimum seğirme kuvveti ölçüldüğünde optimal uzunluğa ulaşılmış olur.
Şekil 1 - Soleus-siyatik sinir preparasyonu. Fonksiyonel testler için gerçekleştirilen cerrahi operasyon sırasında soleus-siyatik sinir. Siyatik sinir bir pens yardımıyla açığa çıkarılmıştır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2 - Diyafram-frenik sinir preparatı. Görsel, diyafram-frenik sinir preparatı eksizyonunun bir aşamasını (A) ve fonksiyonel testler için monte edilecek şeridi (B) göstermektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- NMJ özelliklerinin kas kontraktilitesinden ayrı olarak ölçülmesi
- Sinir üzerinden stimülasyon için en uygun akım yoğunluğunu ayarlayın ve vakum elektrodu aracılığıyla iletilen akım darbelerinin, banyodaki akım yayılımı nedeniyle kas kontraksiyonuna yol açmadığını doğrulayın.
- Vakum elektrodunu kasın yakınına yerleştirin ve siniri içeri çekin. Akım yoğunluğunu yavaşça artırırken (5 mA'den başlayarak), kası bir dizi tekli darbe ile stimüle edin. Optimal akım değeri, seğirme kuvvetinin maksimum olduğu noktada belirlenir.
- Siniri elektrodun dışına itin ve birkaç tekli darbe uygulayın. Çözelti vasıtasıyla gerçekleşen membran stimülasyonu ile örtüşme nedeniyle kasın kasılmadığından emin olun. Siniri tekrar içeri çekin.
- Programı başlatın ve istenen test protokolünü çalıştırmak için giriş dosyasını seçin.
NOT: Giriş dosyası, tüm protokolü çalıştırmak için gerekli olan tüm stimülasyon parametrelerini içerir. İki kas için de aynı protokol yapısı kullanılsa da, stimülasyon parametreleri protokolün soleus veya diyafram kaslarına hitap etmesine bağlı olarak farklılık gösterir.- Soleus-siyatik sinir stimülasyonu (bkz. Tablo 1)
- Tüm elektriksel stimülasyonlar için şu darbe genişliklerini kullanın: siyatik sinir stimülasyonu için 1.4 ms ve doğrudan soleus stimülasyonu için 0.1 ms. Tüm protokol yaklaşık 65 dk sürer.
- Diyafram-frenik sinir stimülasyonu (bkz. Tablo 2)
- Tüm elektriksel stimülasyonlar için şu darbe genişliklerini kullanın: frenik sinir stimülasyonu için 1.8 ms ve doğrudan diyafram stimülasyonu için 0.2 ms. Tüm protokol yaklaşık 55 dk sürer.
- Deneysel protokolün sonunda, sırasıyla 0.05 mm hassasiyete sahip bir analog kumpas ve 0.1 mg hassasiyete sahip bir hassas terazi kullanarak kasın uzunluğunu ve ıslak ağırlığını ölçün.
- Kas kütlesini, optimal fiber uzunluğu (Lf) ile memeli iskelet kası yoğunluğunun (1.06 mg/mm3) çarpımına bölerek kesit alanını (CSA) hesaplayın16.
NOT: Lf, L0 değerinin fiber uzunluğu/kas uzunluğu oranıyla (soleus kası için 0.7116 ve diyafram kası için 117) çarpılmasıyla elde edilir.
- Kas kütlesini, optimal fiber uzunluğu (Lf) ile memeli iskelet kası yoğunluğunun (1.06 mg/mm3) çarpımına bölerek kesit alanını (CSA) hesaplayın16.
- Soleus-siyatik sinir stimülasyonu (bkz. Tablo 1)
- Sinir üzerinden stimülasyon için en uygun akım yoğunluğunu ayarlayın ve vakum elektrodu aracılığıyla iletilen akım darbelerinin, banyodaki akım yayılımı nedeniyle kas kontraksiyonuna yol açmadığını doğrulayın.
| Deney türü | Frekans | Süre | Tekrarlar | Kas veya Sinir Stimülasyonu | Amaç |
| (Hz) | (s) | ||||
| Twitch | Tek darbe | 1 | Kas | Seğirme kuvveti ve kinetiği | |
| Dinlenme | 30 | ||||
| Seğirme | Tek darbe | 1 | Sinir | ||
| Dinlenme | 30 | ||||
| Seğirme | Tek darbe | 1 | Kas | ||
| Dinlenme | 30 | ||||
| Sıçrama | Tek darbe | 1 | Sinir | ||
| Dinlenme | 120 | ||||
| Birleşmemiş tetanos | 40 | 0.8 | 1 | Sinir | Sinir ve kas stimülasyonları için kuvvet/frekans eğrileri |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Birleşmemiş tetanos | 60 | 0.8 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Birleşik tetanos | 80 | 0.8 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Birleşmemiş tetanoz | 20 | 0.8 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Füzyonlanmamış tetanoz | 60 | 0.8 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Birleşik tetanoz | 80 | 0.8 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Füzyonlanmamış tetanoz | 20 | 0.8 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Füzyonlanmamış tetanuz | 40 | 0.8 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 300 | ||||
| Yorgunluk paradigması | 35 | 0.8 | her biri 1,2 saniyelik dinlenme süresiyle, 1 kas stimülasyonunu takiben 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanmıştır | Nörotransmisyon yetersizliği (NF) | |
| Dinlenme | 900 | ||||
| Yorgunluk paradigması | 80 | 0.8 | her biri 1,2 s dinlenme süresiyle 1 kas stimülasyonunu takiben 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanmıştır | Nörotransmisyon yetersizliği (NF) ve intratetanik yorgunluk (IF) | |
Tablo 1 - Soleus-siyatik sinir stimülasyon protokolü. Tablo, soleus-siyatik sinir preparatlarını test etmek için kullanılan eksiksiz protokolü oluşturan testlerin sırasını listelemektedir.
| Deney türü | Frekans | Süre | Tekrarlar | Kas veya Sinir Stimülasyonu | Amaç |
| (Hz) | (s) | ||||
| Seyeğirme | Tek darbe | 1 | Kas | Seğirme kuvveti ve kinetiği | |
| Dinlenme | 30 | ||||
| Seğirme | Tek darbe | 1 | Sinir | ||
| Dinlenme | 30 | ||||
| Kas seğirmesi | Tek darbe | 1 | Kas | ||
| Dinlenme | 30 | ||||
| Twitch | Tek darbe | 1 | Sinir | ||
| Dinlenme | 120 | ||||
| Füzyonlanmamış tetanuz | 60 | 0.5 | 1 | Sinir | Sinir ve kas stimülasyonları için kuvvet/frekans eğrileri |
| Dinlenme | 120 | ||||
| Birleşik tetanos | 100 | 0.5 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Kaynaşmamış tetanos | 40 | 0.5 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 120 | ||||
| Birleşmemiş tetanoz | 20 | 0.5 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 120 | ||||
| Birleşmemiş tetanos | 80 | 0.5 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 150 | ||||
| Birleşmemiş tetanoz | 80 | 0.5 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 150 | ||||
| Kaynaşmamış tetanos | 20 | 0.5 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 120 | ||||
| Birleşik tetanos | 100 | 0.5 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 150 | ||||
| Birleşik tetanoz | 100 | 0.5 | 1 | Sinir | |
| Dinlenme | 180 | ||||
| Birleşmemiş tetanos | 60 | 0.5 | 1 | Kas | |
| Dinlenme | 300 | ||||
| Yorgunluk paradigması | 35 | 0.33 | Her biri 0,67 s dinlenme süresine sahip, 1 kas stimülasyonunu takiben 14 sinir stimülasyonundan oluşan döngünün 20 kez tekrarlanması | Nörotransmisyon yetmezliği (NF) | |
| Dinlenme | 900 | ||||
| Yorgunluk paradigması | 80 | 0.33 | her biri 0,67 s dinlenme süresiyle, 1 kas stimülasyonunu takiben 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanır | Nörotransmisyon yetmezliği (NF) ve intratetanik yorgunluk (IF) | |
Tablo 2 - Diyafram-frenik sinir stimülasyon protokolü. Tablo, diyafram-frenik sinir preparatlarının testi için eksiksiz protokolü oluşturan testlerin sırasını listelemektedir.
3. Veri analizi
NOT: Protokolün sonunda istenen tüm parametreleri şu şekilde hesaplayın.
- Tekli impuls stimülasyonundan
- Twitch kuvvetini (mN; twitch sırasında üretilen maksimum aktif kuvvet) ve spesifik twitch kuvvetini (mN/mm2) hesaplayın. Bunu, kas tarafından üretilen maksimum kuvvetten başlangıç ön yükleme değerini çıkararak hesaplayın. Spesifik twitch kuvvetini, twitch kuvvetinin kas CSA değerine bölünmesiyle hesaplayın.
- Pik gerilime ulaşma süresini (TTP) (ms), impuls salınımından twitch kuvvetine kadar geçen süre olarak hesaplayın.
- Yarım gevşeme süresini (1/2RT) (ms), twitch kuvvetinden twitch kuvvetinin %50'sine kadar geçen süre olarak hesaplayın.
- dF/dt (mN/ms) değerini, kontraktil faz sırasındaki kuvvet türevinin maksimum değeri olarak hesaplayın.
- -dF/dt (mN/ms) değerini, gevşeme fazı sırasındaki kuvvet türevinin maksimum değeri olarak hesaplayın.
- İmpuls treni stimülasyonlarından
- Birleşmemiş kuvveti (mN) ve spesifik birleşmemiş kuvveti (mN/mm2) hesaplayın. Bunu, kas tarafından üretilen maksimum kuvvetten başlangıç ön yükleme değerini çıkararak hesaplayın. Spesifik birleşmemiş kuvveti, birleşmemiş kuvvetin kas CSA değerine bölünmesiyle hesaplayın.
NOT: Birleşmemiş kuvvet, tetanik frekanstan daha düşük bir frekanstaki impuls treni sırasında üretilen maksimum aktif kuvvettir. - Tetanik kuvveti (mN) ve spesifik tetanik kuvveti (mN/mm2) hesaplayın; maksimum kuvvet, tetanik frekansta uygulanan bir impuls treni sırasında üretilen maksimum aktif kuvvettir. Bunu, kas tarafından üretilen maksimum kuvvetten başlangıç ön yükleme değerini çıkararak hesaplayın. Spesifik tetanik kuvveti, tetanik kuvvetin kas CSA değerine bölünmesiyle hesaplayın.
- Kuvvet-frekans eğrisini hesaplayın. Her stimülasyon için elde edilen kuvvet (veya spesifik kuvvet) değerini, artan stimülasyon frekansına karşı grafiğe dökün. Tipik olarak, tekli impuls stimülasyonu ile başlar ve tetanik frekans ile sona erer.
- Birleşmemiş kuvveti (mN) ve spesifik birleşmemiş kuvveti (mN/mm2) hesaplayın. Bunu, kas tarafından üretilen maksimum kuvvetten başlangıç ön yükleme değerini çıkararak hesaplayın. Spesifik birleşmemiş kuvveti, birleşmemiş kuvvetin kas CSA değerine bölünmesiyle hesaplayın.
- Yorgunluk paradigmalarından
- Nörotransmisyon yetmezliğini (NF) şu şekilde hesaplayın:
Burada MF, kas stimülasyonunu takiben meydana gelen kuvvet azalmasıdır ve F, kas stimülasyonundan sonraki ilk impuls treninde ölçülen sinir stimülasyonunu takiben meydana gelen kuvvet azalmasıdır. - İntratetanik yorgunluğu (IF) şu şekilde hesaplayın:
Burada Flp, stimülasyonun son impulsunda kas tarafından üretilen kuvvettir ve Fm, aynı impuls treni sırasında kas tarafından üretilen maksimum kuvvettir. Sinir stimülasyonuyla ilgili olarak, intratetanik yorgunluğu doğrudan stimülasyondan hemen sonraki ilk impuls treninde hesaplayın.
- Nörotransmisyon yetmezliğini (NF) şu şekilde hesaplayın:
4. İstatistiksel analiz
NOT: İstatistiksel analiz modelleri, sinir ve membran stimülasyonlarına verilen kas yanıtlarının aynı hayvan modeli içinde mi yoksa 2 farklı hayvan modeli arasında mı karşılaştırıldığına göre seçilmelidir18,19.
- Yalnızca direkt ve indirekt stimülasyonlara verilen kas yanıtlarını karşılaştırıyorsanız TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt için Student's t testini kullanın. 2 farklı fare soyundan elde edilen kas preparatlarını karşılaştırıyorsanız, sabit faktörler olarak stimülasyon tipi ve fare soyunun yer aldığı 2-yönlü ANOVA kullanın. 2-yönlü ANOVA anlamlı bir sonuç verdiğinde, istatistiksel farkları araştırmak için çoklu karşılaştırma testleri kullanın.
- Kuvvet-frekans eğrisi için (yalnızca direkt ve indirekt stimülasyonlara verilen kas yanıtlarını karşılaştırıyorsanız), sabit faktörler olarak stimülasyon tipi ve stimülasyon frekansının yer aldığı 2-yönlü ANOVA kullanın. Gerektiğinde çoklu karşılaştırma testleri kullanın.
- 2 farklı fare soyundan elde edilen kas preparatlarını karşılaştırıyorsanız, sabit faktörler olarak stimülasyon tipi, stimülasyon frekansı ve fare soyunun yer aldığı 3-yönlü ANOVA kullanın.
- 3-yönlü ANOVA; hayvan soyu ve stimülasyon tipi faktörleri için anlamlı bir etki verdiğinde, aynı anda 2 grup arasındaki anlamlı farkları belirlemek için 2-yönlü ANOVA kullanın. Örneğin, 2 grubun membran stimülasyonuna verdiği kas yanıtları arasındaki farklar veya tek bir grup içindeki direkt ve indirekt stimülasyonlara verilen kas yanıtları arasındaki farklar değerlendirilebilir.
- 2 farklı fare soyundan elde edilen kas preparatlarını karşılaştırıyorsanız, sabit faktörler olarak stimülasyon tipi, stimülasyon frekansı ve fare soyunun yer aldığı 3-yönlü ANOVA kullanın.
- İntratetanik yorgunluk
NOT: Protokol, kontrol farelerinde bile sinir stimülasyonuna yanıt olarak yorgunluk oluşturacak şekilde tasarlandığından, bu parametre yalnızca 2 fare soyu arasındaki farkları incelemek için kullanılabilir; tek bir grup içindeki istatistiksel analiz her zaman anlamlı farklar verecektir.- İki grubu karşılaştırmak için, sabit faktörler olarak stimülasyon tipi, zaman ve fare soyunun yer aldığı 3-yönlü ANOVA kullanın. 3-yönlü ANOVA; hayvan soyu ve stimülasyon tipi faktörleri için anlamlı bir etki verdiğinde, kuvvet-frekans eğrisinde olduğu gibi, aynı anda 2 grup arasındaki anlamlı farkları belirlemek için 2-yönlü ANOVA kullanın.
- Nörotransmisyon yetersizliği için, sabit faktörler olarak hayvan soyu ve zamanın yer aldığı 2-yönlü ANOVA kullanın. Anlamlı sonuçlar döndürdüğünde, istatistiksel farkları araştırmak için çoklu karşılaştırma testleri kullanın.
NOT: Bu parametre her fare soyu için yalnızca bir değer döndürdüğünden, farklı fare modellerinin karşılaştırılmasına olanak tanır. - Kas ağırlığı, uzunluğu ve CSA için, farklı hayvan modellerinden gelen kas-sinir preparatlarını karşılaştırırken farkları incelemek amacıyla Student's t testini kullanın.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Biz açıklanan protokol fonksiyonel denervation birkaç nöromüsküler hastalıklar veya yaşlanma-mücadele hakkında bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı olup olmadığını (ve eğer öyleyse, hangi düzeyde) belirlemek için kullanılan kas değişiklikler çoğu kas kendisi veya nöromuskuler iletim oluşan seçici değişiklikleri nedeniyle. Aşağıda gösterilen veri amyotrofik lateral skleroz hastalığı20son aşamasında SOD1G93A transgenik fare modeli üzerinde yapılan bizim gru...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıda açıklanan deneysel protokol ölçme ve doğrudan kas veya meydana gelen herhangi bir işlevsel değişiklikler ayrımcılık dolaylı olarak nöromüsküler kavşak düzeyinde ideal bir yol sağlar. Bu teknik NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm üzerinde dayalı olduğundan, herhangi bir kusur morfolojik değişiklikler veya biyokimyasal değişiklikler ile ilişkili Eğer kurmak için kullanılamaz. Buna karşılık, herhangi bir morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azalttı olup olmadığını belirle...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar ifşa gerek yok.
Teşekkürler
Yazarların laboratuvar çalışmalarında Fondazione Roma ve televizyon dizisi tarafından (Hayır ver. desteklenmiştir GGP14066).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Çift Modlu Kol Sistemi | Aurora Bilimsel A.Ş. | 300B | aktüatör / dönüştürücü |
| Yüksek Güçlü İki Fazlı Stimülatör | Aurora Bilimsel A.Ş. | 701B | nabız stimülatörü (sinir) |
| Yüksek Güçlü Bi-Fazlı Stimülatör (nbsp; | Aurora Bilimsel A.Ş. | 701C | nabız stimülatörü (kas) |
| In vitro Kas Aparatı | Aurora Bilimsel A.Ş. | 800A | |
| Hazırlık doku banyosu | Radnoti | 158400 | |
| Monopolar Emme Elektrodu | A-M Sistemleri | 573000 | ev yapımı bir referans ile |
| Osiloskop | Tektronix | TDS2014 | |
| Stereomikroskop | Nikon | SMZ 800 | |
| Soğuk ışık aydınlatıcı | Fotonik Optik | PL 3000 | |
| Edinme kartı | Ulusal Aletler | NI PCIe-6353 | |
| Konektör bloğu | Ulusal Aletler | NI 2110 | |
| Kişisel bilgisayar | AMD Phenom II x4 970 | İşlemci 3.50 Ghz Windows 7 | |
| LabView 2012 yazılımı | Ulusal Aletler | ||
| Bikarbonat Tampon | Sigma-Aldrich | K4002 | fizyolojik tampon |
| Sodyum bikarbonat | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Kalsiyum klorür CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | susuz, toz vb; % 97 |
| Tampon HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | & ge; %99,5 (titrasyon) |
| Bulaşıklar 60mm x 15mm | Falcon | 353004 | Polistiren |
| Silikon | Sylgard | 184 Silikon | Elastomer Kiti & nbsp; 0.5Kg. |
| Akvaryum | için Termostat Dennerle | DigitalDuomat 1200 | |
| Pompa | Newa Mini | MN 606 | |
| Isı direnci Termocable | Şanslı Sürüngen | 61403-1 | 50 / 60Hz 50W |
| Kova | herhangi bir 10 litre | Polipropilen | |
| O2< / sub> +% 5 CO2 | siad | Karışım gazı | |
| # 5 Forseps | Güzel Bilim Aletleri | 11252-20 | 2 parça |
| Yaylı Makas - 8 mm Bıçaklar | Güzel Bilim Aletleri | 15024-10 | sinir eksizyonu |
| Keskin Makas | Güzel Bilim Araçları | 14059-11 | kas çıkarma |
| Narin Makas | Wagner | 02.06.32 | hayvanın dışı |
| Öğrenci Neşter Sapı #3 | Güzel Bilim Araçları | 91003-12 | |
| Neşter Bıçakları #10 | Güzel Bilim Araçları | 10010-00 | |
| Neşter Bıçakları #11 | Güzel Bilim Aletleri | 10011-00 | |
| naylon tel & Oslash; 0,16 mm | herhangi biri |
Kaynaklar
- Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
- Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
- Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
- Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
- Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
- Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
- Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
- Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
- Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
- Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
- Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
- Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
- Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
- Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
- Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
- Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
- Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
- Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
