Saccharomyces cerevisiae'deki endojen konumlarında histon genlerinde mutasyon oluşturmak için bir strateji sunulmuştur.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Bu makalede
Özet
Özet
Tomurcuklanan maya hücrelerinde histon genlerinde hedeflenen mutasyonlar oluşturmak için PCR ve homolog rekombinasyon tabanlı bir sistem tanımlıyoruz. Elde edilen mutant aleller endojen genomik bölgelerinde bulunur ve prosedürü takiben genomda hiçbir eksojen DNA dizisi kalmaz. Haploid maya hücrelerinde, dört çekirdek histon proteininin her biri, yüksek oranda homolog açık okuma çerçevelerine (ORF'ler) sahip iki alelik olmayan gen tarafından kodlandığından, mutajenezi spesifik olarak belirli bir histon proteinini kodlayan iki genden birine hedeflemek sorunlu olabilir. Burada tanımladığımız strateji, homolog rekombinasyon adımı için hedef genlerin ORF'sinin içinde değil, dışında dizileri kullanarak bu sorunu atlar. Bu sistemin bir başka özelliği de, homolog rekombinasyon adımlarını yönlendiren DNA bölgelerinin çok geniş hale getirilebilmesi ve böylece başarılı entegrasyon olaylarının olasılığını artırmasıdır. Bu özellikler, bu stratejiyi histon geni mutajenezi için özellikle uygun hale getirir, ancak maya genomundaki diğer genlerin mutajenezi için de uyarlanabilir.
Giriş
Dört çekirdekli histon proteinleri H2A, H2B, H3, H4 ve ökaryotik kromozomların sıkıştırma, organizasyon ve fonksiyonunda önemli rol oynarlar. Bu histonlar her iki set sonuçta nükleozom 1 oluşumu ile sonuçlanır, histon oktameri, kendi etrafında DNA ~ 147 baz çifti sarma yönlendiren bir molekül makara oluşturur. Nükleozomlar bu tür kromozom üzerinde gen transkripsiyonu düzenlenmesi ve ökromatin oluşumu ve heterokromatin olarak kromozom tabanlı süreçleri, çeşitli aktif katılımcılar vardır ve gibi, son birkaç on yıl boyunca yoğun bir araştırmanın odak noktası olmuştur. Bu mekanizmalar histon kalıntılarının sonrası modifikasyon, ATP-bağımlı nükleoz....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Not: in situ histon geni mutagenez hedef için deneysel strateji (Şekil 1 'de özetlenmektedir) çeşitli adımlar içerir. Bu adımlar şunlardır: URA3 geni hedef histon geninin (1) değiştirilmesi, (2) üretimi ve arzu edilen mutasyon (lar) yataklık primerler kullanılarak, hedef histon geninin iki kısmen üst üste parçalarının karşılık gelen PCR ürünlerinin saflaştırılması (3 ) kısmen örtüşen parçalarının PCR erimesi işaretleyici ile plazmit üzerinde (4) tam boyut PCR ürünlerinin ve omurga plasmid eş-dönüşüm ve seçim, (5) Resim 5-FOA dayanıklı, entegrasyon için tam boyut PCR ürünleri elde etmek için transformantlar, (6) 5-FOA-di....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
In situ mutagenez stratejisi hedef arasında temsili bir örnek olarak, bir glutamik asit (mutan H3-R53E) bir arjininden pozisyonda 53 bir ikame barındıran bir histon H3 mutan proteini ifade eden bir hht2 alel üretilmesini tarif eder.
Biz HHT2 bütün ORF URA3 geni (protokol aşamasını 1 e bakınız) ile ikame edildiği bir soy elde. Bu soy, yAAD156 da hücrelerin histidin için oksotropik ol.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Haploid S. cerevisiae hücreleri dört temel histon proteinlerinin her biri için kod özel mutagenez için iki genin biri hedeflemek isteyen araştırmacılar için bir meydan okuma temsil edebilir olmayan iki alel genler arasındaki dizi homoloji yüksek düzeyde. Daha önce sık kullanan, Delitto Perfetto, alana özgü genomik (SSG) mutajenez ve klonlama içermeyen PCR bazlı alel değiştirme yöntemleri 5, 6, 7, hem de daha y.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Bu el yazmasının hazırlanması sırasındaki yararlı yorumları için Reine Protacio'ya teşekkür ederiz. Finansman desteği için Ulusal Bilim Vakfı'na (1243680 ve 1613754 numaralı hibeler) ve Hendrix College Odyssey Programına şükranlarımızı sunarız.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 1 kb DNA Merdiveni (DNA standartları) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agaroz | Sigma | A5093-100G | |
| Borik Asit | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP karışımı (her biri 10 mM) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA çözeltisi (0,5 M, pH 8,0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Etanol (200 Kanıt) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Etilendiamintetraasetik asit disodyum tuzu dihidrat (EDTA | ) Sigma | E4884-500G | |
| Lityum asetat dihidrat | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Termal Döngüleyici | BioRad | 170-9703 | |
| Poli (etilen glikol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polimeraz (yüksek kaliteli DNA polimeraz) ve 5x tampon | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Somon sperm DNA çözeltisi | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris bazı, toz formu) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodyum asetat trihidrat | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Elek GPG Agarozu (düşük metling sıcaklığı agarozu) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polimeraz ve 10x Tampon | New England BioLabs | M0273X | |
| Kürdan | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1 M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| AD (+) - Maya | ortamı için | Glikoz Fisher Scientific | AC170080025 |
| ortamı için | Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | YPD ortamı için |
| Maya Özü | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | YPD ortamı için |
| 4-aminobenzoik asit | Sigma | A9878-100G | tam minimum bırakma ortamı için |
| Adenin | Sigma | A8626-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| Glisin hidroklorür | Sigma | G2879-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Arginin monohidroklorür | Sigma | A5131-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Asparagin monohidrat | Sigma | A8381-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Aspartik asit sodyum tuzu monohidrat | Sigma | A6683-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Sistein hidroklorür monohidrat | Sigma | C7880-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Glutamik asit hidroklorür | Sigma | G2128-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Glutamin | Sigma | G3126-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Histidin monohidroklorür monohidrat | Sigma | H8125-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-İzolösin | Sigma | I2752-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Lösin | Sigma | L8000-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Lizin monohidroklorür | Sigma | L5626-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Metionin | Sigma | M9625-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Fenilalanin | Sigma | P2126-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Triptofan | Sigma | T0254-100G | tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Tirozin | Sigma | T3754-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | , tam minimum bırakma ortamı için |
| Amonyum Sülfat | Fisher Scientific | A702-500 | tam minimum bırakma ortamı için |
| Maya Azot Bazlı | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | tam minimum bırakma ortamı için |
| 5-Floroorotik asit (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | 5-FOA ortamı için |
Kaynaklar
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rand....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
