Method Article

İnsan Pankreas Geliştirme Lineage Belirleyicileri sorgulanması için Genom Düzenleme ve hPSCs arasında Yönetmen Farklılaşma

DOI:

10.3791/55267

⸱

March 5th, 2017

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Program, Sloan Kettering Institute

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protokoller iCRISPR platformu kullanılarak hPSC mutan çizgileri oluşturmak için ve tarif edilen glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere hPSCs ayırt etmek. hPSC yönettiği farklılaşma ile genom düzenleme teknolojisini birleştirerek insan gelişimi ve hastalık seyrinde soy belirleyicilerinin rolü sistematik analizi için güçlü bir platform sunmaktadır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

kendini sürekli yenileyen veya insan pluripotent kök hücrelerin ayırt (hPSCs) 'de sorgulanması gen fonksiyonu insani gelişmeyi anlamak ve bir tabak hastalık mekanizmalarını diseksiyon yönelik değerli bir platform sunuyor. Bu potansiyel uygulama yararlanmak için yakın in vivo meslektaşları özetlemek hastalığa, ilgili hücre tiplerini üretmek için hastalıkla ilişkili genlerin hPSC mutantları, aynı zamanda, in vitro hPSC farklılaşma protokolleri oluşturmak için etkin bir genom düzenleme araçları gerektirir. ICRISPR isimli hPSCs için etkili bir genom düzenleme platformu AAVS1 lokusunda bir Cas9 sentezleme kasetinin TALEN aracılı hedefleme yoluyla geliştirilmiştir. Burada, kimyasal olarak tanımlanmış bir ortam ve bir besleme içermeyen durumda kültür hücreleri kullanılarak uyarılabilir Cas9 hPSC serilerinin jenere edilmesi için protokolleri açıklanmıştır. n yoluyla ya gen nakavt veya hPSCs hassas genetik değişiklikler için iCRISPR sistemini kullanmak için ayrıntılı prosedürler,on-homolog (NHEJ) katılmadan ucu veya bir homoloji yönettiği onarım (HDR) şablonu kullanarak kesin nükleotid değişiklikler yoluyla, sırasıyla dahildir. Bu teknik prosedürleri tasarım, üretim açıklamaları ve CRISPR kılavuz RNA'lar (gRNAs) aktarıldığı arasında; T7E1 veya RFLP tahlilleri ile CRISPR mutasyon hızının ölçülmesi; kurulması ve klonal mutant hatların geçerlilik ve. Son olarak, in vivo pankreas embriyonik gelişme taklit ederek glikoz duyarlı pankreas β-benzeri hücrelere hPSC farklılaşma için biz kronik prosedürleri. yönlendirilmiş hPSC farklılaşma ile iCRISPR teknolojisini birleştiren pankreas gelişimi ve diyabet hastalığının mekanizmaları anlayışımızı ilerletmek için gen fonksiyonu sistematik incelenmesini sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) yeteneğine sahip, hem kendini yenilemek ve üç embriyonik germ soy tüm türevleri doğuran. Onlar insan gelişim bağlamında hücresel süreçleri özetlemek için eşsiz bir platform olarak hizmet vererek hücre replasman tedavisi ve hastalık modelleme için değerli bir kaynak sağlamaktadır. Onlar da ölçeklenebilir, yüksek hacimli analizler için deneysel bir hücre kaynağıdır. verimli genetik modifikasyon araçları eksikliği ve kültür çanak karmaşık embriyonik gelişim aşamaları yansıtan zorluk: Ancak, ilerleme nedeniyle iki ana zorluklar sınırlı kalmıştır.

Genetik modifikasyon, normal gelişim ve hastalık gen fonksiyonunu incelemek için vazgeçilmez bir araçtır. Homolog rekombinasyon yoluyla yaklaşımlar hedefleme klasik gen kanıtlamıştır Bununla birlikte, fare embriyonik kök hücreleri (mESCs) gen fonksiyonu incelemek için güçlü bir araç 1, bu yaklaşım içinhPSCs 2, 3 uygulandığında derece verimsiz olmuştur. çinko parmak nükleazların (ZFNs), transkripsiyon aktivatörü gibi efektör nükleazların (Talens) ve kümelenmiş düzenli interspaced kısa yineleyen tekrarlar (CRISPR) / CRISPR ilişkili olmak üzere laboratuvar kullanımı için doğadan programlanabilir, siteye özgü nükleazların, son tempolu katılım (CA) sistemler 4, genom mühendisliği hPSCs de dahil olmak üzere, organizmalar ve hücreler geniş bir aralık içinde bir çok daha kolay bir görev haline anlamına gelir. Bu gen düzenleme araçları gibi Cas9 endonükleaz olarak kimerik nucleaseleri ya non-homolog etkinleştirmek için, kesin yerlerde çift sarmallı sonları (DSBs) indükleyen endojen DNA onarım makineleri tetikleyerek genetik modifikasyon bir dizi izin gerçeği yararlanmak (NHEJ) katılmadan sona erdirmek veya homoloji yönettiği onarım (HDR). Her iki mekanizma da eith indükleyerek genetik manipülasyonu için faydalanılabilirER rastgele sokma ve silme mutasyonu (indeller; NHEJ ile), bir insan hastalığı modelleme hasta mutasyonlar özetlemek için veya gen terapisi için, hastalığa neden olan mutasyon düzeltmek için, gen alellerini ya da (HDR ile) hassas nükleotid ikameleri geçersiz kare kaymalı mutasyonlar yaratmak .

DNA hedef tanıma belirten DNA bölünme ve değişken CRISPR RNA (crRNA) ve trans-aktive (tracrRNA) dubleks için gerekli sabit RNA güdümlü Cas9 endonükleaz: CRISPR / Cas-aracılı genom mühendislik iki bileşen gerektirir. CrRNA / tracrRNA dupleks daha verimli 5, 6, 7 iş bulunmuştur tek kimerik kılavuz RNA (gRNA) ile ikame edilmiş olabilir. CRISPR / Cas9 sistemi en deneysel organizma ve hücre çizgileri, Cas9 ve gRNA önemli ölçüde farklılık gösterir teslimatı ve ifade için uyarlanmıştır ve ihtiyacı olsa da daha achi için optimize edilmesihPSCs 8 dahil olmak üzere birçok sistemlerinde, arife verimli genom düzenleme. Verimli bir genom düzenleme platformu, iCRISPR, hPSCs 5 kurulmuştur. Bu sistemde, bir TALEN aracılı yaklaşım (TRE ters tetrasiklin kontrollü transaktivatör (M2rtTA) ve bir tetrasiklin tepki elemanı diğer trans, tek bir allel "transgen güvenli liman lokusu" AAVS1 iki alellerini hedeflemek için kullanılmıştır ) hPSCs bölgesindeki Cas9 (iCas9 ekspresyonunu) tahrik etmek. Kurulan klonal hatları (iCas9 hPSCs) 'de, Cas9 yüksek doksisiklin tedavisi ile ifade edilmektedir. Öte yandan, küçük boyutu (100 nt), tek ya da çoklu gRNAs kolayca yüksek verimle iCas9 hPSCs içine taşınabilir ve HDR aracılı hem de verimli NHEJ-aracılı gen bozulmasını sağlayan siteye özgü bölünme için Cas9 yönlendirebilir kısa tek bağlı DNA (ssDNA) verici şablonları mevcudiyetinde hassas nükleotid değişiklikleri. iCRISPR sistem olabilirbaşarılı bir şekilde, 9 önemli bir gelişim genlerin 5 bialelik (homozigot ya da heterozigot) ya da heterozigot-kaybı fonksiyonu mutasyonlu hastalık taklit hPSC soylarının bir paneli oluşturmak için kullanılır. Bir takım uzmanlar, hPSCs CRISPR / Cas kullanılarak etkin gen düzenleme rapor ederken, başarılı teknolojik usta laboratuarlarının az sayıda sınırlı kalmaktadır. ICRISPR platformu farklı beceri düzeylerinin araştırmacılar tarafından rutin gen düzenleme için etkin henüz basit bir çözüm sunar ve zaten bizim grup ve diğerleri 9, 10, 11, 12 ile yayınlanmış çalışmaların bir dizi kullanılır olmuştur. Bu yaklaşım, aynı zamanda daha dCas9-KRAB 13 sentezlenmesi göre uyarılabilir susturulması uzatıldı.

genom düzenleme tekno ilerleme ile birliktelogy, önemli gelişmeler de hPSC bakım ve yönetmenliğini farklılaşma elde edilmiştir. HPSCs Kültür koşulları ışınlanmış fare embriyonik fibroblast (IMEF) besleyici bağımlı tanımlanan hücre dışı matris bileşenleri üzerinde besleyici içermeyen koşullarına ve karmaşık medya formülasyonları kimyasal olarak tanımlanmış orta şartlarda 14 evrimleşmiş. Bu gibi gelişmeler IMEF hazırlanması ve nakavt Serum değiştirme bileşenleri partiden partiye farklılıklar nedeniyle hPSCs değişkenlik azalır ve böylece hPSC farklılaşması için bir daha tekrarlanabilir bir ortam sağlar var. Bu arada, yüksek verimli ilaç gösterimleri insan embriyonik gelişmeyi yöneten yollar, yanı sıra keşifler sinyalizasyon geliştirilmiş bilgi, gelişmiş farklılaşma protokolleri 15, 16, 17, 18 yol açmıştır. Bu protokoller daha yakından viv taklito gelişimsel adımlar yakından in vivo meslektaşları özetlemek hücre tiplerini oluşturur ve. Pankreas soy içine hPSC farklılaşma, ilk protokoller nispeten iyi ama sonunda olgunlaşmamış cenin fenotip ve glikoz uyarısına kötü yanıt polyhormonal β hücreleri oluşturulan erken pankreas gelişimini taklit etti. Son gelişmeler 16, 17, 19, 20 gibi oluşumu ve monohormonal β hücrelerin daha da olgunlaşması gibi daha sonraki olayları incelemek için sağlayacak glükoz duyarlı pankreatik β-benzeri hücrelerin üretilmesi için mümkün hale gelmiştir.

Burada, detay glikoz duyarlı pancr doğru hPSC tabanlı in vitro farklılaşma platformu ile iCRISPR sistemini birleştirerek pankreas gelişim çalışmaları için genom modifiye hatları uygulamasıeatic β-benzeri hücreler. Geliştirilmiş bir hPSC farklılaşma protokolü ile güçlü genom düzenleme araçları Bu bağlantı hastalık nedensellik doğrulamak için artan talebi karşılamak için gerekli hız ve ölçek sunuyor, ama aynı zamanda normal gelişimini ve hastalık 9 yatan transkripsiyonel kontrolü içine daha fazla mekanik araştırmalar için gelişmiş genetik manipülasyonlar sağlar sadece .

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol hPSC hatları H1, HUES8 ve MEL-1 kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen durumda (Malzeme ve Ekipmanları Tablosuna bakınız) ile çalışmalarına dayanmaktadır. Diğer hPSC hatları ya da farklı kültür koşullarında muhafaza hPSCs için daha fazla optimizasyon önerilir.

Kimyasal Tanımlı ve Besleyici serbest Durumu 1. hPSC Kültürü

  1. besleyici içermeyen durumuna IMEF besleyiciler üzerinde hPSC kültürünü uyarlayın. doğrudan besleyici içermeyen durumda kurtarıldı zaman donmuş hücreleri de hayatta olmayan durumlarda, ilk IMEF durumda hücreleri kurtarmak ve daha sonra besleyici içermeyen duruma uyum.
    NOT: Genel olarak, besleyici içermeyen duruma adapte edilmesi IMEF besleyiciler kültüre hPSCs 2 pasajlar sürer.
  2. ORTA her gün ve geçit hücreleri ~% 80 confluency ulaşmış hPSCs değiştirin. Genel olarak, ~ 1 de pasaj hPSCs: 6 - 1:15 oranları her 4 - 6 gün. 10 uM ROCK önleyicisi Y-27632, WH eklemeçözüldükten veya hücreleri pasajlanarak en.
  3. Oda sıcaklığında, en az 1 saat (RT) 5 ug / ml (1 ml / 10 cm2) vitronektin (vtn) kesik rekombinant insan formu hPSCs, ön-kaplama kültür kaplarına ekim öncesi. Ayrıca, bazal ortama takviyesi ekleyerek tam kimyasal olarak tanımlanmış ortam hazırlar.
  4. , Kültür ortamı çıkarın Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın PBS ile bir kez yıkama hücreleri, ve • 2 0.5 mM EDTA ile hücrelerin tedavi - oda sıcaklığında 5 dakika.
  5. Koloniler müstakil önce EDTA aspire. yumuşak pipetleme ile küçük parçalar halinde hPSC koloniler dağıtmak ve tam ortam içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  6. ayrışmış hPSCs toplayın ve 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri aşağı doğru döndürün. tam ortam içinde topak haline hPSCs yeniden süspanse edin ve VTN kaplı plakalar üzerinde hücreleri tohum.

iCas9 hPSC Hatları 2. Nesil

  1. AAVS1-TALEN-L, AAVS1-T: Sipariş ve aşağıdaki plazmidler yükseltmekALEN-R AAVS1-neo-M2rtTA ve AAVS1-Puro-iCas9.
    Not: beklenmedik rekombinasyon olaylarını önlemek 30 ° C'de plazmid transformasyonu ve büyütme için rekombinasyon eksikliği Stbl3 yetkin hücrelerin kullanımı.
  2. Tipik olarak, bir hedefleme deney için bir 10 cm'lik çanak (~ 1 x 10 7 hücre ~ eğer% 80 konfluent) 'de hPSCs hazırlamak.
    Not: elektroporasyon genellikle önemli hücre ölümü ve AAVS1 lokusunda hedefleme TALEN-aracılı gen antibiyotik seçimi gerektirir neden olduğundan, hücre nispeten büyük bir sayıda doğru hedef hücreleri tanımlamak için tohumlanmıştır gerekmektedir. İlaç konsantrasyonları için optimizasyon her bir hücre hattı ve her bir kültürün durumu için tavsiye edilir.
  3. Gün -1 günü, (elektroporasyon gün önce), medya değişimi sırasında 10 uM ROCK inhibitörü ekleyin.
  4. Gün 0 (elektroporasyon gün), önceden VTN kaplı plakaları hazırlamak.
  5. USI tek bir hücre içine hPSCs ayrıştırmalarıng 1x ayrışma ayıracı (bakınız Malzeme ve Ekipmanları Tablosu). Kısaca, kültür ortamı çıkarın Ca2 + ve Mg2 + olmaksızın PBS ile bir kez yıkama hücreleri ve ~ 3 dakika için 37 ° C 'de 1 x ayrıştırma reaktifi ile hücre tedavisi. Hücreler müstakil önce ayrılma reaktifi aspire. yumuşak pipetleme ile tam orta 10.5 mL bir tek hücre süspansiyonu halinde hPSCs dağıtılır.
  6. otomatik bir hücre sayacı kullanılarak hücre sayısını saymak için 0.5 ml hücre süspansiyonu al. 5 dakika boyunca 200 x g'de hPSCs pelet ve 12.5 x 10 6 hücre / mL soğuk (4 ° C) PBS içinde tekrar süspansiyon hücreleri.
  7. 800 uL hPSC süspansiyonuna (12.5 x 10 6 hücre / mL) içine plazmidler (Tablo 1 e bakınız) ilave edilir ve iyice karıştırılır. 0.4 cm elektroporasyon küvetine karışımı aktarın ve ~ 5 dakika boyunca buz üzerinde tutulur.
  8. 250 V ve 500 uF'de bir elektroporasyon sistemi kullanılarak hücrelerini elektroporasyona; zaman sabiti obs13 ms - Elektroporasyon işleminden sonra erved tipik haliyle 9'dur.
  9. Elektroporasyon işleminden sonra önceden ısıtılmış tam ortam 5 ml, 15 ml konik tüp hücreleri transferi. Kullanım sağlıklı çoğalan hPSCs ve transfer resuspending ve elektroporasyon sonra hücrelerin kaplama yaparken çok nazik hücreleri ele: Başarılı hedefleme için kritik.
  10. 5 dakika boyunca 200 x g'de Pelet hücreleri. Üç VTN-kaplı, 10 cm'lik kaplar her birine 10 uM ROCK inhibitörü ve plaka 1, 2.5 ve 5 x 10 6 hücre ile birlikte 10 ml ortamda hücrelerin tekrar; Bu levha, en az bir, koloni toplama için tek hücre klonal yoğunlukta yeterli koloniler sahip olmasını sağlar.
  11. 1. Gün (elektroporasyon sonra gün), orta değiştirmek.
  12. Gün 2 - hücreleri ~% 60 konfluent olduğunda 5, neomisin seçimi başlatın. 500 ug / mL G418 sülfat ile günlük orta değiştirmek; çok hücre ölümü Selectio nedeniylen, tipik olarak 2 gün sonra, G418 seçimi görülmektedir.
  13. 6. günde, antibiyotik seçimi olmadan orta değiştirmek.
  14. Gün 7-9, puromisin seçimi başlatın. 1 mcg / ml puromisin dihidroklorür günlük orta değiştirmek; çok hücre ölümü, ertesi gün gözlenmelidir.
  15. Çapı 2 mm - Gün 10, hPSC tek hücreli koloniler 1 ulaşana kadar antibiyotik seçimi olmadan günlük orta değişen başlar.
    Not: Genellikle, 10 cm'lik bir tabak 50 koloni 2.5 x 10 6 hPSCs ile gözlenir Gün 0 üzerine kaplanmıştır.
  16. Bir stereomikroskop altında 24 koloniler - 12 seçin. Mekanik küçük parçalar halinde hPSC koloniler ayrıştırmak (~ koloni başına 10 adet) 23-G iğne kullanılarak (200 ul pipetlemeyin ucu da ince) ve VTN kaplı 24-kuyucuğu doğrudan hücreleri aktarın.
  17. Hücreler birleştiklerinde haline gelinceye kadar her gün orta değiştirin. Geçiş 24 oyuklu plakaların her bir hücrelere6-delikli plakalara yinelenen.
  18. hücreler 6 oyuklu plakalar içinde birleşik olduğunda, dondurulmuş bir stoku ve daha fazla karakterizasyon için genomik DNA izolasyonu için diğer için bir kuyu kullanın.
  19. Karakterize ve PCR genotipleme, Güney lekeleme, RT-qPCR analizi, karyotipleme ve Pluripotency tahlili ile kurulan iCas9 satırları doğrulamak. Zhu ve arkadaşları bakınız. Ayrıntılı deneysel prosedürler için 21.

iCRISPR Sistemi Kullanılarak hPSC Mutant Hatları 3. Nesil

  1. HPSC nakavt hatlarının üretimi
    1. gRNA tasarım ve üretim
      1. vahşi tip proteinin işlevini bozmak olasılığını en üst düzeye çıkarmak için, ilgi konusu genin hedef bölgeleri seçin. İyi açıklamalı genlerin için önemli bir fonksiyonel etki yukarı bir hedef bölge seçin. Seçenek olarak ise, tasarım gRNAs başlangıç ​​kodonunun aşağı doğru bir bölgeyi hedef. en az 2 farklı seçilgi konusu bir gen için bölgeler.
      2. Online CRISPR tasarım aracı (http://crispr.mit.edu) kullanarak tasarım gRNAs. Her hedef bölge için, düşük potansiyeli-hedeflere kapalı ve klonal mutant hattı 22 üretmek için en yüksek hedef verimlilikle birini kullanın tasarım 3 gRNAs.
        NOT: Yüksek genom düzenleme verim elde etmek için, RNA oligo şekilde yerine, çünkü son deneyim plazmid karşılaştırıldığında küçük RNA'ların yüksek transfeksiyon verimi plasmid DNA gibi gRNA sağlamak için önerilir.
      3. T7 yükseltici seri içeren (nt) DNA oligos, değişken 20-nt crRNA tanıma dizisi (N) 20 (PAM dizisi dahil değildir) 120 nükleotid Sipariş ve sürekli kimerik kılavuz dizisi. GKD 2 O 100-uM stok çözüm oligos seyreltin ve çözüm çalışma olarak 250 nM hazırlamak.
        Not: TAATACGACTCACTATAGGG (K), 20 GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTT
      4. T7F ve TracrR primerleri kullanılarak oligos PCR amplifiye gRNA in vitro transkripsiyonu (IVT) için çift şeritli bir DNA (dsDNA) şablon üretmek için (Tablo 2). PCR reaksiyon karışımı (bakınız Tablo 3) ve PCR çevrim koşulları 50 uL kullanarak (Tablo 4).
      5. 20 uL PCR ile amplifiye şablon ile in vitro gRNA transkripsiyon için yüksek verim T7 transkripsiyon kiti kullanın, üreticinin talimatlarına göre, in vitro gRNA transkripsiyon karışımı (Tablo 5). üreticinin talimatlarına göre transkripsiyon temizleme kiti kullanılarak gRNA ürünleri arındırın.
      6. Elüsyon tamponu, 100 uL - (100 ug tipik olarak ~ 50) Elute gRNAs üreticinin talimatlarına göre, yüksek verimli saflaştırma protokol. -80 Ve 320 ng / ml (10 uM) mümkün ve saklamak konsantrasyonu ayarlama# 176; kullanılıncaya kadar C.
    2. PCR ve Sanger dizileme primer tasarımı
      1. Tasarım ve ürün boyutları genellikle arasında değişen, hedef bölgenin amplifiye PCR primerleri doğrulamak ~ 500 - 1000 bp.
      2. PCR ürünlerinin dahili bağlama Tasarım Sanger dizileme primerleri arıtılmadan PCR ürünlerinin direkt sıralaması, izin vermek.
    3. iCas9 hPSCs de gRNA transfeksiyon
      1. Gün -1 günü, 24 saat gRNA transfeksiyon önce 2 mcg / ml doksisiklin ile iCas9 hücreleri tedavi.
      2. GRNA transfeksiyon Gün 0 üzerinde önceden VTN kaplı plakalar hazırlar.
      3. Aşama 2.5 de tarif edildiği gibi, 1 x ayrışma reaktifi kullanılarak tek bir hücre içine iCas9 hücreleri ayırmak.
      4. 5 dakika boyunca 200 x g'de hPSCs pelet ve hücreleri tekrar süspansiyon ± 0.5 x 10 6 hücre / mL 2 ug / ml doksisiklin ve 10 uM ROCK inhibitörü ile desteklenmiş tam ortam içinde.
      5. 24 oyuklu plakalar tek tek yuvaları içine yeniden süspansiyon haline getirilmiş hücreler plaka 0.5 mL. olmayan transfekte kontrolleri hizmet için ek kuyu hazırlayın.
      6. Her gRNA, aşağıdaki transfeksiyon karışımları yapmak: düşük serum ortamı A, 50 uL karıştırın + 1 gRNA (10 uM) uL; Karışım B, uL transfeksiyon reaktifi düşük serum ortamı + 3 50 uL.
      7. Mix A birleştirin ve B 100 uL karışım yapmak. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe edilir. 24 oyuklu plakalar, yinelenen gözleri içindeki hücreler karışımın 50 uL ekleyin ve iyice karıştırın.
      8. Ayrıca hedefleme verimini arttırmak için gerekirse Gün 1, ikinci transfeksiyon gerçekleştirin. Aksi takdirde, doksisiklin olmadan orta değiştirmek.
      9. Gün 2 - 3 günlük orta değiştirmek.
      10. 4. Günde, bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak her bir transfekte edilmiş ve transfekte-olmayan kontrol hücrenin bir oyuk genomik DNA ekstrakte edin. 50 ng / μ konsantrasyonu ayarlamakL.
      11. GRNA hedefleme sekansları komşu hedef bölge PCR ile yükseltmek ve daha önce tarif edildiği gibi 5, T7 endonükleaz I (T7EI) sindirim ya da restriksiyon parça uzunluk polimorfizm (RFLP) analizi kullanılarak Düzenleme verimliliği hesaplamak.
    4. T7EI deneyi
      1. tasarlanmıştır ve adım 3.1 valide primerleri kullanarak hedef bölge PCR ile amplifiye.
      2. Karışımlar (Tablo 6) hazırlayın ve Tablo 7'de özetlenen koşullar kullanılarak PCR ürünlerinin DNA denatürasyonu ve hibridizasyon gerçekleştirmek.
        NOT: Bizim deneyime dayalı, bizim PCR koşulunu kullanırken T7EI tahlili için PCR ürünleri arındırmak için genellikle gerekli değildir. Ancak bu arıtma için diğer koşullar da yararlı olabilir.
      3. denatüre 10 uL kullanarak 30 dakika boyunca 37 ° C 'de, bir T7EI sindirim gerçekleştirmek ve PCR ürünü ve T7E1 0.2 uL (2 U) (10 U / ml) hibridize edildi.
      4. resolvjel elektroforezi ile T7E1 sindirilmiş PCR numuneleri e. kesim ve kesilmemiş DNA göreceli bant yoğunlukları belirlemek için ImageJ kullanın. Formül kullanılarak Indel frekans hesapla: (1 - (√ (1- (B + C)) / (a + b + c))), bir sindirilmemiş PCR ürünü ve B ve C arasında yoğunluğu x 100, T7E1-klivaj ürünlerin yoğunlukları.
    5. RFLP deneyi
      Not: bir kısıtlama alanı yakın olduğu durumlarda (<5 bp), bir Cas9 ayrılma sitesinin (PAM dizisinin 3 bp 5 ') için, bir RFLP deney Indel frekansını ölçmek için gerçekleştirilebilir.
      1. Aşama 3.1.4.1 tarif edilenle aynı PCR ürünleri kullanın.
      2. Cas9 bölünme alanına yakın bir sınırlandırma bölgesi ihtiva eden bir sınırlama enzimi ile PCR ürünü Digest.
      3. jel elektroforezi ile sindirilmiş PCR örnekleri çözmek. kesim ve kesilmemiş DNA göreceli bant yoğunlukları belirlemek için ImageJ kullanın. Indel hesaplayınaşağıdaki formül kullanılarak frekansı: a / (a + b + c) sindirilmemiş PCR ürünü ve B ve C arasında yoğunluğu sindirilmiş ürünlerin yoğunlukları olduğu, x 100.
    6. Klonal bir mutantıdır hatlarının oluşturulması
      Not: gRNA transfeksiyon ile iCRISPR sistemi kullanılarak hPSCs Genom düzenleme yüksek verimli ve hiçbir antibiyotik seçimi gereklidir. klonal hatları oluşturmak için, tek hücreden türetilmiş koloni oluşumunu sağlamak için nispeten düşük yoğunlukta hücreler tohum gerekir.
      1. (T7EI veya RFLP tahlil kullanarak) en yüksek düzenleme verimliliği ile ve iyi hücre sağkalım gRNAs tanımlayın. klonal değişken sıra kurulması için de ilgili çoğaltmak kullanın.
      2. Aşama 2.5 de tarif edildiği gibi, 1 x ayrıştırma reaktifi kullanılarak, tek bir hücre süspansiyonu içine hPSCs ayrıştırmaları. Üç VTN-kaplı, 10 cm'lik kaplar her birine 500, 1000, ve 2000 hücre Replate.
      3. orta günlük u değiştirmekTek hücreli ntil koloniler çapı ~ 2 mm ulaşır.
      4. T7EI ve / veya RFLP deneyi ile verimlilik hedefiyle tahmini bağlı olarak her gRNA için 48 koloniler - 24 seçin. Mekanik küçük parçalar halinde her koloni bölmekte (~ koloni başına 10 adet) 23-G iğne kullanılarak (200 ul pipetlemeyin ucu da ince) ve yinelenen VTN kaplı, 96-kuyucuğu hücreleri replate. genomik DNA ekstraksiyonu ve Sanger dizileme ve daha da genişlemesi için diğer plaka için bir tabak kullanın.
      5. 96-delikli plakalardaki hücreler konfluent hale geldiğinde, aşağıda açıklandığı gibi, basit bir protokol kullanılarak (fenol / kloroform ekstraksiyonu olmadan) genomik DNA ekstrakte edin.
      6. Orta kaldırmak ve Ca 2 + ve Mg 2+ olmadan bir kez PBS ile hücreleri yıkayın. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna lizis tamponu 50 uL (5 Proteinaz K uL (10 mg / ml) ve 5 uL PCR tamponu 10x ve GKD 2 O 40 uL) eklenir. yapışkan bir film ve doğmuş iyileşmesini kullanarak plaka SealTe gece boyunca 55 ° C.
      7. Sonraki gün, proteinaz K inaktive bir PCR 99 ° C 'de 10 dakika boyunca 96 gözlü PCR plaka içine hücre lizatları transferi ve inkübe
      8. şablon olarak hücre lizatı 1 uL kullanılarak T7EI ya RFLP analizi için aynı primerler kullanılarak, hedef bölge PCR ile amplifiye.
      9. PCR ürününe dahili bağlanan bir primer ile Sanger sekanslama için PCR ürünü 1 uL kullanın.
      10. dondurulmuş hisse senetleri için frameshift Indel mutasyonları olan klonlar yükseltin. Ayrıca, daha başka deneyler için olduğu izogenik kontrol hattı sunmak için aynı hedefleme deney, vahşi tip klonlarının bir çift yükseltmek.
  2. Hassas nükleotit değişikliği mutant çizgilerinin üretilmesine
    Not: (NHEJ) birleştiren homolog olmayan sonunda üretilen nakavt mutantlar ile karşılaştırıldığında, hassas nükleotid alterasyon, DNA repai mevcudiyetinde homoloji yönelik onarım (HDR) ile elde edilebilirr şablonları. Bu gibi hassas nükleotid değişiklikleri, vahşi tip hPSCs hasta özgü mutasyonların meydana getirilmesi ve hastaya türevi iPSCs mutasyonların düzeltilmesine izin verebilir.
    1. HDR şablon olarak ssDNA tasarımı
      1. Aşama 3.1.1 de tarif edildiği gibi, bir hastaya özgü mutasyona yakın 3 gRNAs - Tasarım ve 2 üretir.
      2. HDR şablon olarak her bir tarafında homoloji 80 nt - ~ 40 tarafından sınırlanan hastaya özgü mutasyonu ihtiva eden bir tek bağlı DNA (ssDNA) tasarlamak.
      3. Mümkünse, doğru tamir sonra ek kesme azaltmak için, tek başına gRNA tanıma dizisi içinde ve PAM dizisine yakın veya PAM dizisi Bölgede ssDNA şablonuna sessiz bir mutasyona getirmektedir.
      4. Mümkünse, hem de RFLP analizi kullanılarak tamir etkinliğini tahmin etmek için kullanılabilir, böylece yeni bir restriksiyon sindirimi mevkisinin katılması için sessiz bir mutasyona tasarımı.
    2. GRNA / ssDNA ko-transfeksiyonu ve klonal kuşaklarının kurulması
      1. gRNA ve transfekte-olmayan kontrol her biri için transfeksiyon karışımları A ve B, Adım 3.1.3 de tarif edildiği gibi, iCas9 hücrelerine gRNA / ssDNA eş transfeksiyonu gerçekleştirme 24 oyuklu plakalar çift kaynaklar içerisinde hücreleri transfekte. düşük serum ortamı + 1 uL gRNA (10 uM) + 2 uL ssDNA (10 uM), 50 uL: bir karışımı. B Mix: ul transfeksiyon reaktif düşük serum ortamı + 3 50 mcL.
      2. Transfeksiyondan sonra, transfekte edilmiş ve her transfekte-olmayan kontrol hücrenin bir oyuk genomik DNA elde etmek ve T7EI kullanarak tamir etkisinde ve / veya RFLP analizi tahmin ediyoruz.
      3. En yüksek onarım verimliliği ve iyi hücre canlılığı ile gRNA / ssDNA karışımı tanımlayın. klonal değişken sıra kurulması için de ilgili çoğaltmak kullanın.
      4. T7EI ve / veya RFLP eşek göre hedefleme verimlilik tahmini bağlı olarak 96 koloni - 48 almakay. Genel olarak, HDR aracılı mutasyon verimi mutasyon eleme daha düşüktür ve bu nedenle daha fazla koloni çekilmesi gerekir.
      5. Adım 3.1.6 de açıklandığı gibi sekans, genişletmek ve klonal hatları doğrulamak.

Glikoz-duyarlı Pankreas β Hücreleri içine Vitro hPSC Farklılaşma 4.

NOT: hastalık İlgili hücre tiplerine hPSC mutantlar in vitro farklılaşma bir tabak içinde hastalık modelleme için bir platform sağlar içinde. Aşağıdaki protokol, pankreas gelişim ve diyabetik çalışmalar 9, 16, 17 glukoz duyarlı pankreatik β hücrelerine hPSCs in vitro farklılaşması üzerine odaklanmıştır.

  1. kesin endoderm içine hPSC farklılaşma
    1. tarif edildiği üzere, kimyasal olarak tanımlanmış ve besleyici içermeyen durumda hPSC mutantlar ve vahşi tipli kontrol hatları korumak1. adımda, d.
    2. , Farklılaşma hPSCs hazırlamak 1x ayrıştırma reaktifi kullanılarak hPSCs ayırmak ve tam ortam içinde tek hücre süspansiyonu halinde karıştırır.
    3. 5 dakika boyunca 200 xg'de hücreleri pelet ve 10 uM ROCK inhibitörü ile birlikte ortam içinde hücrelerin yeniden askıya. Hücre sayısını ve hücreleri tohum ~ VTN kaplı plakalar üzerinde 1.4 x 10 5 hücre / cm 2.
    4. tohumlama sonra orta 24 saat değiştirin.
    5. Gün 0, hücreler ~% 80 konfluansa ulaştığında zaman, 48 saat sonra farklılaşma başlar.
      NOT: Yüksek pankreas farklılaşma verim elde 48 saatte confluency ekim yoğunluğu ve düzeyi optimize etmek her hat için tavsiye edilir.
    6. HPSC orta aspire ve Ca 2 + ve Mg 2+ olmadan bir kez PBS ile hücreleri yıkayın.
    7. farklılaşma gün 0 (d0) orta orta değiştirin.
    8. Gün 1 - 2, di değiştirmekTablo 8'deki tariflere göre, orta gün fferentiation.
    9. Gün 3, immünofloresan boyama ile kesin endoderm belirteçler SOX17, FOXA2 ve CXCR4 incelemek ve analiz akım sitometri.
  2. Pankreas progenitör içine kesin endoderm farklılaşma
    1. Gün 3 - 9 Tablo 9'da tariflere göre, günlük orta değiştirerek pankreas soy doğru kesin endoderm farklılaşma devam ediyor.
    2. Gün 7, immunofluorescent boyama erken pankreas progenitör (PP1) işaretleyici PDX1 incelemek ve analiz akım sitometri.
    3. Gün 10, sonra pankreas progenitör (PP2) belirteçleri PDX1 ve NKX6.1 inceleyin. Bu arada, pankreatik endokrin hücre içine daha fazla farklılaşması için hava-sıvı arayüzü PP2 hücrelerini aktarmak için hazırlar.
  3. Pankreas endokrin farklılıkhava-sıvı arayüzünde ayırt edilmesi
    1. 4 saat kesilmeden önce 10 uM ROCK inhibitörü ile PP2 hücreleri davranın.
    2. Orta kaldırmak ve Ca 2 + ve Mg 2+ olmadan bir kez PBS ile hücreleri yıkayın.
    3. bir 10 cm'lik bir tabakta PP2 hücrelerine 1x ayrıştırma reaktifi 2 ml ilave edilir ve 2 37 ° C'de inkübe - 3 dk.
    4. Hücreler müstakil önce ayrılma reaktifi aspire. Blar orta 10 ml ekleyin ve yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme tek hücre içine PP2 hücrelerini dağıtmak.
    5. tek hücre süspansiyonu toplayın. 5 dakika boyunca 200 x g'de, hücre sayısı ve pelet sayısı.
    6. ~ 0.5 x 10 5 hücre / mL S5 farklılaşma ortamı hücre pelletini ve 5 nokta - Bir Transwell ekleme filtre üzerinde yerinde başına hücre 10 uL. 10 cm'lik bir insert bir 6-yuvalı uç 15 noktalar ve ~ 100 lekeler - 10 yerleştirin.
    7. ~ 1.5 6-iyi uçlar için ml ve ~ 8 mL f her Transwell ucun altına S5 orta ekleya da 10 cm ekler.
    8. Tablo 10'daki tarifleri günlük orta değiştirin.
    9. Immünofloresan boyama ile günde 34 pankreatik endokrin belirteçleri PDX1, NKX6.1 NEUROD1, NKX2.2, insülin ve glukagon incelemek ve analiz 17 akış sitometrisi.
    10. Glikoz ile uyarılan insülin salgısı (GSIS) deneyi 16, 17, hPSC türetilmiş β-benzeri hücre fonksiyonunu inceleyin.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hPSC Kimyasal Tanımlı ve Besleyici serbest Kültür Adaptasyon ve Bakım

IMEF besleyiciler kültüre hPSCs hızlı besleyici içermeyen kültür durumda VTN kaplı plakalara adapte edilebilir. Normal IMEF besleyici kültür aynı bölme oranları uyarlanması sırasında kullanılabilir. Şekil 1A KSR bazlı bir ortam ve besleyici içermeyen bir ortam içinde, bir VTN kaplı yüzeye IMEF besleyiciler üzerine hPSCs tipik morfolojileri gösterir. Şekil 1B tipik bir morfolojik değişime ve uyum (4 gün) ilk geçişi sırasında hPSC kolonilerinin büyümesini göstermektedir. Hücreler daha geçişli veya gelecekteki deneyler için donmuş olabilir. farklılaşma deneyler başlamadan önce adaptasyon kültürünün 3 pasajları - 2 yürütmek. Biz adaptasyon aşamasında karyotip anomalileri görülmez rağmen Karyotipleme da, adaptasyon sonra tavsiye edilir.

"Fo: keep-together.within-page =" 1 "> yoluyla iCas9 hPSC Hatlarının Üretimi Talen aracılı AAVS1 Hedefleme

Daha önce gösterildiği gibi, hPSCs AAVS1 TALEN plasmidler ve Cas9 ve M2rtTA plazmid 5 bir çift elektroporatlanmıştır. Şekil 2A ve B tasarım ve iCas9 hPSC klonal hatları oluşturmak için tüm prosedürü hedefleme ayrıntılı donör vektörünü göstermektedir. (- Şekil 2C, 12 gün elektroporasyon sonra 10) antibiyotik seçimi sonrasında, yeterli büyüklükte ve tipik hPSC morfolojisi sergileyen tek hücre kökenli klon çekilecek hazırdı. Güney (Şekil 2D) 5 blot tarafından doğrulanmadı olarak genellikle ~ klonların% 50 doğru, rastgele entegrasyonlar olmadan hedeflenir. Rasgele entegrasyon doksisiklin tedavi yokluğunda Cas9 sızdıran ifade neden olabilir.

Verimli Genetik MiCRISPR Platformu Kullanma hPSCs içinde odification

kurulan iCas9 hPSCs yılında Cas9 doksisiklin tedavisi ile ifade edilir ve DSBs üretir transfekte gRNAs tarafından hedef mahaline yönlendirilmelidir. Onarım şablonunun yokluğunda, NHEJ aracılığıyla gerçekleştirilen DNA onarımı genellikle Gen bozma ya nakavt neden indeller oluşturur. Onarım şablon (örneğin, bir ssDNA donör) varlığında HDR bir vahşi tip hPSC arka bir hastaya özgü mutasyon oluşturma veya hastaya bir hastalık ile ilişkili genetik varyant düzeltilmesi kadar kesin genetik değişiklikler için kullanılabilecektir türetilmiş iPSCs (Şekil 3A). Bu iCRISPR sistemini kullanarak klonal mutant hatları oluşturmak için 1 ay ~ alır. iCas9 indüksiyon ve gRNA transfeksiyon sonrası T7EI ve / veya RFLP analizleri Cas9 kesme verimliliğini değerlendirmek için kullanılmıştır, ve transfekte hücreler, daha sonra ~ düşük yoğunluklu (10 cm'lik kaplar içine tek hücreler olarak 500 tohumlanmıştır - 2, 000hücre / 10 cm çanak). 10-12 gün sonra, tek hücreden türetilmiş klon genişleme ve daha fazla karakterizasyon (yani, genotipleme ve Western lekeleme yolu) (Şekil 3B) 96 çukurlu bir levhanın gözleri içine yerleştirildi. ICRISPR-aracılı gen nakavt yüksek verimli olduğu için, herhangi bir seçim işlemi yer almaktadır ve genellikle 20-50% bialelik mutantlar kolay (Şekil 3C) 5 elde edilebilir. verimli ve hassas genetik değişiklikler için, gRNAs (genom dizisinin küçük ama belirli bir değişiklik için) belirli bir dizi değişiklik taşıyan bir ssDNA verici ile birlikte transfekte edilir. Çoğu zaman, tadil edilmiş allellerinde yeniden kesilmesini önlemek için, veya PAM sekansını (Şekil 3B) 'de yakın sessiz bir mutasyona dahil edilmesi önerilmektedir. Bu sistem ile, ~ iki allel ek değişiklikler olmadan istenen HDR aracılı genom modifikasyonu taşıyan klonların% 10 (Şekil 3E) elde edilir. Hızlı ve piCRISPR platformu kullanarak hPSC genomunun recise modifikasyonu bize hızlı ve verimli insan gelişimi ve hastalık eğitimi için model olarak hizmet hPSC çizgiler yapmak için izin verir.

Glukoz duyarlı β-benzeri hücrelere karşı hPSCs etkin Farklılaşma

hPSC pankreas farklılaşma son ilerlemeler yakından pankreas embriyo gelişimini özetlemek protokollerin geliştirilmesini sağladı. Ayrım hPSCs ilk önce PDX1 + erken pankreas progenitörlerin (PP1) ve PDX1 + NKX6.1 + sonra pankreatik progenitör hücreleri (PP2) içerisine kesin endoderm olarak ve son olarak, 20 glikoz-tepkimeli β-benzeri hücreler 16, 17, 19 ayrışmıştır , 23, 24. Bu protocOLS daha güvenilir bir PDX1 + NKX6.1 + pankreas progenitörlerin ve glukoz-duyarlı β-benzeri hücreler 9 oluşturmak için optimize edilmiştir. Şekil 4A farklılaşma her aşamasında kullanılan detaylı kimyasal takviyeleri gösterir. Genellikle, 2 gün, ilk Hücre Ekimi takip eden yaklaşık% 80 konflüansa HUES8 hPSCs (Şekil 4B) farklılaşmasını başlangıç için idealdir. birkaç farklı ekme yoğunluğunun test yüksek oranda, her özel hücre hattı için optimize durum keşfetmek için tavsiye edilir. Genellikle, en az% 75 FOXA2 + PP2 aşamasında DE aşaması ve% 40 PDX1 + NKX6.1 + hücreleri ve + hücreleri elde edilebilir SOX17 (Şekil 4C). S5 aşamasında hücre agrega etrafında bir aura gibi şekil mevcudiyeti NKX6.1 + CPEP + glikoz-tepkimeli β-benzeri hücreler (Şekil 4D daha fazla farklılaşması için önemli olan hücre iyi bir hayatta kalma, bir göstergesidir ). Bu protokol, insan pankreatik d araştırılması için de faydalıdıdr Bir tabak evelopment ve hastalık.

figure-results-1
Şekil 1. hPSC Kimyasal Tanımlı ve Besleyici serbest Bakım ve IMEF Besleyiciler gelen Kültür Adaptasyon. (A) hPSCs Temsilcisi görüntüler, 4. günde VTN IMEF besleyici ya da split hazır kültüre. (B) bir IMEF besleyiciden besleyici içermeyen kültür içine uyum ilk geçişi sırasında hPSCs tipik morfolojisi. IMEF besleyiciler kültüre Gün 4 hPSCs ROCK inhibitörü ile kimyasal olarak tanımlanmış ortam içinde VTN kaplı plakalar üzerinde bölünmüş ve ekildi. bölme oranı IMEF besleme koşullarında kültürü için her zaman bölme oranı ile aynı olmuştur. orta ROCK inhibitörü olmadan her gün değiştirildi. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1 ">:" keep-together.within sayfa = fo "ve_content figure-results-2
ICas9 hPSC Hatları Şekil 2. Nesil. (A) iCas9 hPSC serilerinin jenere edilmesi için bir strateji hedefleme. Puro-Cas9 verici ve neo-M2rtTA donör AAVS1 TALENS bir çift insan AAVS1 lokusuna hedeflenmiştir. Elektroporasyon, antibiyotik seçimi, koloni toplama ve genişleme ve hücre hattı karakterizasyonu dahil olmak üzere tüm hedefleme işlemi, (B) Şemalar. Elektroporasyon sonra 12 gün - (C) Temsilci tek hücre klonu hazır yaklaşık 10 at çekilecek. (D) iki donör plazmid ek entegrasyon olmadan doğru hedeflenmiş klonları tanımlamak için Southern blot örnekleri. Doğru klonlar kırmızı olarak işaretlenmiştir. (A) ve (D) izni ile, Referans 5 uyarlandı.ig2large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
ICRISPR Sistemi Kullanarak hPSCs Şekil 3. Verimli Genetik Modifikasyon. Gen knockout mutant ya iCRISPR sistemi kullanılarak hassas gen modifikasyon üretimi için (A) Şemalar. (B) Hedefleme prosedürü ve klonal çizgi kurulması. HPSCs 9 NHEJ (C) içinden gen nakavt verim. Belirli bir nükleotid modifikasyonu taşıyan bir ssDNA'nın (D) tasarımı. P, kırmızı: hastaya özgü mutasyon; Yeşil X: sessiz mutasyon. (E) HDR-aracılı kesin nükleotid değişiklik Verimlilik. GATA6 lokusunda (belirli bir nükleotid C> T mutasyonu nedeniyle) kesin bir R456C mutasyon iCRISPR sistemi kullanılarak tanıtıldı.(Daha detaylı bilgi için 5 Referans bakınız). (C) ve (E) izinlerine sahip, sırasıyla Referans 9 ve Referans 5, uyarlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Glikoz-duyarlı Pankreas β-benzeri hücreler içine Şekil 4. Yönetmen hPSC Farklılaşma. Farklılaşma her aşamasında takviye kimyasallarla detaylı farklılaşma protokolünün (A) Şemalar. farklılaşma sırasında ya aktive edilir sinyal yolları sırasıyla yeşil veya kırmızı vurgulanır. CHIR: GSK3 inhibitörü; GDF8: büyüme farklılaşması faktörü 8'in veya miyostatin, bir TGF-beta protein ailesi üyesi; HH: Kirpi; DE: Kesin endoderm; PP1:PDX1 + erken pankreatik progenitör; PP2: PDX1 + NKX6.1 + sonra pankreas progenitör. (B) Tipik confluency - hPSCs 48 (70% 80) h hazır olduğunda farklılaşma başlatılması için tohumlama sonra. (C), kesin bir endoderm başarılı farklılaşmasını gösteren Örnek immünofloresan boyama ve görüntüler (DE) aşaması (FOXA2 ve SOX17 eş boyama), pankreatik progenitör aşaması (PP2: PDX1 ve NKX6.1 ko-boyama) ve glikoz-tepkimeli β- hücre aşama (NKX6.1 ve C-peptid ko-boyama) gibi. Genel olarak, β-benzeri hücre aşamasında% 10'dan fazla NKX6.1 + CPEP + hücreler elde en az% 75 FOXA2 + SOX17 + DE hücreleri ve% 40 PDX1 + NKX6.1 + PP2 hücreleri karşılık gelen bir aşamada talep edilmektedir. (D), hava-sıvı arayüzü kültüründe bir uç filtre zarı S5 aşamasında, bir hücre agrega tipik morfolojisi. Hayatta kalan hücreler (karanlıkta) agreganın merkezine göç ve kenarında bir aura benzeri bir yapı bırakmıştır. (A (D) izinleri ile Referans 9 uyarlandı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

plazmid Tutar
AAVS1-TALEN-L 5 ug
AAVS1-TALEN-R 5 ug
AAVS1-Puro-iCas9 40 ug
AAVS1-neo-M2rtTA 40 ug

tablo 1

astar boya Sıra
T7F TAATACGACTCACTATAGGG
TracrR AAAAGCACCGACTCGGTGCC

Tablo 2

Tablo 3

Bileşen Tutar
GKD 2 O 35.5 uL
5x PCR reaksiyon tamponu 10 uL
dNTP karışımı (25 mM) 0.5 uL
T7F (10 uM) 1.25 uL
TracrR (10 uM) 1.25 uL
T7-gRNA IVT şablonu (250 nM) 1 pL
DNA polimeraz 0.5 uL
Toplam PCR reaksiyon karışımı 50 uL
PCR çevrim koşulları
Çevrim numarası doğasını değiştirmek tavlamak uzatmak
1 94 ºC, 2 dak
2-31 94 ºC, 20 s 60 ºC, 20 s 72 ºC, 1 dak
32 72 ºC, 2 dak

Tablo 4

Bileşen
T7 ATP 2 uL
T7 CTP 2 uL
T7 GTP 2 uL
T7 UTP 2 uL
T7 10x tampon 2 uL
T7 enzim karışımı 2 uL
PCR ile çoğaltılan şablonu 8 uL
Toplam in vitro gRNA transkripsiyon karışımı 20 uL
gece boyunca 6 saat boyunca 37 ° C de kuluçkaya bırakılır

Tablo 5

Bileşen Tutar (ul)
Saflaştırılmamış PCR Ürünü 8
Tampon 2 10x 2
Damıtılmış su (dH 2 O) 10

Tablo 6

DNA denatürasyonu ve hibridizasyon döngü koşulları
Sıcaklık süre termosikler koşulları
95 ° C 10 dakika
85 ° C 1 dakika 2 ° C / s 85 ° C Rampa
75 ° C 1 dakika 0.3 ° C / s 75 ° C Rampa
65 ° C 1 dakika 0.3 ° C / s 65 ° C Rampa
55 ° C 1 dakika 0.3 ° C / s 55 ° C Rampa
45 ° C 1 dakika 0.3 ° C / s 45 ° C Rampa
35 ° C 1 dakika 0.3 ° C / s 35 ° C Rampa
25 ° C 1 dakika 0.3 ° C / s 25 ° C Rampa
4 ° C Ambar

Tablo 7

sahne Gün medya ek
S1 d0 S1 GDF8
100 ng / ml 		CHIR-99.021
3 uM
d1 S1 GDF8
100 ng / ml 		CHIR-99.021
0.3 uM
d2 S1 GDF8
100 ng / ml
S1 ortamı: MCDB 131 + 1 x L-glutamin ilave +% 0.5 BSA + 1.5 g / l NaHCO 3, 10 mM Glukoz

Tablo 8

sahne Gün medya ek
S2 d3-d4 S1 SAA
0.25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		IWP-2
2.5 uM
S3 D5-d6 S3 SAA
0.25 mM 		FGF7
50 ng / ml 		SANT-1
0.25 uM 		RA
1 uM 		LDN
100 nM 		TPB
200 nM 		ITS-X
1: 200
S4 D7-D9 S3 SAA
0.25 mM 		FGF7
2 ng / ml 		SANT-1
0.25 uM 		RA
0.1 uM 		LDN
200 nM 		TPB
100 nM 		ITS-X
1: 200 		IWP-2
2.5 uM
S3 ortamı: MCDB 131 + 1 x L-glutamin ilave +% 2 BSA + 2.5 g / L NaHCO 3, 10 mM Glukoz

Tablo 9

sahne Gün medya ek
S5 d10-d12 S5 T3 1 uM ALK5i II 10 uM SANT-1 0.25 uM RA 0.05 uM LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 uM Heparin 10 ug / ml
S6 d13- d19 S5 T3 1 uM ALK5i II 10 uM GSiXX 100 nM LDN 100 nM ITS-X 1: 200 ZnSO4 10 uM Heparin 10 ug / ml
S7 d20- D33 S5 T3 1 uM ALK5i II 10 uM N-Cys 1mM Trolox 10 uM R428 2 iM ZnSO4 10 uM Heparin 10 ug / ml
S5 ortamı: BlaR + 1x L-glutamin ilave +% 2 BSA + 1.5 g / l NaHCO 3 + 20 mM glikoz
ITS-X 1: 200

Tablo 10

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yaratma Mutant Hatları Zaman Hususlar

genom düzenleme için CRISPR / Cas sistemlerine dayanan son yaklaşımlar başarılı hedefleme yol açmıştır rağmen, daha etkili ve evrensel bir platform gen fonksiyonu analizleri daha büyük ölçekli tercih olacaktır. ICRISPR platformu ilgi 5, 9 herhangi bir gen mutasyonu tanıtmak için hızlı ve etkili bir yöntem sunmaktadır. İlk olarak, PCR bazlı gRNA sentez yöntemi zaman alıcı klonlama adımları olmadan bir gün içinde dizilmiş biçimde gRNAs yüzlerce üretimine olanak sağlar. İkinci olarak, iCas9 hPSCs doksisiklinin indüklenebilir Cas9 ifadesi ile, gRNA transfeksiyon içeren adım iş yalnızca küçük bir miktar gerektirir, ve bu nedenle, çok sayıda gRNA hedefleme deneyleri eşzamanlı gerçekleştirilebilir. Bizim sisteminin analizi ile ulaşılabilir Üçüncü olarak, yüksek hedefleme nedeniyle verimlilik ~ 24 - transfekte gRNA başına 48 koloni suff olmalıdırverimlilik, hedef lokusu bağlı olarak değişir, ancak icient, tek bir gen birden fazla monoallelik ve bialelik mutan çizgileri kurmak. Eğitimli bir kişinin mekanik bir oturuşta 384 koloni (4 x 96-yuvalı plakalar) almak için bir tahlil mikroskobu altında yaklaşık 4 saat için hangi için mümkün olduğu için, eğitilmiş bir kişide 12 genleri etki mutan çizgileri oluşturmak için beklenebilir 12 ay. Kısa bir süre içinde hPSC mutantlarının akıcı üretimi gelişim sürecini 9 düzenleyen birbiriyle etkileşim, transkripsiyon faktörleri ve / veya sinyal yolu bileşenlerinin bir dizi sistematik analiz için izin verir. Ayrıca, verimli çoklanmış gen hedefleme de genetik etkileşmeler altında yatan karmaşık insan özelliklerini araştıran kapıyı açar.

Hassas Genetik Değişiklikler Üretimi

kolayca erişilebilir somatik hücre tipinden hastaya özgü iPSCs türetilmesi s ve hastalık ilgili hücre tiplerine farklılaşma hastalıkla ilişkili mutasyonlar işlevsel doğrulama için büyük bir fırsat sağlar. Ancak, bireyler arasındaki genetik arka planda önemli değişkenlik, hastalardan iPSCs arasında sağlıklı donörlerden doğrudan karşılaştırmalar bir arka plan etkilerinden hastalık fenotipleri ayırt izin vermeyebilir. Nedenle, tekrar doğal tipte sekansa hastalığı mutasyon düzelterek izogenik kontrol iPSCs oluşturmak için ya da başkalarına 25, 26 tarafından önerilen, bir vahşi tip hPSC plana hastaya özgü mutasyonların katılması için gereklidir. -kaybı fonksiyonu (boş) mutasyona ilave olarak, bir anda daha kesin olarak, hypermorphic hypomorphic, neomorphic, veya baskın negatif hasta da dahil hPSCs endojen mahaline, bir hastaya özgü sekansı değiştirmelerine tanıtım yoluyla hastalık mekanizmalarını incelemek olabilir mutasyonlar.

o NHEJ-aracılı DNA tamiri çok daha az etkili olduğu. Bir onarım şablonunun varlığında DSB onarım için HDR istihdam Hassas genetik modifikasyon ntent ">, hastaya özgü mutasyon, bir ilaç seçimi kaset ve homoloji kolları içeren bir donör plazmid en yaygın olarak kullanılan Cre-loxP ve FLP-FRT sistemleri geride bırakırken, daha önce tamir şablonuna 2 olarak kullanılmaya başlanmıştır. ilaç seçimi ve hastaya özgü mutasyon doğrulanmasının ardından, ikinci bir adım genelde. ilaç seçimi kasetini çıkarmak için gerekli olan endojen mahal kalıntı sırası, piggyBac transpozonun kullanımı, ilaç seçme kasetinin 27 kesintisiz uzaklaştırılması için izin vardır. son zamanlarda, kısa bir ssDNA şablonları tasarlanmış DNA endonükleazlar 28 verimli HDR desteklemek için gösterilmiştir. bir verici plazmid ile karşılaştırıldığında , ssDNA doğrudan sentezlenmiş ve böylece zaman alıcı klonlama adımı circumvents edilebilir. Burada olması vardırgösterilen en, bu ko-transfekte homoloji yönelik onarım indükleme gRNA ve ssDNA şablonu iCRISPR yüksek verimlilik, spesifik nükleotid modifikasyonlar için kullanılabilir göre. Bu, aynı zamanda, insan hastalığı mutasyonlar modelleme ve potansiyel terapötik müdahale için, bu hastalıkla ilişkili mutasyonlar düzeltilmiştir protein, fonksiyonel alanları içinde önemli bir nükleotid rolü kesme değildir için önemlidir. Nedeniyle her diyabet gibi karmaşık ve multigenik hastalıkları modelleme, çoklu dizi varyantları ile ilişkili duyarlılık mahallerinin çok sayıda genetikçileri için bir meydan okuma olmuştur. iCRISPR platformu alelik dizi hızlı üretimi için ya multiplexable gen hedefleme için serbest olduğu gibi, ya tek başına ya da izogenik arka ile kombinasyon halinde, birden çok hastalıkla ilişkili lokus araştırma kolaylaştırabilir.

Etkinlikleri ve Off-hedef Etkileri Hedefleme

Sahibiz T7E1 ve RFLP tahlil sonuçları ve sıralama tarafından tespit mutant satır sayısı arasında iyi bir korelasyon bulunmuştur. Bu klonal hatlarının kurulması ile paralel olarak bu analizleri gerçekleştirerek önemini vurgulamaktadır. En tek gen hedefleme deneyleri, genomik lokusları bağlı olarak değişebilir elde hedefleme verimleri 20 da - klonların% 60 'iki allel mutasyona uğramış bulunmuştur (dahil kare kaymalı mutasyonlar-çerçevede) 9. Çoklanmış gen hedefleme gerçekleştirildi durumlarda,% 5-10 verimliliği ile üçlü bialelik mutant klon 5 elde edilmiştir. % 10 5 - çeşitli genlerin ssDNA aracılı HDR da knock-1 arasında değişen klonların homozigot elde verimliliği ile, kesin genetik değişiklikleri elde etmek üzere gerçekleştirilmiştir. Aynı gRNA hedef dizisi paylaşmayan potansiyel hedef dışı siteleri, hPSCs CRISPR / Cas ile herhangi bir mutasyon Çalışma henüz tespit edilecek olanlass = "xref"> 5, 9, 12. Yeni bir çalışmada gerçekleştirilen tüm genom sıralaması da CRISPR / Cas 29 kullanılarak oluşturulan klonal hPSC hatlarında önemli off-hedef mutasyonları tespit etmek başarısız oldu. Bununla birlikte, hedef dışı etki bölgelerinde mutasyonlarla fenotipleri karıştırıcı herhangi bir potansiyel etkisi en aza indirmek için, aynı gen içinde farklı dizileri hedef alan en azından iki bağımsız gRNAs kullanan bağımsız mutant sıraları oluşturmak için önerilmektedir. birden fazla satır gözlenen benzer fenotipleri esas fenotip bir off-hedef etkisinden geldiğini olasılığını ekarte olabilir farklı gRNAs kullanılarak oluşturulan.

Besleyici bağımlı Bağımsız Kültür ve Hedefleme karşı

hPSC kültürü için geleneksel yöntemler hayvan eşya içeren serum veya serum değiştirme içeren ortamda besleyici hücreler üzerindeki bakım ve genişleme dahilsığır serum albümini gibi leri,. Besleyici hücreler, serum, serum yerine ve tüm albumin karmaşık, tanımlanmamış bileşenleri içerir ve önemli toplu değişkenlik göstermektedir. besleyici içermeyen ve kimyasal olarak tanımlanmış durumuna uyarlanması anlamlı ve daha da önemlisi, farklılaşma deneyleri tutarlılığını artırır hPSC bakım çalışmalarını azaltır. Şu anda, tam olarak tanımlanmış kültür koşullarında 30 kültüre hPSCs üzerinde genom düzenleme prosedürleri tarif çok az sayıda çalışma vardır. Biz gRNA transfeksiyonu ve klonal yerleştirme besleyici bağımlı kültür koşullarına göre besleyici içermeyen koşullar uygulandı zaman verimliliği hedefleme yüksek CRISPR bulduk. Bu koloni oluşumu için transfeksiyon ve tek hücreli tohumlama sonra artan hücre hayatta kalması nedeniyle olduğuna inanıyoruz. Ayrıca, besleme hücreleri, daha önce bu şekilde transfeksiyon verimini düşürmek, transfeksiyon reaktifleri ayırmak için gösterilmiştir.

birleştirmeYönetmen Farklılaşma ile Genom Düzenleme

Önceki farklılaşma protokolleri insülin pozitif hücrelerin sadece küçük bir bölümünü ortaya çıkarmıştır, çoğunluğu polyhormonal ve fetal endokrin hücreleri 23 benziyordu. Son yıllardaki gelişmeler, daha olgun glikoz-tepkimeli beta benzeri hücreler 16, 17, 19, 20 içine hPSCs farklılaşmasını izin vermiştir. Rutin HUES8 hPSCs 9 kullanarak en az% 75, kesin endoderm hücreleri,% 40 PDX1 + NKX6.1 + pankreas progenitörler, ve yaklaşık% 20 NKX6.1 + CPEP + glikoz-tepkimeli beta benzeri hücreler elde edebilir. iCRISPR genom düzenleme sistemi ile kombine edildiğinde, bu daha sağlam farklılaşma protokolü pankreas farklılaşma pankreas progenitör ve endokrin aşamaları için çok önemli transkripsiyon faktörlerinin analizi kolaylaştırmıştır. Bu yapacakmümkün, gelecekteki çalışmalarda, diyabet 9 altında yatan mekanizmaların içine fonksiyonel doğrulama ve soruşturma için aday hastalık genlerinin çok sayıda incelemek.

Gelecek Uygulamalar veya Tarifi

Böyle aracılığıyla muhabir allellerin oluşturulması gibi daha karmaşık genomik değişiklikler, üretilmesini kolaylaştırabilir Bizim iCRISPR sistemi uzun donör DNA şablonları kodlayan protein etiketleri veya floresan gazetecilere 12 kullanarak hedef geni HDR-aracılı. Bu yazıda sistemde elde verimliliği hedef yüksek bir CRISPR için göstermiştir, bu işlem, bundan başka ilaç seçimi 12 gerek kalmadan, hPSCs gerçekleştirilebilir. Ayrıca, hedef çoğullamalı gen biz bu işin 31 ilk örneği olduğuna inanıyoruz bizim son çalışmada gösterildiği gibi, altta yatan karmaşık insan hastalık genetik etkileşimleri araştırmak için kullanılabilir. iCRISPR ayrıca promoterler ve arttırıcı madde olarak düzenleyici bölgeler, silme oluşturarak ya da kodlayıcı olmayan RNA'lar bölgesi ya da genin gen düzenleyici kontrol anlamak için kullanılabilir. etkin bir şekilde iCRISPR kullanılarak düzenleme mutantlan oluşturmak için, gRNAs de dahil olmak üzere, bir DNA-bağlama proteini bağlanma bölgesini parçalar için tasarlanmıştır, ancak bazal transkripsiyon makine ya da dokuya özgü bir transkripsiyon faktörü ile sınırlı değildir edilebilir. ssDNA şablonu aracılı HDR de özel protein bağlama siteleri mutasyona kullanılabilir. Son olarak, bir in vitro farklılaşma protokolü ile kombine edildiğinde daha fazla optimizasyon pluripotense fenotipleri veya hastalık fenotiplerinin daha yüksek verim, genetik analizler için hPSCs içinde iCRISPR platformun kullanılması mümkün olabilir öngörmektedir. Bu iCRISPR aracılı çalışmalar aday hastalıkla ilişkili genlerin ve fonksiyonel alaka çalışmaların daha hızlı belirlenmesi için izin verebilir.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma NIH / NIDDK (R01DK096239) ve New York Eyalet Kök Hücre Bilimi (NYSTEM C029156) tarafından kısmen finanse edildi. ZZ Sloan Kettering Enstitüsü Kök Hücre Biyolojisi Merkezi'nden NYSTEM doktora sonrası burs tarafından desteklenmiştir.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Kimyasal olarak tanımlanmış ortam (E8)Thermo Fisher ScientificA1517001Esansiyel 8 bazal ortam ve Esansiyel 8 takviyesi dahildir
Vitronektinin kesik rekombinant insan formuThermo Fisher ScientificA14700
ROCK inhibitörü Y-27632Selleck ChemicalsS1049
Ayrışma reaktifi (TrypLE Select enzimi)Thermo Fisher Scientific125630291x, hayvansal kökenli içermeyen, rekombinant enzim
G418 SülfatThermo Fisher Scientific10131035Geneticin Seçici Antibiyotik
Puromisin dihidroklorürSigma-AldrichP8833Puromisin Seçici Antibiyotik
DNA Polimeraz (Herculase II Fusion)Agilent Technologies600679PCR kiti
MEGAshortscript T7 Transkripsiyon kitThermo Fisher ScientificAM1354
MEGAclear Transkripsiyon Temizleme KitiThermo Fisher ScientificAM1908
Doksisiklin hyclateSigma-AldrichD9891
Opti-MEM ortamıThermo Fisher Scientific31985062 Azaltılmış Serum Ortamı
Lipofektamin RNAiMAX Transfeksiyon ReaktifiThermo Fisher Scientific
DNeasy Kan & Doku KitiQIAGEN69504Genomik DNA ekstraksiyon kiti
Proteinaz KRoche3115879001
MCDB 131 ortaThermo Fisher Scientific10372-019
BLAR ortaThermo Fisher ScientificYayınlanmış bir formülasyonla ısmarlama (Rezania et al.< / em >, 2014)
L-glutamin takviyesi (GlutaMAX)Thermo Fisher Scientific35050061
NaHCO3Thermo Fisher Scientific144-55-8
GlikozSigma-AldrichG8769
BSALAMPIRE Biyolojik Laboratuvarları7500855Yağ asidi içermez
GDF8PeproTech120-00
CHIR-99021Kök04-0004GSK-3 inhibitörü
L-Askorbik asitSigma-AldrichA4544C Vitamini
FGF7R & D Sistemleri251-KG
SANT1Tocris Bioscience1974Kirpi inhibitörü
RASigma-AldrichR2625Retinoik asit
LDNStemgent04-0019BMP inhibitörü
IWP-2Tocris Bioscience3533Wnt antagonisti ve nbsp;
ITS-XThermo Fisher Scientific51500-056
TPBEMD Millipore565740-1MGPKC aktivatörü
3,3 ', 5-Triiyodo-L-tironin (T3)Sigma-AldrichT6397
ALK5i IIEnzo Yaşam BilimleriALX-270-445ALK5 inhibitörü II
ZnSO4< / sub>Sigma-AldrichZ0251
HeparinSigma-AldrichH3149
GSiXX EMDMillipore565789Gama sekretaz inhibitörü XX, NOTCH sinyal inhibitörü
N-Cys (N-asetil sistein)Sigma-AldrichA9165
TroloxEMD Millipore 648471E Vitamini analogu
R428Selleck KimyasallarıS2841AXL reseptörü tirozin kinaz inhibitör
24 mm CorningYaşam Bilimleri3414
Gen Pulser Xcell Elektroporasyon SistemiBio-Rad1652660
0,4 cm Elektroporasyon KüvetleriBio-Rad1652081
AAVS1-TALEN-LAddgene59025
AAVS1-TALEN-RAddgene59026
AAVS1-Neo-M2rtTAAddgene60843
AAVS1-Puro-iCas9Addgene58409
T7 Endonükleaz INEBM0302L
Tampon 2NEBB7002SNEBuffer 2
Uzun oligonükleotidEton Bioscience veya IDT
SOX17 antikoruR& D SistemleriAF19241:500
FOXA2 antikoruMillipore07-6331:100
CXCR4-APC antikoruR& D SistemleriFAB170A1:25
PDX1 antikoruR& D SistemleriAF24191:500
NKX6.1 antikoruDSHBF55A121:500
NKX2.2 antikoruDSHB74.5A51:100
NEUROD1 antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-10841:100
İnsülin antikoruDakoA05641:2.000
C-peptit antikoruDSHBGN-ID4-c1:2.000
Glukagon antikoruSigma-AldrichG26541:1,000
13778150

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Capecchi, M. R. Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century. Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).
  2. Zwaka, T. P., Thomson, J. A. Homologous recombination in human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 21 (3), 319-321 (2003).
  3. Eiges, R., et al. Establishment of human embryonic stem cell-transfected clones carrying a marker for undifferentiated cells. Curr Biol. 11 (7), 514-518 (2001).
  4. Kim, H., Kim, J. S. A guide to genome engineering with programmable nucleases. Nat Rev Genet. 15 (5), 321-334 (2014).
  5. González, F., et al. An iCRISPR Platform for Rapid, Multiplexable, and Inducible Genome Editing in Human Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 15 (2), 215-226 (2014).
  6. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  7. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  8. Braam, S. R., et al. Improved genetic manipulation of human embryonic stem cells. Nat Methods. 5 (5), 389-392 (2008).
  9. Zhu, Z., et al. Genome Editing of Lineage Determinants in Human Pluripotent Stem Cells Reveals Mechanisms of Pancreatic Development and Diabetes. Cell Stem Cell. 18 (6), 755-768 (2016).
  10. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  11. Carlson-Stevermer, J., et al. High-Content Analysis of CRISPR-Cas9 Gene-Edited Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 6 (1), 109-120 (2016).
  12. Zhu, Z., Verma, N., Gonzalez, F., Shi, Z. D., Huangfu, D. A CRISPR/Cas-Mediated Selection-free Knockin Strategy in Human Embryonic Stem Cells. Stem Cell Reports. 4 (6), 1103-1111 (2015).
  13. Mandegar, M. A., et al. CRISPR Interference Efficiently Induces Specific and Reversible Gene Silencing in Human iPSCs. Cell Stem Cell. 18 (4), 541-553 (2016).
  14. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  15. Rezania, A., et al. Production of functional glucagon-secreting alpha-cells from human embryonic stem cells. Diabetes. 60 (1), 239-247 (2011).
  16. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  17. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  18. Chen, S., et al. A small molecule that directs differentiation of human ESCs into the pancreatic lineage. Nat Chem Biol. 5 (4), 258-265 (2009).
  19. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  20. Russ, H. A., et al. Controlled induction of human pancreatic progenitors produces functional beta-like cells in vitro. EMBO J. 34 (13), 1759-1772 (2015).
  21. Zhu, Z., Gonzalez, F., Huangfu, D. The iCRISPR platform for rapid genome editing in human pluripotent stem cells. Methods Enzymol. 546, 215-250 (2014).
  22. Soh, C. L., Huangfu, D. CRISPR/Cas9-Mediated Mutagenesis of Human Pluripotent Stem Cells in Defined Xeno-Free E8 Medium. Methods in Molecular Biology. 1498, (2017).
  23. D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  24. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 29 (8), 750-756 (2011).
  25. Musunuru, K. Genome editing of human pluripotent stem cells to generate human cellular disease models. Dis Model Mech. 6 (4), 896-904 (2013).
  26. Hockemeyer, D., Jaenisch, R. Induced Pluripotent Stem Cells Meet Genome Editing. Cell Stem Cell. 18 (5), 573-586 (2016).
  27. Yusa, K., et al. Targeted gene correction of alpha1-antitrypsin deficiency in induced pluripotent stem cells. Nature. 478 (7369), 391-394 (2011).
  28. Chen, F., et al. High-frequency genome editing using ssDNA oligonucleotides with zinc-finger nucleases. Nat Methods. 8 (9), 753-755 (2011).
  29. Veres, A., et al. Low incidence of off-target mutations in individual CRISPR-Cas9 and TALEN targeted human stem cell clones detected by whole-genome sequencing. Cell Stem Cell. 15 (1), 27-30 (2014).
  30. Huang, X., et al. Production of Gene-Corrected Adult Beta Globin Protein in Human Erythrocytes Differentiated from Patient iPSCs After Genome Editing of the Sickle Point Mutation. Stem Cells. 33 (5), 1470-1479 (2015).
  31. Shi, Z. D., et al. Genome Editing in hPSCs Reveals GATA6 Haploinsufficiency and a Genetic Interaction with GATA4 in Human Pancreatic Development. Cell Stem Cell. , in press (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Genome EditingDirected DifferentiationHuman Pluripotent Stem CellsiCRISPR SystemCas9 ExpressionAAVS1 LocusT7E1 AssayPancreatic Beta CellsGlucose Responsive CellsHomology Directed Repair

Related Articles