Burada, ökaryotik hücrelerden protein komplekslerinin ekspresyonu, izolasyonu ve karakterizasyonu için yeni, sağlam ve verimli bir tandem afinite saflaştırma (TAP) yöntemini açıklıyoruz. Bu protokol, ayrık komplekslerin biyokimyasal karakterizasyonunun yanı sıra yeni interaktörlerin ve işlevlerini düzenleyen translasyon sonrası modifikasyonların tanımlanması için kullanılabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Ökaryotik Hücrelerde Protein Kompleksleri Tandem Affinity Arıtma
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Aktif protein-protein, protein-nükleik asit komplekslerinin saflaştırılması enzimsel faaliyetlerin ve yeni alt birimleri ve post-translasyonel modifikasyonlar de novo tanımlanması karakterizasyonu için çok önemlidir. Bakteriyel sistemlerde bir polipeptidler ve protein kompleksleri çok çeşitli ekspresyon ve saflaştırma için izin verir. Bununla birlikte, bu sistem, post-translasyonel modifikasyonları (örneğin, fosforilasyon ve asetilasyon) içeren protein alt birimlerinin temizleme, ve ökaryotik sisteminde ifade, sadece mevcut olan yeni düzenleyici alt birimlerin / belirlenmesini sağlamaz. Burada, ökaryotik hücrelerden geçici veya stabil ifade epitop etiketli proteinler ile protein komplekslerinin saflaştırılması kolaylaştıran bir roman, sağlam ve streptokok kullanarak verimli tandem yakınlık arıtma (TAP) yöntemiyle ve FLAG-etiketli proteinlerin ayrıntılı bir açıklama sağlar. Bu protokol, Prot karakterize uygulanabilirein karmaşık işlevsellik, kompleks alt birimlerin üzerine post-translasyonel modifikasyonlar keşfetmek ve kütle spektrometresi ile yeni düzenleyici kompleks bileşenleri tanımlamak için. Özellikle, bu TAP yöntemi ve böylece alt deney imkanları geniş bir dizi elde ökaryotik veya patojenik (viral ve bakteriyel) bileşenlerinin oluşturduğu protein kompleksleri çalışma uygulanabilir. Biz protein kompleksleri ile çalışan araştırmacılar, çok farklı şekillerde bu yaklaşımı kullanmak olabilir öneriyoruz.
Giriş
Protein-protein etkileşimleri (PPİ) işlevleri yaklaşık 2 bilgilendirebilir biyolojik süreçler 1, bu PPI üzerinde ileri çalışmalar hassas düzenlenmesi için kritik öneme sahiptir. Çeşitli yaklaşımlar PPI çalışma ve karakterizasyonu için, ayrıca bu yeni düzenleyici protein bileşenlerinin de novo tanımlanması için geliştirilmiştir. 1989 yılında, Stanley Alanlar ve arkadaşları maya iki hibrit (Y2H) tahlil 3 bildirdi. Bu yaklaşım, Saccharomyces cerevisiae 'interactors oranı (yem) tanımlanmış bir protein için (avlayan) tarafsız ve kapsamlı bir tanımlanmasına izin verir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Kaplama Hücreler
- Bir gün, transfeksiyondan önce,% 10 (h / h) cenin sığır serumu (FBS) ve% 1 (h / h), penisilin / streptomisin ile takviye edilmiş Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) içinde 10 mL 3.5 x 10 6 HEK293T hücreleri plaka 100 mm tabak başına (10.000 U / ml stok). Plaka 3 - Deney / durum başına 5 100 mm yemekleri yeterli protein iyileşme sağlamak için.
Not: plakaların sayısı ilgili protein kompleksi ifade seviyeleri ve çözünürlüğüne bağlı olacaktır, her bir deney / durum için tespit edilmesi gerekir. Daha büyük ölçekli saflaştırma gerektiğinde, alternatif olarak, hücre çizgileri döndürücü şişelere 2 süs....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu yazıda, (aynı zamanda P-TEFb kinaz olarak da bilinir), karmaşık iyi karakterize CycT1-CDK9 TAP yönteminin uygulanabilirliğini göstermek.
Ve CDK9,-FLAG (CDK9: F) ya da CDK9-Strep (CDK9: G) ve siklin T1 bayrağı (CycT1: F): Sikline T1 Strep (s CycT1) kodlayan plazmidler (Tablo 1), HEK293T hücrelerine transfekte edildi . F ya da CycT1: (sırasıyla Şekil 3A ve B,) F plazmitleri N.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
İfade ve ökaryotik hücrelerde protein komplekslerinin izolasyonu için açıklanan protokol, moleküler düzeneklerinin biyokimyasal karakterizasyonu ile sınırlı değildir, aynı zamanda işlevini düzenleyen olabilir yeni interactors ve post-translasyonel modifikasyonlar tanımlanması için de kullanılabilir. afinite etiketleri kullanımı Bu protokolde belirtilen ne ile sınırlı değildir; ancak deneyimi ilk AP adım olarak Strep kullanımı ile önemli ölçüde nihai protein-protein kompleksinin verimi artırır göstermektedir. Hem ve STRE.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu yayında bildirilen araştırma, NIH Ulusal Alerji ve Bulaşıcı Hastalıklar Enstitüsü (NIAID) tarafından R01AI114362 numaralı ödül ve Welch Vakfı'nın Iván D'Orso'ya verdiği I-1782 hibesi altında desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) | GE Healthcare Yaşam Bilimleri/Hyclone | SH3002.2FS | |
| Fetal sığır serumu | GE Healthcare Life Sciences/Hyclone | SH30071 | |
| Penisilin/Streptomisin | MP Biyomedikaller | MP091670049 | |
| PolyJet | SignaGen Laboratuvarları | SL100688 | |
| Proteaz inhibitörü kokteyli | Roche | ||
| STREP-Tactin Superflow | IBA Yaşam Bilimleri | 2-1208-010 | |
| STREP-etiket elüsyon tamponu | IBA Yaşam Bilimleri | 2-1000-025 | |
| EZview Kırmızı ANTI-FLAG M2 Afinite Jeli | Sigma-Aldrich | F2426 | |
| Corning 100 mm ve zamanlar; 20 mm stil çanak hücre kültürü ile muamele edilmiş pirojenik olmayan polistiren 20 / kol | Corning | ||
| Protein Lo-Bind Eppendorf | Eppendorf | 022431081 | |
| Dijital Vorteks Karıştırıcı | Fisher Scientific | 02-215-370 | |
| 48 delikli mikro tüp köpük raf | Fisher Scientific | 02-215-386 | |
| Labquake çalkalayıcı et lokantası | Termo | 415110 |
Kaynaklar
- Sharan, R., Ulitsky, I., Shamir, R. Network-based prediction of protein function. Mol Syst Biol. 3, 88-99 (2007).
- Jager, S., et al. Global landscape of HIV-human protein complexes. Nature. 481, 365-370 (2012).
- Fields, S., Song, O.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
