Alginat Boncuklarda Memeli Hücre Kapsüllenmesinin Basit Bir Karıştırılmış Geminin Kullanımı

Memeli hücre kapsüllemesi, transplante edilen hücreleri immün rejeksiyon ^1'den korumak veya immobilize edilmiş hücre kültürü ^{2 , 3 , 4} için üç boyutlu bir destek sağlamak için bir araç olarak geniş olarak incelenmiştir. Aljinat boncuklardaki pankreatik adacık kapsüllemesi allogeneik ^{5 , 6} veya ksenogeneik ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} kemirgenlerde diyabetin tersine çevrilmesi için kullanılmıştır. Tip 1 diyabet tedavisinde kapsüllenmiş pankreatik adacık transplantasyonunun klinik öncesi ve klinik çalışmaları devam ediyor ^{13 , 14 , 15} . Transplantasyon uygulamaları veya daha büyük ölçekliİn vitro immobilize hücre üretimi, meme esaslı boncuk jeneratörleri genellikle kullanılır. Tipik olarak, alginat ve hücrelerin bir karışımı, bir damlacıkları oluşturmak üzere bir memeden pompalanır ve damlacıkların dış jelasyonuyla sonuçlanan, iki değerlikli katyonlar içeren karıştırılmış bir solüsyona düşer. Eş eksenli gaz akışı ^{16 , 17} , nozul titreşimi ¹⁸ , elektrostatik itme ¹⁹ veya dönen teller ²⁰ , meme ucunda damlacık oluşumunu kolaylaştırır.

Geleneksel boncuk jeneratörlerinin temel dezavantajları, sınırlı üretim ve yeterli boncuk oluşumuna neden olacak sınırlı çözelti viskozitesi aralığıdır ²¹ . Yüksek akış hızlarında, memeden çıkan sıvı, meme çapından daha küçük damlalar halinde parçalanır ve boyut kontrolü azalır. Verimi artırmak için çoklu nozullu boncuk jeneratörleri kullanılabilir, ancakMemelerin arasındaki akışın tekdüze dağılımı ve> 0.2 Pas çözeltilerin kullanımı problemlidir ²² . Son olarak, nozul esaslı cihazların hepsinin adacıklara bir miktar zarar vermesi beklenir, çünkü kullanılan memelerin çapı 100 um ila 500 um arasında iken insan adacıklarının ~% 15'i 200 um ^23'den büyük olabilir.

Bu videoda, damla damla yerine tek bir emülsifikasyon adımında damlacıkları oluşturarak memeli hücrelerini kapsüllemek için alternatif bir yöntem tarif ediyoruz. Boncuk üretimi basit bir karıştırma teknesinde yapıldığından, yöntem, düşük ekipman maliyetleri ile küçük (~ 1 mL) ila büyük ölçekli (10 ³ L aralıklı) boncuk üretimi için uygundur ²⁴ . Bu yöntem, boncuk oluşum süreleri kısa ( örneğin 20 dakika) olan geniş bir aljinat viskoziteleri aralığında yüksek küreselliklü boncuk üretimine olanak tanır. Bu yöntem başlangıçta Poncelet ve ark. Tarafından geliştirildi.l. ^{25 , 26'ya} bağlanır ve DNA ^27'yi , insülin ^29'u içeren proteinleri ²⁸ ve bakterileri ³⁰ hareketsiz hale getirir. Son zamanlarda bu yöntemleri pankreas beta hücre hatları ^{31 , 32} ve primer pankreatik doku ³² kullanarak memeli hücrelerinin kapsüllenmesine uyarladık.

Yöntemin prensibi, mineral yağı içerisindeki alginat damlalarından oluşan bir yağ içinde su emülsiyonu üretmek ve bunu takiben aljinat damlacıklarının iç jelleştirilmesini sağlamaktır ( Şekil 1 ). Önce, kapsülleyici ( örn., Hücreler), başlangıçtaki işlem pH'sında düşük çözünürlük ile ince taneli bir kalsiyum tuzu içeren bir aljinat solüsyonuna dağıtılır. Ardından alginat karışımı, bir emülsiyon oluşturmak üzere, genellikle biryüzey aktif madde. Memeli hücre kapsüllemesi durumunda, serumda bulunan bileşenler yüzey aktif maddeler olarak görev yapabilir. Daha sonra, pH, sulu faza bölünen yağda çözünür bir asit ilave ederek kalsiyum tuzunu çözündürmek için indirgenir. Mineral yağ / su bölme katsayısı <0.005 ³³ olan asetik asit yağda önceden çözülmüş, daha sonra yağ fazında karıştırıldığı emülsiyona ilave edilmeli ve sulu faza ³⁴ hızla bölünmelidir. Şekil 2 , asitleştirme ve iç jelasyon adımında gerçekleşen kimyasal reaksiyonları ve difüzyonu göstermektedir. Son olarak, kapsüllenmiş hücreler, faz ters çevirme, faz ayrımı, santrifüjleme, tekrarlanan yıkama adımları ve filtrasyon ile hızlandırılarak toplanır. Bu aşamalardan sonra, kalite kontrol analizleri, in vitro hücre kültürü ve / veya kapsüllenmiş hücrelerin transplantasyonu için boncuk ve hücre örneklemesi yapılabilir.

Şekil 1: Memeli hücreleri kapsüllemek için emülsifikasyona dayalı sürecin şematik. Boncuklar önce bir aljinat, hücre ve CaCO3 karışımının mineral yağı içerisinde emülsiyon haline getirilmesi (şemada adım 1 ve 2) ile üretilir ve asetik asit (adım 3) ilave edilerek iç jelleşmeye başlar. Daha sonra jel haline getirilmiş boncuklar, faz ters çevirme tetikleyicisine sulu bir tampon eklenerek (basamak 4), ardından santrifüj ve yağ aspirasyonu (basamak 5) ve daha sonra süzme (adım 6) vasıtasıyla yağdan ayrılır. Son olarak, filtre üzerinde toplanan boncuklar , in vitro kültür veya transplantasyon için hücre kültür ortamına aktarılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: İç jelleşme sırasında oluşan reaksiyonlar ve difüzyon basamakları. (1) Asetik asit organik faza eklenir ve konveksiyon ile aljinat damlacıklarına taşınır. (2) Asetik asit sulu faza bölünür. (3) Suyun bulunduğu yerde asit, dağılmakta ve koyu mavi renkte tasvir edilen CaCO ₃ tanelerine ulaşmak için dağılmaktadır. (4) H ⁺ iyonları, Ca ²⁺ iyonlarını salan CaCO ₃ içinde Ca ²⁺ iyonlarıyla değiştirilir. (5) Kalsiyum iyonları, reaksiyona girmemiş aljinatla karşılaşıncaya kadar dağılır ve alginat zincirlerinin iyonotropik çapraz bağlanmasına yol açar. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Geleneksel nozul tabanlı hücre kapsülleştiricilerinin aksine, geniş bir boncuk boyut dağılımıKarıştırılmış emülsifikasyonda damlacık oluşum mekanizması nedeniyle bu prosesten kaçınılmalıdır. Uygulamaların bir alt kümesi için bu boncuk boyut dağılımı sorunlu olabilir. Örneğin, küçük boncuklarda boncuk yüzeyinde daha büyük bir hücre fraksiyonu açığa çıkabilir. Besin maddesi ( örneğin oksijen) sınırlamaları endişe veriyorsa, bu kısıtlamalar daha büyük boncuklarda daha da artabilir. Karıştırılan emülsiyonlaşma yönteminin bir avantajı, ortalama boncuk boyutunun, emülsiyonlaşma aşamasında ajitasyon oranını değiştirerek kolayca ayarlanabilmesidir. Geniş boncuk boyutu dağılımı boncuk boyutunun kapsüllenmiş hücre performansı üzerindeki etkisini incelemek için de kullanılabilir.

Emülsifikasyon ve iç jelleştirme ile memeli hücresi kapsüllemesi, bir boncuk jeneratörü ile donatılmamış laboratuarlar için ilginç bir alternatiftir. Ayrıca, bu yöntem kullanıcılara işleme süresini azaltma veya çok düşük veya çok yüksek aljinat konsantrelerinde boncuk oluşturma seçeneği sunarations.

Aşağıda özetlenen protokol, hücrelerin, 10 mM 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) tamponu içerisinde hazırlanan 10.5 mL% 5 alginat çözeltisi içerisinde nasıl kapsüle edileceğini açıklamaktadır. Aljinat, transplantasyon dereceli LVM (düşük viskoziteli yüksek mannuronik asit içeriği) ve MVG (orta viskozite yüksek guluronik asit içeriği) aljinatın bir 50:50 karışımından oluşur. 24 mM nihai konsantrasyonda kalsiyum karbonat, fiziksel çapraz bağlayıcı madde olarak kullanılır. Emülsiyonu asitleştirmek ve iç jelleştirmeyi tetiklemek için asetik asit kullanılırken hafif mineral yağ organik fazı oluşturur. Bununla birlikte, aljinat türü ve bileşimi ve seçilen işlem tamponu istenilen uygulamaya ³² bağlıdır. Bu protokolle boncuklar üretmek için çeşitli alginat türleri (bkz. Tablolar) kullanılmıştır.

1. Aljinat Solüsyonunu, CaCO ₃ Süspansiyonu ve Asitlenmiş Yağı'yı hazırlayın

1. İşlem tamponu ve ortamını hazırlayın.
   1. 10 mM HEPES, 170 mM NaCl kullanarak yüksek konsantrasyonlu aljinat boncukları oluşturmak için kullanılan tipik işlem tamponunu hazırlayın. PH'ı 7.4'e ayarlayın.
   2. Tipik kültür ortamı,% 10 fetal sığır serumu (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / mL penisilin ve 100 mg / mL streptomisin içeren Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile hazırlayın.
2. Aljinat stok solüsyonunu, boncuklardaki nihai arzu edilen konsantrasyonun 1,17 katı olacak şekilde hazırlayın.
   1. İlk olarak, uygun miktarda aljinat tozu tartın. Örneğin, 50:50 LVM ve MVG alginat ile% 5 aljinat nihai konsantrasyonunu elde etmek için, 0.583 g LVM aljinat tozu ve 0.583 g MVG aljinat tozunu birleştirerek toplam 1.17 g sodyum aljinat tartın.
   2. 20 mL işlem tamponunu otoklav içine yerleştirinManyetik bir karıştırma plakası üzerinde yıkanabilir cam kavanoz ve ~ 200 rpm'de çalkalandı. Sodyum alginat tozunu aşamalı olarak çözeltiye ilave edin.
   3. Çözeltiyi gece boyunca düşük bir hızda karıştırmaya bırakın. Gerekirse, şişeyi karıştırma plakasına sabitleyin.
   4. Çözelti tam olarak çözülürse şişeyi bir döner mikser üzerine tutturun ve 24 saat daha 37 ° C'de karıştırmaya devam edin.
   5. Aljinat solüsyonunu, yarım dolmadan daha az olan bir kapta 30 dakika süreyle otoklavlayarak sterilize edin. Çözümü almadan önce sıcaklığın 60 ° C'nin altına düşmesine izin verin.
   6. Gerekirse, viskozite yeterince düşük kaldığı sürece, aljinat solüsyonunu oda sıcaklığına ulaşmadan önce otoklavlamadan kısa bir süre filtreleyerek parçacıkları çıkarın.
3. İç jelleşme için istenen son konsantrasyonun 21 katında kalsiyum karbonat süspansiyonu hazırlayın.
   1. CaCO ₃ tozunu tartın. Örneğin, reklamD 1 g CaCO3 ila 20 mL işlem tamponu ile son jelleştirici madde konsantrasyonu olarak 24 mM CaCO3 elde edildi.
   2. CaCO ₃ süspansiyonunu 30 dakika süreyle otoklavlayın.
      NOT: CaCO ₃ konsantrasyonu, bikarbonat-CO ₂ dengesine bağlı olarak zamanla değişecektir. 10'dan fazla kapsülleme prosedürü için aynı stok CaCO ₃ süspansiyonunu kullanmaktan kaçının.
4. Emülsiyonlaşma işlemi için kullanılan karıştırılmış tekneyi otoklavlayın. Kullanmadan önce, döndürücü şişede kalan yoğunlaşmış su izlerini kaldırın.
5. Emülsiyon haline getirme işleminden hemen önce asitlendirilmiş yağ hazırlayın. 50 mL konik tüp içine yerleştirilen 11 mL mineral yağı başına 44 μL asetik asit çözündürün.
   NOT: Genel bir hata, asetik asidin tam olarak çözülmesidir. Az miktarda asetik asit pipetle atmaktan kaçının ve asetik asitin tekrarlanan vorteksleme ile yağda tamamen çözünmesini sağlayın.
   DİKKAT: asetik asit toksiktir. D uçucu asit. Bu reaktifi duman kaputunun altında tutun ve asetik asit / yağ solüsyonunu emülsifikasyon aşamasına gelinceye kadar kapalı bir kapta tutun. Daha fazla bilgi için bu reaktife ilişkin MSDS bilgilerine bakın.
6. Tüm çözümlerin hücre kapsüllemeye geçmeden önce oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin.

2. Aljinat Boncuk Üretimi, Emülsifikasyon ve İç Jelasyon ile

1. 10 mL hafif madeni yağ spinner şişesine yerleştirin ve düşük devir hızında (bu videoda kullanılan spinner şişesi için 250 dev / dak) ajitasyona başlayın.
2. Proses için kullanılan hücreler yapışık kültürlerden kaynaklanıyorsa, hücreleri askıya almak için tripsin uygulayın. FBS içeren ortam veya tripsin önleyicisi ekleyerek reaksiyonu durdurun ve hücre sayımı için bir numune toplayın.
   1. Daha önce tarif edildiği gibi bir hemositometre veya otomatik bir hücre sayacı kullanarak Tripan mavisi lekelenmesinden sonra hücre konsantrasyonunu ve yaşayabilirliğini belirleyinEşek = "xref"> 32.
3. Hücreleri 300 xg'de 7 dakika boyunca santrifüjleyin ve hücre immobilizasyonu için arzu edilen ortamda bir kez yıkayın. Bu ortamın, FBS veya sığır serum albümini (BSA) gibi emülsiyon yapıcılar içerdiğinden emin olun. Örneğin,% 10 FBS içeren DMEM kullanın.
4. Boncuklarda istenilen nihai konsantrasyonun 10.5 misli elde etmek için hücre ortamını aynı ortamda tekrar süspanse edin.
5. 1.1 mL, 10.5 kat konsantre hücre stoğu, 9.9 mL aljinat solüsyonuna ilave edin. Ardından CaCO ₃ süspansiyonundan 550 μL ekleyin ve CaCO _3'ün eşit dağılımını sağlamak için steril bir spatula ile karıştırarak karıştırın.
6. Alginat, hücre ve CaCO ₃ karışımının bir şırınga yardımıyla ajitasyon yağına 10.5 mL'lik derhal aktarılması.
   NOT: Yüksek derecede yapışkan solüsyonlar için, havadaki kabarcıkları önlemek için karışımı aspire edin ve yavaşça çekin. Bazı durumlarda, ajiteyi önlemek için karışıma şişeyi eklerken ajitasyonun durdurulması tercih edilirAljinat sürüklenmesini çark miline yerleştirin.
7. Alginat, hücre ve CaCO ₃ karışımını yağa ilave ettikten hemen sonra ajitasyon oranını arttırın.
   NOT: Burada kullanılan% 5 LVM: MVG aljinat için , in vitro kültür ³⁵ için uygun yaklaşık 900 μm çapında boncuklar üretmek üzere 1025 rpm'lik bir dönüş hızı uygulanmıştır. Daha önceki döngüler ^{25 , 32'de} açıklandığı gibi, daha yüksek dönüş hızları ve daha düşük alginat konsantrasyonları, ortalama boncuk çaplarının daha düşük olmasına yol açacaktır. Çark ve damar geometrisindeki hafif değişiklikler ve alginat özellikleri ortalama boncuk çapını büyük ölçüde etkiler. Gemi konfigürasyonundaki veya aljinat partideki her değişiklik için, yüzey alanı momenti ortalaması boncuk çapı ile dönüş hızına ilişkin standart bir eğri oluşturulmalıdır ³² .
8. Zamanlayıcıyı çalıştırın ve alginatı 12 dakika boyunca emülize edin.
9. 10 mL tEmülsiyonu asitleştirmek, CaCO _3'ü eritmek ve böylece aljinatı jel haline getirilmiş boncuklara fiziksel olarak çapraz bağlamak için yağ ve asetik asit çözeltisi. Bu asitlendirme basamağı için 8 dakika bekleyin.

3. Boncuk Kurtarma

1. Çalkalama oranını 400 rpm'ye düşürün. PH'ı arttırmak ve faz ters çevirmesine neden olmak için% 10 ortam ile karıştırılmış 40 mL işlem tamponu ekleyin.
2. 1 dakika sonra ajitasyonu durdurun ve karışımı 50 mL santrifüj tüplerine aktarın. Eğirici şişeyi ek bir 20 mL ortam ile durulayın ve tüpün içine ekleyin. Yağ fazı ile boncuk temasını en aza indirgemek için yağ fazını aspire etmeden önce döner cam şişeden mümkün olduğunca fazla sulu faz aspire.
   NOT: Boncukların hasar görmesini önlemek için bu adımda ve bu noktadan büyük çaplı bir pipet kullanın ( örn. 25 mL pipet). Daha küçük hacimler için boncuk süspansiyonu kesilmiş pipet uçlarıyla da manipüle edilebilir. Bu tür ipuçları elde etmek için, pipet ucunun ucunu kesilen makaslaIle göz koruması giyen.
3. Boncuk yerleşimini ve faz ayrımını hızlandırmak için tüpleri 630 xg'de 3 dakika santrifüjleyin.
4. Bir Pasteur pipetiyle aspire ederek yağ ve fazla sulu çözeltiyi çıkarın.
5. Boncukları orta ile en az bir kez yıkayın. Boncuk süspansiyonunu 40 μm naylon hücre süzgeçleri üzerinde filtreleyin ve süzgeci altındaki boncuklarla ilişkili fazla sıvıyı aspire edin. Boncukları, steril bir spatula kullanarak bilinen bir hacim ortamına aktarın.
   NOT: Bu adımda hedef minimum boncuk çapına bağlı olarak daha küçük veya daha büyük gözenek boyutu filtreleri kullanılabilir. Bununla birlikte, boncukların hasar görmesini önlemek için sub-micron gözenek boyutlu filtreler ile basınca dayalı filtrasyon yerine gravite filtrasyon önerilmektedir.
6. İstenen boncuk elde etmek için hacim yer değiştirmesi (boncuk ekledikten sonra hacim, boncuk eklemeden önce hacim eksi) ve boncuk hacmini ölçün: genel hacim oranı, genellikle 1: 5 veya 1 mL boncuk4 mL ortam. Bu noktadan itibaren, boncuklara zarar vermemek için her zaman büyük çaplı pipetleri kullanın.
7. Kapsüllenmiş hücreleri , in vitro kültür veya transplantasyon deneyleri için T-flask içine aktarın.

4. Kalite Kontrol ve Uygulamaları

NOT: kapsüllenmiş hücre ve boncuk kalitesini sağlamak için, işlemden sonra boncuk boyutu dağılımı ve hücre sağkalımı nicelenmelidir. Daha ileri analiz için boncuklardan hücreleri kurtarmak için jelin tersine çevrilmesi sıklıkla gerçekleştirilir.

1. Boncuk boyut dağılımını değerlendirmek için, boncukları toluidin mavi-O ile lekeleyin.
   1. % 10 komple ortam içeren 4 mL işlem tamponu içine 0.5 mL boncuk yerleştirin.
   2. İşlem tamponunda hazırlanan 1 g / L toluidin mavisi solüsyonundan 500 uL ekleyin.
   3. 50 rpm'de döner çalkalayıcıda konik bir tüp içinde 60 dakika inkübe edin.
   4. % 10 komple ortam ve immed içeren 5 mL işlem tamponu ekleyinIaths boncukları ve çözeltiyi bir Petri kabına aktarın ve düşük büyütmeli bir mikroskopta veya el tipi bir dijital kamerayla görüntü elde edin. Gerekirse, kontrastı artırmak ve gölgeleri önlemek için el tipi bir fotoğraf makinesiyle görüntü elde etmeden önce Petri kabını hafif bir kutuya yerleştirin.
   5. Daha önce tarif edilen ³² boncuk boyut dağılımını nicelemek için görüntü analizini gerçekleştirin, örneğin ³⁶ görüntü analizini kullanarak.
2. Niteliksel olarak hücre sağkalımını değerlendirmek için ölü hücreleri tanımlamak için etidyum homodimeri ve canlı hücreleri tanımlamak için kalsein AM'yi kullanarak hücreleri lekeleyin.
   1. % 10 komple ortam içeren 4 hacim işlem tamponuna 1 hacim boncuk ekleyin.
   2. Sırasıyla 4 uM ve 2 uM konsantrasyonlar elde etmek için uygun miktarda kalsein AM ve etidyum homodimer stok solüsyonları ekleyin. Bazı boncuk örneklerine reaktiflerden yalnızca birini ekleyerek tek leke kontrolü oluşturun.
   3. Boncuklar buz üzerinde 20 dakika inkübe edin.
   4. Çözeltiyi bir slayt ve lamel arasına, boncukların sıkışmasını önlemek için bir o-halka gibi bir boşluk kullanarak yerleştirin.
   5. Floresan mikroskobunda ilerleyin. Floresan kanamayı değerlendirmek için tek leke kontrollerini kullanın. Kalcein AM (494/517 nm) ve DNA'ya bağlı etidyum homodimeri (528/617 nm) ile ilgili uyarılma / emisyon dalga boylarına dayalı uygun floresan filtreleri seçin.
3. Daha ileri analiz için hücreleri boncuklardan kurtarmak için alginatın sitrat veya başka bir kenetleme solüsyonu kullanılarak degelleştirilmesi.
   1. 55 mM sitrat, 10 mM HEPES ve pH 7.4'de 95 mM NaCl içeren bir çözücü çözelti hazırlayın.
   2. Bu solüsyonu% 10 orta hacimde karıştırın ve daha sonra 9 mL karışıma 1 mL aljinat boncuk ekleyin.
   3. Boncukları, buz üzerinde, 75 rpm'lik ajitasyonla 20 dakika boyunca püskürtün.
      NOT: Hücreler şimdi analiz için kullanılabilir veya eritilmiş aljinat çözeltisinden uzaklaştırılabilirIyonu santrifüjleme ile Örneğin, degradasyondan sonra hücre yaşayabilirliği Trypan Blue lekelemesi ile nicelleştirilebilir. Alternatif olarak, hücreler santrifüje tabi tutulabilir ve yıkanabilir, ardından mRNA, DNA ve / veya protein örnekleme ve analizi yapılabilir.

Emülsifikasyon ve iç jelasyon işleminin sonunda, başlangıç ​​aljinat ve hücre karışım hacmine benzer bir boncuk hacmi elde edilmelidir. Boncuklar çok kusurlu çok küresel olmalıdır ( Şekil 3 ). Boncuklar, büyük çaplı pipetler yardımıyla pipetlemeye dayanacak kadar güçlü olmalıdır. Yüksek alginat konsantrasyonlarında boncuklarda kapsüllenmiş yağ veya hava damlacıkları gözlemlenebilir. Bu, muhtemelen emülsifikasyon aşamasında (yağ / su / yağ çift emülsiyon) alginat damlacıklarına yağın sıkışması nedeniyle cereyan etmektedir. Elimizde bu boncuk boncuk hacminin küçük bir bölümünü (<% 5) temsil etti ve bu boncukların çoğu, daha düşük yoğunluklarından dolayı boncuk kurtarma aşamasında yağın aspirasyonuyla çıkarıldı.

Şekil 3 : Emülsifikasyon ve iç jelleştirme işlemi ile elde edilen kapsüllenmiş βTC3 hücreleri içeren temsili% 5 aljinat boncuklar 5 x 10 6 βTC3 hücre / mL boncuk içeren% 5 aljinat boncukların faz kontrastlı görüntüsü Daha büyük görüntülemek için buraya tıklayın. Bu şeklin versiyonu.

Elde edilen boncukların boyutu tekdüze olmayacak - bu karıştırılmış emülsiyonların özünde bulunan özelliktir ( Şekil 4A ). Türbülanslı akışta emülsifikasyon sırasında, basınç dalgalanmaları, dağınık faz 39'daki yüzey gerilimi ve viskoz kuvvetlere karşı koyan damlacıkları 37 , 38 bozmak için etkimektedir. Viskoz kuvvetler, dağınık fazın viskozitesi, viskozitenin viskozitesininSürekli faz. Maksimum yerel enerji dağılım oranının teknedeki ortalama enerji dağılım oranı ile orantılı olduğu varsayılarak, maksimum kararlı damlacık çapı d max (Kolmogorov ölçeğine göre >> ise) 39 , 40 , 41 , 42 olarak hesaplanabilir

Burada ρ c sürekli fazın yoğunluğudur, ε damardaki ortalama enerji dağılım oranı, σ iki sıvı arasındaki arayüzey gerilimi, μd dağınık fazın viskozitesi ve C bir orantısal sabittir. Yüzey gerilme kuvvetleri viskoz kuvvetlerin üzerinde hakim olduğunda, sağ taraf C'ye basitleşir, buna karşın viskoz kuvvetlerin baskın olması basitleşir:

Karıştırılan kaplarda, türbülanslı akış ölçeklerinde enerji girişi birim hacim başına güç girişi ile orantılıdır, yani N i 3 D i 2 , burada N i ajitasyon hızı ve Di ise çark çapıdır. Bu nedenle, Denklem 1 ile kombine edilmiş ve sabit bir D i verildiğinde, yüzey gerilimi kuvvetleri hakimiyse, Dmax'ın Ni-1.2'ye ( Şekil 4B ) orantılı olduğu tahmin edilirken, Nm -0.75 ile orantılıdır; Boncuklar temel kalıcı güç olarak öne çıkmaktadır. Şekiller 4B ve 4C , arayüzey etkilerinin dDüşük aljinat konsantrasyonları için roplet boyutu, viskoz kuvvetler daha yüksek alginat konsantrasyonunda daha baskın hale gelirken ( örneğin , Malzemelerin Tablosunda açıklanan alginat # 3 için% 5). Deneysel olarak dmax'ı belirlemek pratik olmayabileceğinden, genellikle dmax 43'e orantılı olduğu için çapın yüksek kuantil değerleri ( örneğin , 95 inci kuantil) veya yüzey alanı moment ortalaması çapı ( d 32 ) kullanılmıştır.

Hücrelerin kapsüllenmesinden önce, d 32'nin N i fonksiyonu olarak bir eğrisinin oluşturulması önerilir ( Şekil 4B ). Bu eğri, istenen bir ortalama boncuk boyutunu elde etmek için yeterli N i seçilmesine yardımcı olacaktır. Farklı yağ yığınları veya aljinat grupları için veya eğer aljinat konsantrasyonuTration değiştirildi. Gemi geometrisine ve aljinat konsantrasyonlarına bağlı olarak, ortalama boncuk çaplarına nispeten geniş bir aralık ulaşılmalıdır. Örneğin, yukarıda tarif edilen protokol kullanılarak% 200 alüminyum asidinin% 2'si (Hoesli ve diğerleri 32'de Şekil 2C ) ila% 5 aljinat ( Şekil 4 ) kullanılarak 200 μm ve> 1 mm arasındaki d32 değerleri elde edilebilir.

Şekil 4 : Boncuk büyüklüğü dağılımı. ( A ) Toluidin mavi-O lekeli% 5 aljinat boncuklar. ( B ) d 32 , 50:50 alginat # 1 ve # 2 karışımı (bkz. Malzeme Tablosu) kullanılarak% 1.5 ve% 5 aljinat boncuklar için ajitasyon oranının ( N i ) bir fonksiyonu olarak. % 5 algi için tek bir nokta gösterilmiştirNate boncuklar. ( C ) d 32 ,% 2 ve% 5 aljinat # 3 için N i'nin bir fonksiyonu olarak (bkz. Malzeme Tablosu). Hata çubukları, bir numunedeki boncuk boyutlarının standart sapmasını gösterir (N> 150 boncuk). Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Emülsifikasyon ve iç jelleştirme işleminden elde edilen hücre sağkalımı esas olarak hücrelerin yaşadığı pH düşüşünün derecesine ve süresine bağlıdır. Bu videoda anlatılan işlemi kullanarak, 76 ±% 2 βTC3 hücre sağkalımı 31 olarak ölçüldü. Dağılmış hücreleri 10 5 hücre / mL aljinat ila 10 7 hücre / mL alginat tohumlama yoğunluğunda kapsüllediğinde, tüm boncuklar hücreler içermelidir. Pankreas hücreleri gibi hücre kümelerini kapsüllediğinde boncuklardan oluşan bir alt grubun boşaltılması beklenebiliry. Şekil 5 , bu işlemi kullanarak elde edilen tipik canlı hücre / ölü hücrenin boyama sonuçlarını göstermektedir. Yüksek hücre sağkalımı, işlem tamponu kapasitesini arttırarak ve asitleştirme aşamasının süresini azaltarak elde edilebilir. Örneğin, işlem tamponu olarak 60 mM MOPS (3- (N-morfolino) propansülfonik asit) kullanılarak ve toplam işlem süresi 4 dakikaya indirilerek 32 ± 2% MIN6 hücre sağkalımı elde edildi. Bununla birlikte, üretilen boncuklar, daha düşük pH 31'de salınan Ca2 + miktarlarında artışa bağlı olarak, 60 mM MOPS işlem tamponuna kıyasla, 10 mM HEPES işlem tamponu ile önemli derecede daha güçlüdür. Hem kısa MOPS işlemi hem de daha uzun HEPES işlemi,> 2 hafta boyunca in vitro kültür veya transplantasyon için yeterince kararlı boncuklar üretmelidir. Bununla birlikte, boncuklar düşük kalsiyumlu veya yüksek kenetleyici konsantrasyonlarına sahip solüsyonlarda şişirilebilir veya tamamen degrade olabilir (örneğin, Kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu tuz çözeltisi).

İn vitro büyüyen kapsüllenmiş MIN6 hücreleri için görünür hücre agregaları ~ 5-7 gün in vitro immobilize hücre genleşmesinden sonra oluşur ve 150 um çaplı küremsiler 2 hafta sonra hasat edilebilir. Aljinatla hareketsiz hale getirilen hücrelerin büyüme oranı, özellikle yüksek alginat konsantrasyonu veya daha yüksek guluronik asit içeriği olan jeller için, hareketsizleştirilmiş kültürlerdekinden daha düşük olması beklenir.

Şekil 5 : İşlemden hemen sonra kapsüllenmiş hücreler. ( A ) Kapsüllenmiş hücrelerin canlı hücre (yeşil, kalsein AM) ve ölü hücre (kırmızı, etidyum homodimeri) boyaması. ( B ) Aynı boncuğun faz kontrastlı görüntüsü. MIN6 hücreleri% 2 oranında kapsüllenmiş,12 dk emülsifikasyon, 8 dak asitleme ve bu protokolde tarif edildiği gibi 10 mM HEPES tampon kullanan aljinat boncukları. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.