Yöntem makalesi

Nöromüsküler kavşak işlevleri ölçme

DOI:

10.3791/55227

⸱

6 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical and Aerospace Engineering, Sapienza University of Rome, 2Institute Pasteur Cenci-Bolognetti, DAHFMO-Unit of Histology and Medical Embryology, Sapienza University of Rome, 3Center for Life Nano Science@Sapienza, Istituto Italiano di Tecnologia

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevsel bir değerlendirilmesi sinir ve kas arasındaki iletişimi ilgili gerekli bilgileri sağlar. Burada biz kapsamlı bir şekilde kullanarak iki farklı kas-sinir hazırlıklar, yani soleus siyatik ve diyafram frenik NMJ ve kas işlevselliğini değerlendirmek için bir protokol tanımlamak.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöromüsküler kavşak (NMJ) işlevselliği motor nöron ve kas arasındaki iletişimi, yaşlanma ve amyotrofik lateral skleroz (ALS) gibi Engelli olduğu hastalıklar okurken çok önemli bir rol oynar. Burada iki tür elektriksel stimülasyon birleştirerek NMJ işlevselliği ölçmek için kullanılan bir deneysel protokol tarif: doğrudan kas zarı stimülasyon ve stimülasyon sinir aracılığıyla. Bu iki farklı elektrodlar kas cevaben karşılaştırılması işlev düzeyinde fonksiyonel kas düşüş yol olası değişiklikler NMJ içinde tanımlamak için yardımcı olabilir.

Ex vivo hazırlıkları iyi kontrollü çalışmalar için uygundur. Burada tarif biz kas ve NMJ işlevselliği soleus siyatik sinir hazırlık ve diyafram frenik sinir hazırlık birkaç parametrelerini ölçmek için yoğun bir iletişim kuralı. Protokol yaklaşık 60 dakika sürer ve kesintisiz bir ısmarlama aracılığıyla yapılır seğirme Kinetik özellikleri, sinir ve kas elektrodlar için güç frekanslı ilişki ve iki parametre NMJ işlevselliği için belirli Yani neurotransmission yetmezliği ve intratetanic yorgunluk ölçer yazılım. Bu metodoloji hasar soleus ve diyafram kas-sinir hazırlıkları SOD1G93A transgenik fare, ubiquitously mutant antioksidan enzim süperoksit dismutaz 1 (SOD1) overexpresses ALS deneysel bir model kullanarak bulmak için kullanıldı.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nöromüsküler kavşak (NMJ) kas fiber motor endplate ve motor nöron axon terminal arasında bağlantı oluşturduğu bir kimyasal synapse var. Kas ve sinir arasındaki iletişim, yaşlanma veya amyotrofik lateral skleroz (ALS) gerçekleştiği sırada bozulmuş olduğunda çok önemli bir rol oynamaya NMJ gösterilmiştir. Kas ve sinir bir çift yönlü yol1,2' olarak, NMJ kusurları kas defektleri dan ayrı olarak ölçmek için güçlü olmak onların Fizyopatolojik Interplay yeni görüşler sağlayabilir. Gerçekten de, bu işlevsel değerlendirme morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azaltmak değerlendirmek için yardımcı olabilir.

Kas contractile yanıt sinir stimülasyonu ve onun membran doğrudan uyarılması tarafından uyarılmış aynı kas yanıt elde edildi karşılaştırılması NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm evlenme teklif etti. Gerçekten de, sinyal membran stimülasyon geçer tarafından neurotransmission beri iki contractile yanıt-e doğru tüm farklılıkları NMJ değişikliklere atfedilen. Bu yaklaşım yaygın olarak fareler3,4,5,6,7için önerilen ve ayrıca fare modelleri8tarihinde,9,10,11,12bilgi toplamak için kullanılır.

Burada, tüketim ve soleus siyatik ve diyafram frenik hazırlıkları iki kas-sinir hazırlıklar, yani sınamak için bir yordam ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. Bir özel kullanarak yazılım, biz tasarlanmış işlevsellik, NMJ ve kas karakterize birkaç parametre ölçümü birleştirir sürekli bir test Protokolü böylece NMJ hasar kapsamlı bir değerlendirme ayrı ayrı bu kas verimli. Özellikle, protokol seğirme gücü, kas Kinetik, kuvvet-frekans eğrisi için doğrudan ve sinir elektrodlar, hem bir ateş ve tetanic sıklık ve intratetanic yorgunluk7neurotransmission başarısızlık13 ölçer.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm hayvan deneyleri, Roma La Sapienza Üniversitesi-Histoloji ve Tıbbi Embriyoloji Birimi etik kurulu tarafından onaylandı ve İtalyan Hayvanları Koruma Kanunu'nun güncel versiyonuna uygun olarak gerçekleştirildi.

1. Deney kurulumu

  1. 1 adet aktüatör/dönüştürücü, 2 adet stimülatör, 1 adet in-vitro kas aparatı, 1 adet hazırlık doku banyosu, 1 adet aspirasyon elektrodu, 1 adet dijital osiloskop, 1 adet stereomikroskop, 1 adet soğuk ışık aydınlatıcı, 1 adet kayıt kartı, 1 adet konektör bloğu ve bir adet kişisel bilgisayardan oluşan deney sisteminin kurulması.
    NOT: Burada komut yazılımı LabView'da programlanmıştır ve stimülasyonların yüksek esnekliğini, doğruluğunu ve tekrarlanabilirliğini garanti etmek için tasarlanmıştır. Her stimülasyon için, kullanıcı nabız genişliğini, frekansını, süresini seçebilir ve zara mı yoksa sinir yoluyla mı iletileceğine karar verebilir. Kullanıcı ayrıca her stimülasyondan önce dinlenme süresinin uzunluğunu da seçebilir.

2. Soleus ve diyafram kaslarının NMJ kasılma özelliklerinin değerlendirilmesi

  1. Sistem ısınması
    1. Krebs Ringer buffer14'ü hazırlayın ve montaj aparatının bulunduğu bir banyoya ve hazırlık dokusu banyosuna yerleştirin. Hazırlık doku banyosuna 4 ml silikon ile hazırlanmış 60 mm'lik bir tabak yerleştirin.
    2. Sirkülasyonlu su banyosunu açın ve sıcaklığı soleus kası için 30 °C'ye ve diyafram kası için 27 °C'ye ayarlayın.
    3. % 95O2 -% 5 CO2 karışımının her iki banyoya da akmasına izin verin.
    4. Aktüatörü/dönüştürücüyü ve iki nabız stimülatörünü açın ve akım değerlerini membran stimülasyonu için 300 mA'ya ve sinir stimülasyonu için 5 mA'ya ayarlayın.
      NOT: 300 mA akım değerinin, çözelti < sup sınıfı = "xref>" 15'e D-tubokurarin eklendiğinde sinir dallarında önemli bir kasılmaya neden olmadığı gösterilmiştir. 5 mA akım değeri, çözelti vasıtasıyla indüklenen membran stimülasyonu ile bir örtüşme oluşturmadan kasın sinir yoluyla uyarılması için gereken akım miktarına karşılık gelir. Emme elektrodu ile kas arasındaki mesafe sinir uzunluğuna bağlı olduğundan, bu akım değeri her deneyden önce aşağıda anlatıldığı gibi dikkatli bir şekilde ayarlanmalıdır.
  2. Soleus ve diyafram diseksiyonu
    1. Acıyı en aza indirmek için fareyi servikal çıkık ile feda edin ve test için kasları hemen aşağıdaki gibi çıkarın.
    2. Soleus-siyatik hazırlama, diseksiyon ve kurulum
      1. Fare bacağına p etanol püskürtün ve bacağı kaplayan deriyi çıkarın. Bir makasla bacağın üst kısmında bir kesi yapın ve ardından cildi sıkıca çekin. Aşil tendonunu kaval kemiğinden izole edin ve ardından Aşil tendonunu bir makasla kesin.
      2. Tendonu bir çift forseps ile sıkıca sıkıştırın ve gastroknemius kasını soleus ile birlikte yavaşça çekin. Soleusun proksimal tendonu açığa çıktığında, Aşil tendonunu tutarken tüm baldırı bir makasla kesin. Doku örneğini hemen hazırlık doku banyosuna yerleştirin.
      3. Hazırlık banyosunu stereomikroskobun altına yerleştirin ve baldırı 0,20 mm çapında paslanmaz çelik pimler kullanarak silikon tabağa sabitleyin. Bir çift forseps kullanarak, soleusun proksimal tendonunu kelepçeleyin ve siyatik innervasyonunu ortaya çıkarmak için hafifçe çekin.
      4. İnnervasyon açığa çıktığında (Şekil 1), sinirin yaklaşık 5 mm'sini açığa çıkarmak için çevredeki dokuyu dikkatlice çıkarın. Siniri kesmek için ince bir makas kullanın. Soleus'u bir çift forseps ile proksimal tendon üzerine sıkıca sıkıştırırken, tekrar çekin ve Aşil tendonunu bir makasla keserek eksize edin.
      5. Aktüatörün/dönüştürücünün kol kolunun deliğinden bir naylon tel geçirin. Telin ucunda bir ilmik oluşturun ve kas montaj aparatının banyosuna ulaşana kadar teli geri çekmeden önce Aşil tendonunu kavrayın. Proksimal tendonu sabit kelepçenin içine sıkıştırın ve naylon teli kol kolunun etrafına bağlayın. Kasın çözelti içinde dengelenmesine izin verin.
      6. İlk optimum uzunluğu (L0) belirleyin.
        1. İlk olarak, kası 10 mN'de önceden yüklemek için gerin (bu değer maksimum seğirme kuvvetini garanti eder (deneyime dayalı olarak)). Ardından, ön yükü değiştirmek için kası hafifçe gerin ve bir dizi tek darbeyle uyarın. Maksimum seğirme kuvveti ölçüldüğünde optimum uzunluk elde edilir.
    3. Diyafram frenik hazırlık, diseksiyon ve kurulum
      1. Fare derisine p etanol püskürtün. Göğüs kemiği üzerinden bir makasla kesi yaparak ve cildi sıkıca çekerek diyafram kasını örten cildi çıkarın.
      2. Bir makasla, karnı sternumun altında yatay olarak kesin ve bağırsağı ve organları bir çift forseps ile nazikçe çıkarın. Omurgayı kesmek için bir çift kalın makas kullanın.
      3. Kaburgaları sternumun yaklaşık 1 cm üzerinden kesin ve yatay olarak ilerleyin. Dış organları bir çift forseps ile nazikçe çıkarın ve diyaframı içeren dairesel bir kaburga halkası elde etmek için omurgayı kesin.
      4. Preparatı Krebs Ringer tamponu içeren bir tabakta yıkayın ve ardından üst tarafı yukarı ve sternum öne bakacak şekilde hazırlık doku banyosunun içindeki silikon tabağa yerleştirin.
      5. Stereomikroskobu kullanarak, akciğerleri ve kalan organları dikkatlice çıkarın; frenik sinir sağ tarafta görünecektir (Şekil 2A).
      6. Diyafram boyunca yaklaşık 2 mm'lik bir halka bırakacak şekilde kaburgaları kesin.
      7. Forseps kullanarak, 0.20 mm çapında bir paslanmaz çelik pimi, frenik sinir innervasyonuna karşılık gelen noktada diyafram merkezi tendonuna ve ilgilenilen diyafram şeridini tanımlamak için aynı eksendeki kaburgalara başka bir pim sabitleyin.
      8. Diyaframı yerleştirmek için merkezi tendon üzerine iki ek pim ve seçilen şeridin her iki yanındaki kaburgalara iki pim daha sabitleyin. Gerekirse, frenik siniri forseps kullanarak çevredeki bağ dokusundan temizleyin.
      9. Kavisli bir bıçak kullanarak, Şekil 2B'de gösterildiği gibi bir tendon-kas-kaburga şeridini tanımlamak için diyaframı innervasyonun her iki tarafından kesin.
      10. Aktüatörün/dönüştürücünün kol kolunun deliğinden bir naylon tel geçirin. Telin ucunda bir ilmik oluşturun ve kas montaj aparatının banyosuna ulaşana kadar teli geri çekmeden önce tendonu kavrayın.
      11. Kaburgaları sabit kelepçenin içine sıkıştırın ve naylon teli kol kolunun etrafına bağlayın.
      12. Kasın çözelti içinde dengelenmesine izin verin ve başlangıçtaki optimal uzunluğu (L0) belirleyin.
        1. 5 mN'de önceden yüklemek için kası gerin. Ön yükü değiştirmek için kası hafifçe gerin ve bir dizi tek darbeyle uyarın. Maksimum seğirme kuvveti ölçüldüğünde optimum uzunluk elde edilir.

figure-protocol-1
Şekil 1 - Soleus-siyatik sinir hazırlığı. Soleus-siyatik sinirin cerrahi operasyon sırasında fonksiyonel testleri için. Siyatik, bir çift forseps kullanılarak açığa çıkar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

figure-protocol-2
Şekil 2 - Diyafram-frenik sinir hazırlığı. Resim, diyafram-frenik sinir hazırlığı eksizyonun (A) bir aşamasını ve fonksiyonel testler (B) için monte edilecek şeridi göstermektedir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

  1. NMJ özelliklerinin kas kasılmasından ayrı olarak ölçülmesi
    1. Sinir boyunca stimülasyon için en iyi akım yoğunluğunu ayarlayın ve emme elektrodundan geçen akım darbelerinin, banyodaki akımın yayılmasıyla kas kasılmasına neden olmadığını doğrulayın.
      1. Emme elektrodunu kasın yakınına yerleştirin ve siniri içeri çekin. Akım yoğunluğunu nazikçe arttırırken (5 mA'dan başlayarak), kası bir dizi tek darbeyle uyarın. Optimum akım değeri, seğirme kuvveti maksimum olduğunda belirlenir.
      2. Siniri elektrottan dışarı itin ve birkaç tek darbe verin. Solüsyon vasıtasıyla zar stimülasyonu ile örtüşme nedeniyle kasın kasılmadığından emin olun. Siniri tekrar içeri çekin.
    2. Programı başlatın ve istenen test protokolünü çalıştırmak için giriş dosyasını seçin.
      NOT: Giriş dosyası, tüm protokolü çalıştırmak için gereken tüm stimülasyon parametrelerini içerir. Her iki kas için aynı protokol yapısı kullanılsa da, stimülasyon parametreleri protokole bağlı olarak farklılık gösterir: soleus veya diyafram kaslarına atıfta bulunur.
      1. Soleussiyatik sinir stimülasyonu (bakınız Tablo 1)
        1. Tüm elektriksel stimülasyonlar için aşağıdaki darbe genişliklerini kullanın: siyatik sinir stimülasyonu için 1,4 ms ve doğrudan soleus stimülasyonu için 0,1 ms. Tam protokol yaklaşık 65 dakika sürer.
      2. Diyafram frenik sinir stimülasyonu (bakınız Tablo 2)
        1. Tüm elektriksel stimülasyonlar için aşağıdaki darbe genişliklerini kullanın: frenik sinir stimülasyonu için 1,8 ms ve doğrudan diyafram stimülasyonu için 0,2 ms. Tam protokol yaklaşık 55 dakika sürer.
      3. Deney protokolünün sonunda, sırasıyla 0.05 mm hassasiyette bir analog kumpas ve 0.1 mg hassasiyette bir hassas ölçek kullanarak kasın uzunluğunu ve ıslak ağırlığını ölçün.
        1. Kas kütlesini optimal lif uzunluğunun (Lf) ve memeli iskelet kasının yoğunluğunun (1.06 mg/mm3) çarpımına bölerek kesit alanını (CSA) hesaplayın16.
          NOT: Lf, L0'ın lif uzunluğu/kas uzunluğu oranıyla çarpılmasıyla elde edilir (soleus muscle16 için 0,71 ve diyafram kası17 için 1).
adet
Deney türüfrekanssüreTekrarlamalarınKas veya Sinir stimülasyonuamaç
(Hz)(ler)
seğirmeTek nabız1kasTwitch kuvveti ve kinetiği
dinlenme30
seğirmeTek nabız1sinir
dinlenme30
seğirmeTek nabız1kas
dinlenme30
seğirmeTek nabız1sinir
dinlenme120
Kaynaşmamış tetanoz400,81sinirSinir ve kas stimülasyonları için kuvvet/frekans eğrileri
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz600,81kas
dinlenme180
Kaynaşmış tetanoz800,81sinir
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz200,81kas
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz600,81sinir
dinlenme180
Kaynaşmış tetanoz800,81kas
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz200,81sinir
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz400,81kas
dinlenme300
Yorgunluk paradigması350,81 kas stimülasyonu ve ardından her biri 1.2 sn dinlenme süresi olan 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanırNörotransmisyon yetmezliği (NF)
dinlenme900
Yorgunluk paradigması800,81 kas stimülasyonu ve ardından her biri 1.2 sn dinlenme süresi olan 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanırNörotransmisyon yetmezliği (NF) ve İntetantik yorgunluk (IF)

Tablo 1 - Soleus-siyatik sinir stimülasyon protokolü. Tablo, soleus-siyatik sinir preparatlarını test etmek için tam protokolü oluşturan testlerin sırasını listeler.

adet
Deney türüfrekanssüreTekrarlamalarınKas veya Sinir stimülasyonuamaç
(Hz)(ler)
seğirmeTek nabız1kasTwitch kuvveti ve kinetiği
dinlenme30
seğirmeTek nabız1sinir
dinlenme30
seğirmeTek nabız1kas
dinlenme30
seğirmeTek nabız1sinir
dinlenme120
Kaynaşmamış tetanoz600,51sinirSinir ve kas stimülasyonları için kuvvet/frekans eğrileri
dinlenme120
Kaynaşmış tetanoz1000,51kas
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz400,51sinir
dinlenme120
Kaynaşmamış tetanoz200,51kas
dinlenme120
Kaynaşmamış tetanoz800,51sinir
dinlenme150
Kaynaşmamış tetanoz800,51kas
dinlenme150
Kaynaşmamış tetanoz200,51sinir
dinlenme120
Kaynaşmış tetanoz1000,51kas
dinlenme150
Kaynaşmış tetanoz1000,51sinir
dinlenme180
Kaynaşmamış tetanoz600,51kas
dinlenme300
Yorgunluk paradigması350,331 kas stimülasyonu ve ardından her biri 0.67 sn dinlenme süresi olan 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanırNörotransmisyon yetmezliği (NF)
dinlenme900
Yorgunluk paradigması800,331 kas stimülasyonu ve ardından her biri 0.67 sn dinlenme süresi olan 14 sinir stimülasyonu, 20 kez tekrarlanırNörotransmisyon yetmezliği (NF) ve İntetantik yorgunluk (IF)

Tablo 2 - Diyafram-frenik sinir stimülasyon protokolü. Tablo, diyafram-frenik sinir preparatlarını test etmek için tam protokolü oluşturan testlerin sırasını listeler.

3. Veri analizi

NOT: Protokolün sonunda istenen tüm parametreleri aşağıdaki gibi hesaplayın.

  1. Tek nabız stimülasyonundan
    1. Seğirme kuvvetini (mN; seğirme sırasında üretilen maksimum aktif kuvvet) ve özgül seğirme kuvvetini (mN/mm2) hesaplayın. İlk ön yük değerini kas tarafından üretilen maksimum kuvvete çıkararak hesaplayın. Spesifik seğirme kuvvetini, seğirme kuvvetinin kas CSA'sına bölünmesiyle hesaplayın.
    2. Darbe serbest bırakmasından seğirme kuvvetine kadar geçen süre olarak tepe gerilimine kadar geçen süreyi (TTP) (ms) hesaplayın.
    3. Yarım gevşeme süresini (1/2RT) (ms) seğirme kuvvetinden seğirme kuvvetinin P'sine kadar olan süre olarak hesaplayın.
    4. Kasılma fazı sırasında kuvvet türevinin maksimum değeri olarak dF/dt'yi (mN/ms) hesaplayın.
    5. Gevşeme fazı sırasında kuvvet türevinin maksimum değeri olarak -dF/dt'yi (mN/ms) hesaplayın.
  2. Nabız treni stimülasyonlarından
    1. Kaynaşmamış kuvveti (mN) ve özgül kaynaşmamış kuvveti (mN/mm2) hesaplayın. İlk ön yük değerini kas tarafından üretilen maksimum kuvvete çıkararak hesaplayın. Spesifik kaynaşmamış kuvveti, kaynaşmamış kuvvetin kas CSA'sına bölünmesiyle hesaplayın.
      NOT: Kaynaşmamış kuvvet, tetanik frekanstan daha düşük bir frekansa sahip bir darbe dizisi sırasında üretilen maksimum aktif kuvvettir.
    2. Tetanik kuvveti (mN) ve özgül tetanik kuvveti (mN/mm2) hesaplayın; maksimum kuvvet, tetanik frekansta iletilen bir darbe dizisi sırasında üretilen maksimum aktif kuvvettir. İlk ön yük değerini kas tarafından üretilen maksimum kuvvete çıkararak hesaplayın. Spesifik tetanik kuvveti, tetanik kuvvetin kas CSA'sına bölünmesiyle hesaplayın.
    3. Kuvvet-frekans eğrisini hesaplayın. Artan stimülasyon sıklığına karşı her bir stimülasyon için elde edilen kuvvetin (veya spesifik kuvvetin) değerini çizin. Tipik olarak, tek nabız stimülasyonu ile başlar ve tetanik frekans ile sona erer.
  3. Yorgunluk paradigmalarından
    1. Nörotransmisyon yetmezliğini (NF) şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-3
      MF, kas stimülasyonunu takiben kuvvet azalmasıdır ve F, kas stimülasyonundan sonraki ilk nabız treninde ölçülen sinir stimülasyonunu takiben kuvvet azalmasıdır.
    2. İntetani yorgunluğu (IF) şu şekilde hesaplayın:
      figure-protocol-4
      burada Flp, stimülasyonun son nabzında kas tarafından üretilen kuvvettir ve Fm, aynı nabız treni sırasında kas tarafından üretilen maksimum kuvvettir. Sinir stimülasyonu ile ilgili olarak, doğrudan stimülasyondan hemen sonra ilk nabız trenindeki intratetanik yorgunluğu hesaplayın.

4. İstatistiksel analiz

NOT: İstatistiksel analiz modelleri, hem sinir hem de membran stimülasyonlarına kas yanıtının aynı hayvan modeli içinde mi yoksa 2 farklı hayvan modeli arasında mı karşılaştırıldığına göre seçilmelidir18,19.

    Doğrudan
  1. ve dolaylı stimülasyonlara yalnızca kas tepkilerini karşılaştırıyorsanız, TTP, 1/2RT, dF/dt, -dF/dt için Öğrenci t testini kullanın. 2 farklı fare suşundan elde edilen kas preparatlarını karşılaştırıyorsanız, sabit faktörler olarak stimülasyon tipi ve fare suşu ile 2 yönlü ANOVA kullanın. 2 yönlü ANOVA önemli bir sonuç verdiğinde, istatistiksel farklılıkları aramak için birden fazla karşılaştırma testi kullanın.
  2. Kuvvet-frekans eğrisi için (doğrudan ve dolaylı stimülasyonlara yalnızca kas tepkileri karşılaştırılıyorsa), sabit faktörler olarak stimülasyon tipi ve stimülasyon sıklığı ile 2 yönlü ANOVA kullanın. Gerekirse birden fazla karşılaştırma testi kullanın.
    1. 2 farklı fare suşundan elde edilen kas preparatlarını karşılaştırıyorsanız, sabit faktörler olarak stimülasyon tipi, stimülasyon sıklığı ve fare suşu ile 3 ANOVA kullanın.
      1. 3 ANOVA, hayvan suşu ve stimülasyon tipi faktörlerinin önemli bir etkisini verdiğinde, aynı anda 2 grup arasındaki önemli farklılıkları belirlemek için 2 ANOVA kullanın. Örneğin, 2 grubun membran stimülasyonuna kas tepkisi arasındaki farklar veya bir grup içindeki doğrudan ve dolaylı stimülasyonlara kas tepkisi arasındaki farklar değerlendirilebilir.
  3. İntetantik yorgunluk
    NOT: Protokol, kontrol farelerinde bile sinir stimülasyonuna yanıt olarak yorgunluğu indüklemek için tasarlandığından, bu parametre yalnızca 2 fare suşu arasındaki farkları araştırmak için kullanılabilir ve tek bir grup içindeki istatistiksel bir analiz her zaman önemli farklılıklar sağlayacaktır.
    1. İki grubu karşılaştırmak için, sabit faktörler olarak stimülasyon türü, zaman ve fare zorlanması ile 3 ANOVA kullanın. 3 ANOVA, hayvan suşu ve stimülasyon tipi faktörlerinin önemli bir etkisini verdiğinde, kuvvet-frekans eğrisinde olduğu gibi, bir seferde 2 grup arasındaki önemli farkları belirlemek için 2 ANOVA kullanın.
  4. Nörotransmisyon yetmezliği için, sabit faktörler olarak hayvan suşu ve zaman ile 2 yönlü ANOVA kullanın. Önemli sonuçlar döndürürse, istatistiksel farklılıkları aramak için birden çok karşılaştırma testi kullanın.
    NOT: Bu parametre her fare zorlanması için yalnızca bir değer döndürdüğünden, farklı fare modellerinin karşılaştırılmasına olanak tanır.
  5. Kas ağırlığı, uzunluğu ve CSA için, farklı hayvan modellerinden kas-sinir preparatlarını karşılaştırırken farklılıkları araştırmak için Student t testini kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Biz açıklanan protokol fonksiyonel denervation birkaç nöromüsküler hastalıklar veya yaşlanma-mücadele hakkında bilgiler sağlar. Bu iletişim kuralı olup olmadığını (ve eğer öyleyse, hangi düzeyde) belirlemek için kullanılan kas değişiklikler çoğu kas kendisi veya nöromuskuler iletim oluşan seçici değişiklikleri nedeniyle. Aşağıda gösterilen veri amyotrofik lateral skleroz hastalığı20son aşamasında SOD1G93A transgenik fare modeli üzerinde yapılan bizim gru...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan deneysel protokol ölçme ve doğrudan kas veya meydana gelen herhangi bir işlevsel değişiklikler ayrımcılık dolaylı olarak nöromüsküler kavşak düzeyinde ideal bir yol sağlar. Bu teknik NMJ işlevselliği dolaylı bir ölçüm üzerinde dayalı olduğundan, herhangi bir kusur morfolojik değişiklikler veya biyokimyasal değişiklikler ile ilişkili Eğer kurmak için kullanılamaz. Buna karşılık, herhangi bir morfolojik ya da biyokimyasal değişiklikler işlevselliği sinyal neurotransmission azalttı olup olmadığını belirle...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların laboratuvar çalışmalarında Fondazione Roma ve televizyon dizisi tarafından (Hayır ver. desteklenmiştir GGP14066).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Çift Modlu Kol Sistemi Aurora Bilimsel A.Ş.300Baktüatör / dönüştürücü
Yüksek Güçlü İki Fazlı Stimülatör  Aurora Bilimsel A.Ş.701Bnabız stimülatörü (sinir)
Yüksek Güçlü Bi-Fazlı Stimülatör (nbsp;Aurora Bilimsel A.Ş.701Cnabız stimülatörü (kas)
In vitro Kas Aparatı Aurora Bilimsel A.Ş.800A
Hazırlık doku banyosuRadnoti158400
Monopolar Emme ElektroduA-M Sistemleri573000ev yapımı bir referans ile 
Osiloskop TektronixTDS2014
StereomikroskopNikonSMZ 800
Soğuk ışık aydınlatıcı Fotonik OptikPL 3000
Edinme kartıUlusal AletlerNI PCIe-6353
Konektör bloğuUlusal AletlerNI 2110
Kişisel bilgisayarAMD Phenom II x4 970İşlemci 3.50 Ghz Windows 7
LabView 2012 yazılımıUlusal Aletler
Bikarbonat Tampon Sigma-AldrichK4002 fizyolojik tampon
Sodyum bikarbonatSigma-AldrichS5761 
Kalsiyum klorür CaCl2Sigma-AldrichC4901susuz, toz vb; % 97
Tampon HEPESSigma-AldrichH3375& ge; %99,5 (titrasyon)
Bulaşıklar 60mm x 15mmFalcon353004Polistiren
SilikonSylgard 184 Silikon Elastomer Kiti & nbsp; 0.5Kg.
Akvaryumiçin Termostat DennerleDigitalDuomat 1200
PompaNewa MiniMN 606
Isı direnci TermocableŞanslı Sürüngen61403-150 / 60Hz 50W
Kovaherhangi bir 10 litrePolipropilen
O2< / sub> +% 5 CO2siadKarışım gazı
# 5 Forseps Güzel Bilim Aletleri11252-202 parça
Yaylı Makas - 8 mm BıçaklarGüzel Bilim Aletleri15024-10sinir eksizyonu
Keskin Makas Güzel Bilim Araçları 14059-11kas çıkarma
Narin MakasWagner02.06.32hayvanın dışı
Öğrenci Neşter Sapı #3Güzel Bilim Araçları 91003-12 
Neşter Bıçakları #10Güzel Bilim Araçları 10010-00
Neşter Bıçakları #11Güzel Bilim Aletleri 10011-00
naylon tel & Oslash; 0,16 mmherhangi biri
ile Krebs-Ringer

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Dadon-Nachum, M., Melamed, E., Offen, D. The "dying-back" phenomenon of motor neurons in ALS. J Mol Neurosci. 43 (3), 470-477 (2011).
  2. Dobrowolny, G., et al. Skeletal Muscle Is a Primary Target of SOD1G93A-Mediated Toxicity. Cell Metab. 8 (5), 425-436 (2008).
  3. Mantilla, C. B., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Neurotrophins improve neuromuscular transmission in the adult rat diaphragm. Muscle Nerve. 29 (3), 381-386 (2004).
  4. Prakash, Y. S., Miyata, H., Zhan, W. Z., Sieck, G. C. Inactivity-induced remodeling of neuromuscular junctions in rat diaphragmatic muscle. Muscle Nerve. 22 (3), 307-319 (1999).
  5. Sieck, D. C., Zhan, W. Z., Fang, Y. H., Ermilov, L. G., Sieck, G. C., Mantilla, C. B. Structure-activity relationships in rodent diaphragm muscle fibers vs. neuromuscular junctions. Respir Physiol Neurobiol. 180 (1), 88-96 (2012).
  6. Van Lunteren, E., Moyer, M. Effects of DAP on diaphragm force and fatigue, including fatigue due to neurotransmission failure. J Appl Physiol. 81 (5), 2214-2220 (1996).
  7. Van Lunteren, E., Moyer, M., Kaminski, H. J. Adverse effects of myasthenia gravis on rat phrenic diaphragm contractile performance. J Appl Physiol. 97 (3), 895-901 (2004).
  8. Lee, Y., Mikesh, M., Smith, I., Rimer, M., Thompson, W. Muscles in a mouse model of spinal muscular atrophy show profound defects in neuromuscular development even in the absence of failure in neuromuscular transmission or loss of motor neurons. Dev Biol. 356 (2), 432-444 (2011).
  9. Personius, K. E., Sawyer, R. P. Variability and failure of neurotransmission in the diaphragm of mdx mice. Neuromuscular Disord. 16 (3), 168-177 (2006).
  10. Röder, I. V., Petersen, Y., Choi, K. R., Witzemann, V., Hammer, J. A., Rudolf, R. Role of myosin Va in the plasticity of the vertebrate neuromuscular junction in vivo. PLoS ONE. 3 (12), e3871(2008).
  11. Chevessier, F., et al. A mouse model for congenital myasthenic syndrome due to MuSK mutations reveals defects in structure and function of neuromuscular junctions. Hum Mol Genet. 17 (22), 3577-3595 (2008).
  12. Farchi, N., Soreq, H., Hochner, B. Chronic acetylcholinesterase overexpression induces multilevelled aberrations in mouse neuromuscular physiology. J Physiol. 546 (1), 165-173 (2002).
  13. Kuei, J. H., Shadmehr, R., Sieck, G. C. Relative contribution of neurotransmission failure to diaphragm fatigue. J Appl Physiol (Bethesda, Md: 1985). 68 (1), 174-180 (1990).
  14. Del Prete, Z., Musarò, A., Rizzuto, E. Measuring mechanical properties, including isotonic fatigue, of fast and slow MLC/mIgf-1 transgenic skeletal muscle. Ann Biomed Eng. 36 (7), 1281-1290 (2008).
  15. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Chamberlain, J. S., Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Force and power output of fast and slow skeletal muscles from mdx mice 6-28 months old. J Physiol. 535 (2), 591-600 (2001).
  16. Brooks, S. V., Faulkner, J. A. Contractile properties of skeletal muscles from young, adult and aged mice. J Physiol. 404, 71-82 (1988).
  17. Lynch, G. S., Hinkle, R. T., Faulkner, J. A. Force and power output of diaphragm muscle strips from mdx and control mice after clenbuterol treatment. Neuromuscul Disord. 11 (2), 192-196 (2001).
  18. Rizzuto, E., Pisu, S., Musar, A., Del Prete, Z. Measuring Neuromuscular Junction Functionality in the SOD1 G93A Animal Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. Ann Biomed Eng . 43, (2015).
  19. Soliani, L. Manuale di statistica per la ricerca e la professione statistica univariata e bivariata parametrica e non-parametrica per le discipline ambientali e biologiche. , (2004).
  20. Gurney, M. E., Pu, H., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science (New York, N.Y). 264 (5166), 1772-1775 (1994).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Neuromuscular Junction FunctionalityElectrical StimulationEx Vivo PreparationSoleus Sciatic NerveDiaphragm Phrenic NerveForce Frequency RelationshipNeurotransmission FailureIntratetanic FatigueTwitch Kinetics PropertiesSOD1 G93A Mouse

İlgili makaleler