MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometre Rat Beyin Dokusu içinde gangliositler Saptanmasında ve Görselleştirme DAN Matrix Sublime

Özet

MALDI Görüntüleme Kütle Spektrometresi kullanılarak gangliosidlerin tespiti için DAN matrisinin sıçan beyin dokusu üzerine süblimleştirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Özet

Örnek hazırlama uygun algılama ve matris destekli lazer çıkarma / iyonlaşma (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) deneylerde analitlerin görüntülenmesi için bir anahtardır. Her adım, ilgi analitlerin kendine özgü özellikleri olan uygun optimize edilmelidir olarak örnek hazırlama süreci boyunca takip uygun protokolü belirlemek zordur. Bu işlem sadece desorbe ve verimli bir şekilde ilgi konusu moleküllere iyonize bir uyumlu matris bulmak değil, aynı zamanda, uygun hücreler arasında madde birikmesi tekniği seçerek değil içermektedir. Kuru hücreler arasında madde birikmesi teknikleri lipidlerin iyonlaşma için özellikle etkili olan, oysa Örneğin, bir çözücü içinde bir matris eritme gerektirir ıslak matris birikim tekniği, en protein ve peptid desorpsiyonu için üstündür. Süblimasyon bağlı homogenei MALDI IMS ile doku lipidlerin saptanması için, kuru madde birikmesi son derece etkili bir yöntem olarak bildirilmiştirmatris kristal birikimi ve minimal analit yerel olmaktan ty birçok yaş çökelme yöntemleri ^{1, 2} ile karşılaştırıldığında. Genel olarak, bu soğuk bir yüzey bastırılır örnekleri ile bir vakum sızdırmaz bölme bir örnek ve toz haline getirilmiş bir matris yerleştirilmesini sağlar. Cihaz daha sonra soğutuldu doku örneği yüzeyi üzerine toz halinde matrisin süblimasyon ile sonuçlanan, bir ısıtılmış banyo (kum ya da yağ) içerisine indirilir. Burada MALDI IMS kullanarak sıçan beyninde gangliosidler tespiti ve görselleştirme için 1,5-diaminonaphthalene (DAN) matris kullanarak bir yüceltme protokol açıklar.

Giriş

Matriks destekli lazer desorpsiyon / İyonizasyon (MALDI) Görüntüleme Kütle Spektrometresi (IMS) giderek çok aranan bozulmamış numune yüzeyleri boyunca lipidler, peptidler ve proteinlerin mekansal dağılımı görüntülenmesi için tekniği sonra. MALDI IMS önceden önceden saflaştırılmış analitler için analitik tekniği olarak bilinen, ancak son yıllarda, bunun nedeni olmadan yüksek çözünürlüklü görsel / anatomik referans noktaları ile kütle spektrometresi doğruluğunu birleştirmek için yeteneği birçok diğer disiplinlerde dikkat çekmeye başlamıştır herhangi bir harici etiketlenmesi için gereklidir. Bu tekniği kullanan araştırmacıların bilimsel havuz büyümeye devam ettikçe, IMS deneyleri geliştirilmesi ve optimizasyonu yardımcı olmak için standartlaştırılmış, kolay takip protokolleri için ihtiyaç vardır artar. Gangliosidler, merkezi sinir sistemi içinde yüksek miktardaki membran lipidlerinin bir grup, membran içinde gömülü bulundukları yere gibi MALDI IMS deneyleri için idealdir, belirli bir speci yapargeleneksel immüno-etiketlemesi kullanılarak tespit etmek mümkün es. Buna ek olarak, hücre sinyalinin modülatörleri olarak işlev, bu yağlar, başka şeylerin yanı sıra, beyin hasarı ^{3, 4, 5,} değişmiş sağlıklı kemirgen beyin benzersiz bir anatomik dağılımla desenlere sahip olduğunu, MALDI IMS kullanan göstermiştir. Gangliositler en lipit türlere kıyasla daha yüksek bir kütle aralığında bulunan ve böylece MALDI görüntüleme platformu en uygun çözümdür.

Şekil 1: MALDI IMS Deney iş akışı. süblimasyon kullanarak MALDI IMS deney genel iş akışı diyagramı. -80 ° C'de dondurulmuş doku, bir kriyostat bölümlere ve 10 um bölümler çözülme iletken İTO slaytlar üzerine monte edilir. Lam daha sonra süblimasyon kadar desikatör içine yerleştirilir. slides süblimasyon aparatına yerleştirilir ve matris düz bir katman doku örneği yüzeyine uygulanır. Numuneler daha sonra 10 dakika boyunca bir kurutucu içine yerleştirilmiş bir -20 ° C dondurucu içinde bir gece boyunca dondurulmuştur. standartlar uygulandıktan sonra, numuneler bir lazer iyonize matris içinde desorbe moleküllerin neden doku boyunca yönlendirilir MALDI cihazına yerleştirilir. iyonları onlar dedektöre ulaşana kadar kendi kütlesi (time-of-flight / TOF) dayalı bir uçuş tüp ve ayrı aşağı seyahat. önceden tespit edilmiş bir kütle-yük (m / z) aralığında analit iyonik miktarı hakkında bilgi molekül görüntü ve kütle spektrumu hem de gösterilir. Bu veriler, görselleştirmek ve görüntülü doku içinde ilgili analit iyonik bolluk ölçmek hem de kullanılabilir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

örnek hazırlamasürecinin her adımı ilgi analitlerin özelleştirilebilir gerektiği gibi MALDI IMS çok değişkendir. MALDI-esaslı deneyler tanımlayıcı özelliği, analiz öncesi örnek yüzeyi üzerine biriktirilmiş bir matris kaplamanın kullanılmasıdır. Emici ve ablasyon esnasında lazer radyasyon enerji aktarmak rolüne ek olarak, bir matris ve böylece ilgi ^{6, 7} bileşiklerinin çözümlenmesini kolaylaştıran, örnek çeşitli analitlerin izole etmek için hizmet eder. Numune yüzeyine matris homojen bir uygulama örnek hazırlama sürecinde en önemli adımdır. Yanlış matris birikimi büyük heterojen matris kristal oluşumları ve eserler geliştirilmesi, düşük iyon sinyal ve kötü tekrarlanabilirlik ⁷ yol açabilir.

Belirli matrislerin afinite özel analitleri izole etmek için, matris tipi bir deney için seçilen nedeniyle canönemli ölçüde sonucu değiştirmez. protein ve peptid görüntüleme için kullanılan matris genellikle görüntüleme lipidler için kullanılanlardan farklı ve işlem bundan başka, başarılı bir dokudan sinyalleri tespit etmek için yıkama ve rehidrasyon adımları gibi ek işlemler için ihtiyaç tarafından karmaşıktır. Yıkama aşamaları lipit sinyalleri ⁸ arttırılması için mevcut olmasına rağmen, en çok lipit türlerinin tespiti için bir ön koşul değildir. bir lipid görüntüleme deney için bir matris seçerken, uygun matrislerin aralığını daraltmak bu kadar ilgi lipid kutuplarını dikkate almak önemlidir. Örneğin, gangliositler onlara genel bir olumsuz kutuplarını vermek sialik asit kalıntılarını içerir. etkin bir şekilde desorbe ve doku gangliosidler iyonize olabilir matrislerin vardır; Bununla birlikte, bu spektrum ve vakum altında matrisi matris türetilmiş tepe gibi faktörler dikkate alınarak alınmalıdır. 1,5-diaminonapthalene (DBİR) matris görüntüleme uygulamalarının çoğu için cihaz vakum koşulları altında yeterince sabit ve lipid desorpsiyonu için yüksek bir hassasiyet derecesi gösterdi ve pozitif ve negatif iyon modlarında ² hem de lipid analizi için kullanılabilir. Bu dihidroksibenzoik asit (DHB), 9-aminoakridin'in (9-AA) ve 5-kloro-2-merkaptobenzotiazol (SPK) gibi diğer olumsuz lipit benzer matrislere karşılaştırıldığında DAN matrisi, en etkin bir şekilde fare beyninden gangliosidler desorbe mümkün negatif iyon modunda (hazırlama yazısı) doku.

matriks birikimi uygun yöntemi seçerek matrisi kendisi seçerek eşit öneme sahiptir. Sıvı ilave izin vermek için örnek nüfuz olarak katı matris bir organik çözücü içinde çözülmüş, ve pnömatik bertaraf veya püskürtme ya gözcü otomatik olup, burada ıslak hücreler arasında madde birikmesi yöntemleri, protein ve peptid desorpsiyonu için özellikle etkilidirmatrisle bileşikler ve ko-kristalizasyon ction. Bu teknikler ayrıca lipit uygulamaları, analit yerel olmaktan ve eşit olmayan bir matris kristal oluşumları için kullanılabilir, ancak özellikle ipek ^{2, 9} nedeniyle çözücü maddeler içinde yüksek lipid bolluk ve çözünürlüğüne ortak oluşumları vardır. lipidler kolayca dokudan iyonize olduğundan bu tekniklerin dezavantajı çok engellemeyi ederken, böyle yüceltme gibi kuru matriks birikimi teknikleri, püskürtme için basit, uygun maliyetli bir alternatif sunuyoruz. MALDI IMS deneylerde süblimasyon başarısı ıslak matris teknikleri ^{1, 10} ile karşılaştırıldığında artmış tekrar üretilebilirliğine yol açmaktadır, bağlayıcı matris analit için yüzey alanını arttırır mikrokristalin matrisi morfolojisi, artan matriks saflık ve homojen matris birikimi gibi özellikler ilişkilendirilir.

Sublime invoHemen doku numunesi yüzeyi üzerine biriktirme ardından toz haline getirilmiş matrisin gaz faz geçişi bir katı olarak elde soğutulmuş bir Örnek yüzeyinin altında, vakum altında, bir toz halinde matris ısıtma lves. süblimasyon sırasında hücreler arasında madde birikmesi, zaman, sıcaklık ve yüksek oranda çoğaltılabilir sonuçları sağlamak için basınç değişen faktörlere ile kontrol edilebilir. Tek bir yüceltme deney atmadan önce birkaç kez tekrar kullanılabilir, seçilen matris tipine bağlı 5 ila 20 dk sürebilir. Cihaz otomatik spreyler fiyatının bir kısmını piyasadan satın alınabilir ve kolayca temizlik ve bakım için ayrı alınır. düşük maliyetli ve bu matris birikim tekniği göreceli basitliği başlayan veya MALDI IMS lipid görüntüleme uygulamaları üzerine genişleyen araştırmacılar için ideal hale getirmektedir. IMS dokuların yüceltme için protokoller ayrıntılı bilgi ¹¹ rapor edilmesine rağmen, birkaç standart protokoller w varhich zor geniş deneme ve yanılma olmadan tekniği kurmak için yapım, negatif iyon modunda yüksek kütle lipitleri görüntülenmesinde bir yüceltme deneyi yürüten ile ilgili temel iş akışı üzerinde durulacak. Aşağıdaki yüksek çözünürlüklü görüntüleme ve gangliosidler tespiti için sıçan beyin kesitleri üzerine DAN matrisi yüceltme için bu boşluğu doldurmak amacıyla deneysel bir protokoldür.

Şekil 2: Süblimasyon cihaz. Fotoğraf (A) ve süblimasyon cihazının şematik bir diyagramı (B). Vakum pompası 300 ml etanol ile dolu bir soğuk kapan kauçuk boru ile bağlanır. Soğuk tuzak sonra yüceltme aparatına lastik boru ile bağlanır. Cihaz, bir metal U bağlantı ile birlikte kapatılır cam iki ayrı parçadan oluşmaktadır. inceltici üst yarısıbuz slush ile doldurulur kondenser içermektedir. Numune levhası, kapalı cam bir aparat içinde, bir kondansatör alt üzerine bantlanır. yüceltme aparatının alt yarısı eşit örnek plaka bakacak yaymak DAN matrisi içerir. süblimasyon sırasında cam Cihaz doğrudan altındaki sıcak levha ile 140 ° C'ye kadar ısıtıldı, bir kum banyosuna yerleştirilir. sıcaklık probu deney için önceden ayarlanmış sıcaklığa göre kum banyosu sıcaklığı geri bildirimler ile yüceltme deney boyunca istikrarlı bir sıcaklık korumaya yardımcı olur. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protokol

Bütün hayvan taşıma prosedürleri Batı Ontario hayvan bakım komitesi (2016-014) Üniversitesine ya bağlı aşağıda tarif.

1. Doku Hazırlama ve Kesit

1. "Taze Donmuş Ekstraksiyon" (FFE) olarak bilinen bir süreçte sıçan beyin dokusunu ayıklayın.
   1. pentobarbital sodyum aşırı dozda ile sıçan Euthanize ve bacaklarda refleksleri izlemek. Tüm refleksler durdurmuş sonra, bir giyotin kullanarak sıçan başını sever.
   2. Dikkatlice neşter kullanılarak kafatası kasları ve diğer dokuları ayrı. ön kısmına kafatası (foramen magnum) tabanından başlayarak, beyin maruz kafatası kırmak için kemik kesme forseps kullanabilir.
   3. Beyin ortaya çıktığında, dikkatli bir cerrahi spatula ile kepçe ve hemen flaş dondurmak için ezilmiş kuru buz koyun.
      NOT: beyin çok uysal olacaktır. üzerinde beyin yerleştirirken nedenle aşırı dikkatkuru buz. Beyin ezilmiş veya bir yüzeye karşı basılırsa, onun şeklini değiştirmek ve o konumda donacak.
2. kuru buz üzerinde 80 ° C derin dondurucu ve yerden - taze dondurulmuş doku (değil formaldehit ile perfüze veya OCT gömülü) çıkarın.
3. kuru buz veya Kriyostat dondurma çubuğunda ya da üzerinde bir kriyostat tutucu ve yerin su birkaç damla koyun. Basın doku hafifçe kriyostat tutucu üzerine bu doku tabanı etrafında su donuyor kadar dondurmak ve tutun başlar ve yere çapa. Gerekirse daha fazla tutucu doku sabitlemek için ek su ekleyin.
   NOT: Su istenen sinyalin tespiti etkileyebilir bileşikler ile doku kirlenmesini önlemek amacıyla doku montaj yerine Ekim medya kullanılmaktadır.
4. kriyostat pozisyonu doku. istenen anatomik yere kadar bölüm doku. 12 mikron - kesim kalınlığı 8 arasında olduğundan emin olun.
   NOT: toplumsal kriyostat doku kesitcihazlar, tür bıçaklar, fırça, anti-roll barlar ve sahipleri olarak ayrı malzemeler bileşikleri gömme ile kirlenmesini önlemek amacıyla kullanılması zorunludur. kriyostat içinde de kullanılmadan önce iyice etanol ile temizlenmesi gerekir.
5. Kriyostaz viraj denge çubuğunu kullanarak, yavaşça bölüm doku bölümleri düzleştirilmiş. denge çubuğu yerleşimi yanlış veya bıçak donuk ise dokuda delik veya işaretler oluşabilir. temiz paintbrushes kullanarak platformu dilimleme merkezine doku taşıyın.
6. Montaj
   1. dilimleme sırasında kriyostat yerleştirerek iletken slayt veya metal plakalar dondurun. slayt tamamen donmuş zaman, dikkatli bir şekilde temiz paintbrushes kullanarak slayt iletken yüzeyine kesitli doku taşıyın. tüm doku bölümleri slayt doğru konumlandırılmış bir kez bölüm thaws kadar, slayt altında bir parmak yerleştirmek dokusu karşısında ve tuşuna basın.
      NOT: Bölümler kat veya çözdürme işlemi sırasında sırasında kıvrılabilirBu montaj yöntemi kullanarak. Bu doku çözdürme sırasında kriyostat slayt tutarak azaltılabilir. bu konular sorunlu hale gelirse, alternatif, sıcak-montaj yöntemi aşağıda listelenmiştir.
   2. Alternatif olarak, bir oda sıcaklığı İndiyum-kalay oksit (İTO) slayt (ya da metal plaka) almak ve hafifçe aşağı, dilimleme platformu yüzeyinde donmuş doku bölümünde iletken tarafı aşağı doğru bastırın. Bu eşit küçük kıvrılmasını veya doku katlama sürgünün yüzeyi üzerine doku kesiti eritme yol açacaktır.
      NOT: Montaj bazı proteinlerin ve yağların kaybına yol açabilir, bu yöntemi kullanırken Yoğunlaşma bölümünün altında görünebilir.
7. 10 dakika - 5 için bir desikatöre doku ile slaytlar yerleştirin.

2. süblimleştirici Aparatı Set-up

NOT: Davlumbaz bu adımları uygulayın.

1. metal makas lift sıcak plaka, bir sıcak plaka üzerine bir alüminyum kap içinde bir kum banyosu yerleştirinUygun yüzey alanı (sıcak plaka yani daha büyük). sıcak plaka açın ve 140 ° C'ye kadar sıcaklık ayarlanır.
   NOT: DAN matrisi için erime noktası 187 arasında - ° 190 ° C. ocak üzerinde bu sıcaklığı aşmayın.
   1. sıcak levha bir sıcaklık geri besleme sondası ile donatılmış ise, deney boyunca kum sıcaklığını izlemek ve sıcaklık tutarlılığı sağlamak için kullanabilirsiniz. Bu özellik, çeşitli süblimasyon deneyler arasında deney tekrarlanabilirlik ile yardımcı olabilir.
      NOT: kum banyosu yüksek sıcaklıklarda parçalanabilir bir cam kap gibi bir alüminyum kap içinde yer almalıdır.
2. Süblimleştirme cihazının dibinde yüzeyi üzerine DAN matrisinin 300 mg yerleştirin. düzeneğin merkezinde matris yerleştirin ve süblime olan yaklaşık genişlik ve sürgünün uzunluğu eşit bir tabaka olarak yayılır.
   DİKKAT: DAN matris toksiktir. Bu nedenle, önemli aşınma eldiven, maske ve güvenliğidirher zaman gözlük toz matris tutarken. o ışığa duyarlı olduğundan DAN karanlıkta saklanmalıdır.
3. Plaka, ayrılma sırasında sürgünün tüm yüzeyi boyunca soğutma sıcaklığının eşit dağılımını sağlamak için kondansatör alt doğrudan temas ile düzeneğin iç yüzeyi üzerine bir metal plaka kaydet. Alternatif olarak, kum kondenser alt düz bir yüzey sağlamak için.
   1. plakanın dış kenarları boyunca bant yerleştirilir ve iç cam kenarlarına uygun. Bant plakasının altına yerleştirildi ve iç cam yüzeyinin altına yapışır ise, sıcaklık dağılımı daha olmayabilir ve sürgünün yüzeyi boyunca düzgün olmayan bir matris dağılımı neden olabilir.
   2. Boş (testi) Bant tekrar slayt dış kenarlarında yerleştirilen bant ile metal plakanın yüzeyi boyunca çapraz kaydırın.
4. W, düzeneğin üst ve alt kısımları iletişimeortasında bir kauçuk O halkası i tam bir sızdırmazlık sağlamak için.
5. düzeneğin merkezi etrafında bir metal U ortak yerleştirin ve aygıtının üst ve alt yarısı sıkıca kapatılmış kadar mengeneler sıkıştırın. kum banyosu üzerinde metal O-ring yerleştirin.
6. ezilmiş buz bir avuç al ve yoğunlaştırıcı içine yerleştirin. buz rüşvet oluşturmak için soğuk suyla dolu ½ ¼ kondenser doldurun. Buz hızlı geri dökme kendisine yapışık düzeneğin içinde ve daha sonra slayt üzerinde metal plakayı soğuyacaktır. kararlı bir duruma ulaşması için sıcaklık en az 5 dakika bekleyin.
7. Soğuk tuzak kap içinde 300 ml etanol dökün ve kaba cam yerleştirin. Soğuk tuzak kabın alt etanol içinde kuru buz 3 küçük parçalar 2 - bırakın. Çıktı yok iken soğuk tuzak girişi, silindir dibine çalışan bir cam tüp vardır.
8. kauçuk tüp kullanılarak soğuk tuzak çıkışına vakum pompası bağlayın. kauçuk bir parça kullanınboru yüceltme aparatına soğuk tuzak girişini bağlamak için. boru sıkıca varsa metal kelepçeler kullanarak güvenli olduğundan emin olun.
9. 50 mT - 30 bir vakum sağlamak için vakum pompası kullanın. Pompa basınç dengeleme için en az 5 dakika boyunca çalışmasına izin verin. Vakum pompası, çünkü cihaz azalmış basınç açıldığında kez Süblimleştirme cihazının U halkası üzerindeki mengene bir sıkıştırma gerekebilir.
   NOT: Bu yüksek bir vakum göstergesi deney sırasında vakum basıncı izlemek ve deneyler arasında mümkün olan en yüksek tekrarlanabilirliği elde etmek için basınç sızıntı testi için pompaya bağlı olması önerilmektedir. Bununla birlikte, çoğu pompa nedenle ölçüm deneyimli kullanıcılar için gerekli olmayabilir, sabit bir basıncı korumak için tasarlanmıştır. Ayrıca, vakum mühür gres vakum basıncını korumaya yardımcı olmak için kullanılabilir.

3. Sublime

1. kum banyosu sıcaklığı stabil olduğundan emin olun140 ° C'de ve düzenek bağlı tüm boru ile bir kum banyosu üzerinde metal O-ring güvence altına alınır ve vakum altında açık olduğu ize.
2. 7 dakika zamanlayıcı ayarlamak ama sayacını başlatmak yok. inceltici U-eklem iyi metal O-ring üzerinde olana kadar yavaş yavaş süblime aparatına makaslı ve kum banyosu yukarı kaldırın. Bu ekstra alan kum aparatın ayarlanmasını sağlar.
   1. Hızla aparat kumun üzerinde eşit oturuyor emin olmak için kum yüzeyinde hafifçe inceltici basın ve sonra hemen Sayacı başlatmak.
3. Zamanlayıcı çaldığında, vakum pompasını kapatmak ve dikkatle inceltici artık kum banyosu dokunuyor ve metal O-ring emniyetli şekilde oturduğunu kadar makas lift indirin.
   1. Yavaş yavaş aparat basıncı serbest bırakmak için mikro-havalandırma vanası gevşetin. yüceltme aparatının kauçuk tüp etrafında metal kelepçeyi gevşetin ve yavaş yavaş tüp gevşetin başlar. ru kezgrafik çubuklarıyla bBER tüp hafifçe gevşetti olmuştur, kalan basıncı kaçmasına izin bir tarafa tüp bükün.
   2. ortam basıncı döner dikkatlice süblime cihazdan kauçuk tüp kaldırdığınızda.
4. aparatın U-eklem üzerindeki kötü alışkanlıklardan gevşetin ve çıkarın. Dikkatle yüceltme cihazının iki yarısını ayırmak ve iç cam üstünden slayt çekin. matris dağılımını bile onaylamak için slayt inceleyin.
   NOT: Matris düzensiz ise, inceltici altındaki toz matris yeniden konumlandırılmış olabilir veya inceltme aygıtı sonraki slayt için kum yeniden konumlandırılmış olabilir. süblimasyon işlemi, aynı matris kullanılarak birkaç kez tekrar edilebilir, bununla birlikte, matris sonunda süblime süresini ayarlamak için biraz ayarlanması gerekir ki bu azalacaktır tekrar ısıya maruz kalma ve tozun miktarından daha koyu hale gelecektir. Bu nedenle, matris bei miktarını izlemek için önemlidirng slaytlar arasındaki matriks birikimi tutarlılığı sağlamak için her deneyden sonra yüceltilmiş
5. yüceltilmiş matris dağılımı ve miktarı yeterli değilse, inceltici ve tekrar Bölüm 3 iç üzerine doku ile yeni bir slayt bantlayın.
   Not: kalite kontrol (QC) amaçları için, süblime matris miktarı gibi süblimleşme sonra slayt ağırlığında ve slayt ² yüzey alanına sahip süblime matrisin ağırlığına bölünmesi ile her bir deney sonra ölçülebilir, bu unutulmamalıdır yüksek hassasiyetli terazi kullanılmadığı sürece QC tamamen ölçülebilir aracı aksine nedeniyle 4 ondalık noktaları ve ölçekler arasında değişkenlik ötesinde en ölçekler hassasiyet eksikliği, bu ölçümler sadece optimum matriks birikimi için bir rehber kullanılmalıdır olmalıdır (bakınız Şekil 3).

4. Doku Depolama / rehidrasyon

1. süblimasyon sonra, mağaza kapalı bir kap ya da küçük cass slaytlarmühürlü plastik torbaya ette.
2. 2 saat veya gece boyunca -20 ° C derin dondurucuda slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
   Not: donma sürecinin amacı matris içine doku malzemeleri desorpsiyonu için bir rehidrasyon adım olarak hareket etmektir. Dondurma işlemi, aynı zamanda C ¹² ° -80 ° C'de muhafaza zaman 1 hafta kadar lipid sinyallerinin bozulmasını önlemek için gösterilmiştir. Bu nedenle örneklerin, dondurucuda saklanan zaman miktarı önemli ölçüde (laboratuarımızda görüldüğü gibi) sinyal algılama değiştirmeden deneyi ihtiyaçlarına göre belli bir dereceye kadar değişebilmektedir. Numuneler -20 ° C'de daha uzun bir süre, 24 saat boyunca dondurulmuş, ancak matriks bazı renk fark ettik. Böylece, o zaman önce yüceltilmiş dokuyu görüntüleme veya daha uzun kuluçka dönemleri için -80 ° C'de doku saklanması önerilir.
3. 10 dakika - 5 için bir desikatörde dondurucu (ve kap) ve yerden slaytları çıkarın.

5. Görüntüleme ve Analysis

1. desikatöre slaytları çıkarın ve görüntüleme sırasında MALDI enstrümanın kütle doğruluğunu sağlamak için enstrüman standartlarını uygulamak. standartları türü enstrümantasyon bağlı olarak değişecektir. Standartlar genellikle (Şekil 3D) yansıması dokuyu çevreleyen tüm slayt arasında eşit olarak uygulanır.
2. MALDI aracı haline slayt takın ve görüntüleme deneyleri için üreticinin talimatlarına (enstrüman yöntemleri 1000 için optimize edilmelidir - 2000 kütle aralığı) izleyin. Temsilcisi sonucu (Şekil 4) 70 mikron raster ve 20 çekim / spektrum (kazanım süresi ~ 2 saat) ile reflektron negatif modda satın alındı.

Sonuçlar

Süblime Deneyin tamamlanması üzerine, cam düzeneğinin iki yarısı, kondansatör bantlanmış, davlumbaz ve slayt ayrılır (Şekil 3A) çıkarılabilir. Bu noktada, kayıcı aşağıdaki slayt için ayarlanması gerekebilir kum banyosu düzeneğin düzensiz matris dağılımı ve süresi, sıcaklık veya yerleşim için muayene edilmelidir. Başarılı bir DAN yüceltme deneyi dokusunun anatomik özellikleri açıkça görülebilmesi slayt ve cam slayt matris miktarı yüzeyi boyunca gri / kahverengi matris eşi...

Tartışma

Bu çalışma, MALDI IMS deneylerde örneğin gangliosidler gibi negatif yüklü lipidler, tespiti için doku üzerinde matris süblimasyon standart bir protokolü göstermektedir. MALDI IMS numune hazırlama oldukça değişkendir ve ilgi analit eşsiz özelliklerini uyacak şekilde özelleştirilebilir olması gerekir. Doku örneği yüzeyi üzerine matrisin uygulanmasına IMS'de sonuçlar kalitesi açısından örnek hazırlama işleminin çok önemli bir yönüdür. Matris ilgi analit ile uyumludur ve spektrumunda matris türetilmiş eserler serbest ol...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Süblimatör	Chemglass Yaşam Bilimleri	CG3038-01
1,5-Diaminonatalen (DAN) matrisi	Sigma-Aldrich	D21200 &	100 gr
Cryostat	Thermo-Fisher Scientific		CryoStar NX50
Sıcaklık geri beslemeli sıcak plaka	Thermo-Fisher Scientific	HP88857290	Isotemp ADVD 7x7 HP 100 - 120 V
Paslanmaz Çelik Kriko	Thermo-Fisher Scientific	2216479	10x10
Soğuk Tuzak			Özel olarak yerinde üretilmiştir
Vakum Pompası	Franklin Electric	1102180403	Savant VP100 İki Kademeli
İndiyum-Kalay-Oksit (ITO) Slaytlar	Hudson Yüzey Teknolojisi	PSI 1111000	tip II, 1,1 mm/25 adet
MALDI TOF/TOF 5800 Enstrüman	AB Sciex
Kurutucu	Sigma-Aldrich	D2797	masa üstü kurutucu