Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu

7.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55240

⸱

18 Ocak 2017

 ,  , 
1Artie McFerrin Department of Chemical Engineering, Texas A&M University

Bu makalede

Özet

Son bulgular, bakteriyel kamçı motorlarının çeşitli çevresel sinyalleri algıladığını ve yanıt olarak yeniden şekillendiğini göstermektedir. Burada tartışılan boncuk tahlillerinin, çevresel stres faktörlerine hücresel adaptasyonda yeniden şekillenmenin rolünü açıklamaya yardımcı olması beklenmektedir.

Özet

Kamçı motorlarının bakteri motilitesi ve kemotaksisindeki rolü iyi anlaşılmıştır. Son keşifler, kamçılı motorların çeşitli çevresel uyaranlara yanıt olarak yeniden şekillenebildiğini ve yüzey kolonizasyonu ve enfeksiyonları için tetikleyiciler arasında olduğunu göstermektedir. Motorların hücresel adaptasyonu yeniden şekillendirdiği ve teşvik ettiği kesin mekanizmalar, muhtemelen temel motor özelliklerine bağlıdır. Burada sunulan fotoçoğaltıcı tabanlı boncuk izleme tekniği, motor hızlarındaki ve anahtar dinamiğindeki adaptasyonlar dahil olmak üzere motor fonksiyonlarının doğru biyofiziksel karakterizasyonunu sağlar. Bu yaklaşım, gerçek zamanlı izleme avantajı ve uzun süreler boyunca motor davranışını araştırma yeteneği sunar. Tartışılan protokoller, çeşitli bakteri türlerinde kamçı motorlarını incelemek için kolayca genişletilebilir.

Giriş

Kamçılı motorlar sarmal dışı filamentler çevirerek yüzmeye hücreleri sağlar. Motor flagellum'un (yani, viskoz yük) belirli bir uzunluk için oluşturabilir tork miktarı, yüzme hızlarını belirler. Öte yandan, dönüş yönünü değiştirmek için yeteneğidir kimyasallar, kemotaksis olarak bilinen bir işleme karşılık olarak hücre göçü kontrol eder. Kemotaksis ve hareketlilik olan virülans 1-3, kamçılı motorlar yıllar 4 üzerinde iyi karakterize edilmiştir faktörleri. Montaj kanıtlar motor mekanosensör olarak işlev gördüğünü düşündürmektedir - mekanik katı yüzeylerde 5,6 varlığını algılar. Bu yetenek muhtemelen yüzey kolonizasyonu ve enfeksiyonlara 5,7 tetikleme yardımcı olur. Bunun bir sonucu olarak, motorlu yüzeyleri ve başlatır sinyal algılar ve böylece mekanizmaları önemli 8,9 sahiptir.

Flagellar motoru kolayca flagell tethering ele alınabilirum bir alt tabakaya ve hücre dönme gözlemleyerek. Bu tür bağlama birinci anti-kancalı antikorlar 10 cam alt tabakalar için polyhook E. coli içinde mutant ve başarılı bir şekilde bağlanmış kanca ile çalışmış Silverman ve Simon, elde edildi. gergin hücre deneyi kimyasal uyaranlara çeşitli motor anahtarı yanıtları çalışma etmesini sağlamıştır. Örneğin, Segall ve arkadaşları kimyasal iyontoforetik pipetler yardımıyla gergin hücreleri uyarılır. CW önyargı karşılık gelen değişiklikler kemotaksis ağı 11,12 adaptasyon kinetiği ölçmek için onları etkin (zaman motorların fraksiyonu CW, saat yönünde döndürmek). Gergin hücre deneyi anahtarı yanıtları okuyan etkili iken, sadece viskoz yükleri 13 sınırlı bir aralıkta motorlu mekaniği içgörü sunmayı başardı. Bu sorunu aşmak için, Ryu ve arkadaşları yüzeylere yapışmış hücreler üzerinde koçanları filament için küresel, lateks boncuklar gergin. boncuklar vardıDaha sonra zayıf optik tuzakları 14 ile geri odak interferometrik kullanılarak izlenir. farklı boyutlarda boncuk ile birlikte çalışarak, araştırmacılar yükler çok daha geniş bir aralıkta motoru çalışma olabilir. Bu tahlil, daha sonra lazer karanlık alan aydınlatma ile birlikte photomultiplier tabanlı boncuk izleme tekniğini geliştirdi Yuan ve Berg tarafından geliştirildi. Dış viskoz dirençleri rotasyon 15,16 iç viskoz dirençleri kıyasla düşük olduğunu bu nedenle küçücük gergin altın nanobeads (~ 60 nm) Onların yöntemi etkin izleme. Bu, E. coli içinde elde edilebilen maksimum hızdan (~ 300 Hz) ölçümlerine yol açtı. V. alginolyticus'un olarak, benzer boncuk deneyleri ara viskoz yükler (~ 700 Hz) 17 yaşında iplik oranları ölçümleri sağladı. (Sıfır yükten yakın durak) viskoz yüklerin tüm olası aralığında motor yanıtların ölçümleri sağlayarak, boncuk deneyleri t anlamak için önemli bir biyofiziksel araç sağladıorque nesil süreci 18,19.

Son zamanlarda, bireysel motorlar 6 hassas mekanik uyaranlara uygulamak için etkin optik cımbız içerecek şekilde Yuan-Berg tahlil güncellenmiştir. Onlar viskoz yüklerde değişikliklere tepki olarak pişmanlık - Bu tekniği kullanarak, biz motoru döndürmek kuvvet jeneratörler dinamik mechanosensors olduğunu göstermiştir. Mekanizmaları tam olarak bilinmemektedir, ancak böyle bir yük algılama, kaynıyordu bakterilerin içine hücre farklılaşmasını tetikler mümkündür. Doğrudan bir kanıt yoktu, ancak diğer türlerdeki flagellar motorlar da 20 mechanosensitive olması da muhtemeldir. Burada, kamçılı filamentler 15 gergin lateks boncuk dönüşünü izlemek için photomultiplier tabanlı (PMT) yaklaşımları tartışıldı. gerçek zamanlı olarak ve uzun dura üzerinde tek boncuk izlemek için nispeten basittir, çünkü çok hızlı kameralarla izlemeye karşılaştırıldığında, photomultiplier-Kur avantajlıleri. Nedeniyle çevresel uyaranlara 21 Flagellar motoru komplekslerinde biçimlenme uzun süre eğitim zaman özellikle yararlıdır. Özel olarak, E. coli için ayrıntılarıyla protokolleri rağmen, hali hazırda diğer türlerdeki flagellar motorlar çalışmak için adapte edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. Hücre Hazırlanması

  1. 10 ml taze TB 100 seyreltme: 1 ile inokülasyon ardından Tryptone Broth (TB,% 1 pepton,% 0.5 NaCl) alleli 15,22 yapışkan Flic taşıyan istenen gerginlik gecede kültürleri büyütün. OD 600 = 0.5 kadar bir çalkalama inkübatöründe 33 ° C'de kültür büyütün.
  2. 1,500 xg'de hücreleri Pelet 5-7 dk yeniden disperse pelet kuvvetli bir şekilde süzülerek sterilize motilite tamponu 10 mL (MB; 10 mM fosfat tampon maddesi ile: 0,05-0,06 M NaCl, 10 4 M EDTA, 1 uM metionin pH 7.0).
  3. Adımı yineleyin 1.2 iki kez daha ve 1 mL MB son pelet yeniden dağıtmak.
  4. (- 12 cm uzunluğunda, 0.58 mm iç çapı 7) polietilen boru ile bağlı 21 ila 23 ölçü adaptörleri ile iki şırınga arasında ileri ve geri ~ 75 kez geçerek süspansiyon kayma. 45 s - 30 kesme için toplam süreyi sınırlayın.
  5. 5-7 dakika boyunca 1.500 xg'de makaslanmış hücreleri Santrifüj ve yeniden dağıtmakMB 500 ul - 100 pelet.

2. Slayt Hazırlama

  1. Bir kapak kayma ve bir mikroskop lamı arasında iki çift taraflı yapışkan bantlar sandviç ile bir görüntüleme odası hazırlayın. kemotaksis deneyleri için, MB ve kimyasal uyarıcılar alışverişini sağlayan herhangi bir mikroakışkan odasını kullanır.
  2. odası içinde% 0.01 poli-L-lisin solüsyonu ilave edin ve 5 dakika sonra yavaşça MB yüzeyleri yıkayın (80-100 ul).
  3. odasına hücre süspansiyonu 40 ul ekleyin ve cam yüzeyine bağlanması için yeterli bir süre sağlar (7-8 dakika). Diğer taraftan bir filtre kağıdı ile çözelti emme ise, odacığın bir tarafında 100 uL MB eklenerek yapışmamış hücreleri dışarı akar.
  4. odasına lateks boncuk 15 mcL ve boncuk yerleşmek ve hücrelere takmak için yeterli zaman tanımak - 10 Ekle (7-8 dk). boncuk ayrılmak kaldırmak için, adım 2.3 anlatıldığı gibi yavaşça, MB 100 uL ile yıkayın. boncuk-si bir dizi kullanıniyi bir kontrast mevcut sürece deneyler için zes.

3. Boncuk İzleme

  1. Bir mikroskop sahnede örnek yerleştirin ve motorlara bağlı boncuklar için yüzey taraması. Faz mikroskopi gerekli değildir, ancak gözlem yapmaya 40X fazlı amacı kullanın. Alternatif olarak, bu kadar uzun yeterli kontrast açıkça karanlık bir arka plan üzerinde parlak boncuk ayırt etmek korunur olarak parlak alan görüntüleme kullanır.
  2. Bir kordon seçildikten sonra, Şekil 1B 'de gösterildiği gibi önceden belirlenmiş bir köşesinde boncuk konumlandırmak için yanal olarak sahne hareket ettirin. aynı köşede Pozisyon boncuk tanenin dönme yönü doğru bilinen emin olmak için. İdeal boncuk yörünge yaklaşık dairesel ama eliptik yörüngeleri kabul edilebilir.
  3. aliasing ile ilişkili hataları önlemek için motorun iki dönme frekansı daha örnekleme frekansı yüksek koruyun. Bu çalışmada, dönen bir motor kullanmak10 kat daha yüksektir (500 Hz) olan frekanslarda 50 Hz ve örnek, düzgün bir sinyal elde edildi.

4. Veri Analizi

  1. 23 Gerekirse Merkezi afin dönüşümler yörüngelerde PMT çıkış gerilimleri ve doğru ekliptiğinde ölçek ve. Rotasyon oranlarını 17 belirlemek için bir güç spektrum analizi kullanın.
  2. polar açıları, θ (t) = Atan (y (t) / x (t)) belirler. motor devir değişimleri belirlemek ve omega hesaplayarak zamanla geçiş figure-protocol-1 14.
  3. Motor hız verilerini düzeltmek için bir medyan filtresi kullanır. Iki tam rotasyonlar üzerinde bir filtre penceresi 23,24 tavsiye edilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Photomultiplier kurulumu Şekil 1A'da gösterilmiştir. Proje Yönetim Ekipleri ilgi boncuk tarafından dağınık dalga boyları aralığında yüksek hassasiyetleri sahip olması önemlidir. Burada kullanılan Proje Yönetim Ekipleri görünür ve yakın kızılötesi aralıkları faaliyet ve halojen ışık kaynağı tarafından aydınlatılan boncuk tarafından saçılan ışık tespit başardık. Optimum aydınlatma koşulları ve stok gerilimleri bir kurulum diğerine değişecektir. Bu çalışmada kullanılan ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

gergin boncuk izleme ve motor tork doğru tahmin kolaylaştırmak amacıyla, aşağıdaki bilgiler gözden geçirilmelidir. flagellated hücrelerle bu ölçümleri yaparken, kesme kritik bir adımdır. Kesme ve böylece motordaki viskoz yük boncuk ağırlıklı nedeniyle ve% 10 hata 16 içinde tahmin edilebilir olmasını sağlamak, sadece saplama flagellar filamanın azaltır. Kesme de sıkı dağıtılan dışmerkezliliğinden (14) ile dairesel yörüngeleri bulma şansını artırır. izleme ve yapışkan drags hesaplanma...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

Yazarlar, boncuk izleme mikroskobu/fotoçoğaltıcıları ve Texas A&M Mühendislik Deney İstasyonu'nu fon olarak hediye ettiği için Howard Berg'e teşekkür eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Poli-L-lizin Çözeltisi (% 0.1)Sigma-AldrichP8920http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
Polybead MicrospheresPolysciences, Inc.7307http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US
1 mL Luer Kayma Uçlu ŞırıngaExel Int.26048http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adaptörü 23 gaugeBecton, Dickinson and Company427565http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polietilen boruHarvard Aparatı59-8325http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Fotoçoğaltıcı TüplerHamamatsuR7400U-20300 ila 920 nm spektral tepki aralığı, Tepe dalga boyu 630 nm,  0.78 ns tepki süresi 
http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3 x 1 mm hassas yarıklarEdmund OpticsNT39-908Fotoçoğaltıcı tüpler üzerine birbirine dik açıyla monte edilmiş 2 yarık
OsiloskopTektronixTBS 1032BAlternatif markalar kabul edilebilir. Dijital Osiloskop, TBS 1000B Serisi, 2 Analog, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts 
http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Kutuplu LP/HP FiltreKrohn-Hite3384Alternatif markalar kabul edilebilir. 0,1 Hz ila 200 kHz arasında bir frekans aralığı önerilir.    
http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot mikroskobuNikonNAHerhangi bir dik veya ters faz mikroskobu kullanılabilir.
https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Küp Işın AyırıcıThorLabsBS013

Kaynaklar

  1. Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
  2. Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
  3. Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
  4. Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
  5. McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
  6. Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
  7. Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
  8. Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
  9. Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
  10. Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
  11. Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
  12. Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
  13. Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
  14. Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
  15. Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
  16. Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
  17. Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
  18. Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
  19. Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
  20. Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
  21. Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299(2015).
  22. Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
  23. Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
  24. Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
  25. Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
  26. Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Fotom ltipliyer Boncuk zlemeBakteriyel MotiliteMotor H z AnaliziAnahtarlama Dinami i KarakterizasyonuGer ek Zamanl Motor zlemeBoncuk Ba lama Tekni iMotor Yeniden Yap lanma al malarMekanobiyoloji Ara t rmalarMolek ler Motor Biyofizi i
Kuyruktaki Motor fonksiyonların Biyofiziksel Karakterizasyonu
Bize ulaşın
Kütüphaneye tavsiye et

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Telif hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.