Yöntem makalesi

İzolasyon ve Roman Yüzey Etiket Kombinasyon ile tanımlanır Karaciğer progenitör Alt Grupları zenginleştirilmesi

10.7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55284

⸱

18 Şubat 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine II, Saarland University Medical Center, 2Department of Physiology, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), University of Saarland

Bu makalede

Özet

Karaciğer yaralanmaları heterojen bir hücre popülasyonunu temsil progenitör hücre genişlemesi eşlik ediyor. Bu hücresel bölmenin yeni sınıflandırma birden altgruplarının ayırmada sağlar. Burada tarif edilen yöntem, analiz ve başka analizler için de kullanılabilen çeşitli alt-kümelerinin yüksek saflıkta izole sitometri akışı göstermektedir.

Özet

Kronik karaciğer yaralanmaları sırasında, progenitör hücreler aynı zamanda inflamatuar hücre infiltrasyonu ve epitel hücre aktivasyonu görünümünü gerektirir kanalsal reaksiyon denilen bir süreçle, genişletmek. enflamatuar reaksiyonlar sırasında projenitör hücre popülasyonu çok histolojik analiz ile veya akış sitometri tabanlı teknikler ile, ya tek bir yüzey belirteçleri kullanılarak araştırılmıştır. Ancak, yeni yüzey belirteçleri karaciğer atası içinde çeşitli fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri tespit / hücre bölmesini kaynaklanıyor. Burada sunulan yöntem, yalıtım ve yeni yüzey işaretleyici kombinasyonlarını kullanarak progenitör alt kümelerinin sitometri analizi ayrıntılı akışını açıklar. Ayrıca, çeşitli progenitör hücre alt yüksek saflıkta manyetik otomatik kullanılarak ve FACS ayıklama bazlı yöntemler ile izole edilebilir gösterilmiştir. Önemlisi, karaciğer roman ve basitleştirilmiş enzimatik ayrılma yüksek canlılığı bu nadir bir hücre popülasyonlarının izolasyonu sağlardiğer mevcut yöntemlere kıyasla üstündür. Bu da, in vitro projenitör hücreleri incelemek için ya da gen tanımlama profili analiz yüksek kaliteli RNA izole edilmesi için özellikle uygundur.

Giriş

Karaciğer yenilenmesi çok hepatosit kendini yenileme kapasitesi ile ilişkilidir. Bununla birlikte, kronik karaciğer yaralanması ve hepatositlerin cholangiocytes, 1, 2, 3, 4 ayırt etme kabiliyetleri ile ilişkilendirilmiştir progenitör hücre aktivasyonu ve genişleme ile meydana gelir. Kronik yaralanma sırasında hepatosit proliferasyonu etkili değildir, çünkü bu özellikle geçerlidir. Progenitör hücreleri hedef alan çok sayıda genetik izleme çalışmalara rağmen, karaciğer rejenerasyonu rolleri 5, 6, 7, 8 tartışmalıdır. Ayrıca, progenitör hücrelerin aktivasyon yaralanmalarında 9 sırasında tam rolü hakkında sorular ortaya çıkarmaktadır karaciğerde artan fibrotik yanıtı, bağlantılı olmuştur10.

Progenitör hücre bölmesine heterojen doğası uzun mikrodiseksiyon veya hücre sıralama tabanlı yöntemler 1, 11 ile tek bir yüzey işaretleyici ifade eden progenitör hücreler izole edilmiş gen ekspresyon çalışmaları ile öne sürülmüştür. Gerçekten de, en son, yeni bir yüzey markör kombinasyonu kullanılarak gp38 (podoplanin) açık bir şekilde, çeşitli alt-12 progenitör hücrelerin önceki tek belirteçleri bağlandı. Önemlisi, bu alt-gruplar sadece yüzey işaretleyici ifadesinde farklılık değil, aynı zamanda yaralanmaların 12 sırasında işlevsel değişiklikler sergilemiştir.

Çoklu hayvan modelleri progenitör hücre aktivasyonu ve karaciğer rejenerasyonu araştırmak için kullanılmıştır. Çeşitli yaralanma türleri progenitör hücrelerin 12 alt kümelerini farklı aktivasyonunu teşvik gibi görünüyor. Bu ph açıklayabilirİnsanlarda 4 gözlenen kanalsal reaksiyon enotypic sapma. Böylece, progenitör hücrelerin karmaşık fenotipik ve fonksiyonel analizleri kendi yaralanmalarda rolü ve karaciğer hastalıklarında kanalsal reaksiyonun gerçek önemini anlamak için çok önemlidir.

Yüzey işaretleyici kombinasyonları yanı sıra, hücre izolasyonu protokolleri önemli farklılıklar daha önceki çalışmalarda 2 dayanarak sonuçları zorlaştırıyor. Bazı çalışmalar, önemli miktarda büyük ölçüde izole protokolünde farklıdır progenitör hücreler (örneğin, karaciğer ayrılma (enzim kombinasyonu ve işlemin süresi), yoğunluk, orta ve santrifüj hızı) rolünü ele 2. Optimize edilmiş izolasyon tekniği, nadir hücre popülasyonlarının daha iyi canlılığı sağlayan ve alt küme bileşiminin yansıtıcı, gelişmiş ve son zamanlarda 12 yayımlanmıştır. Bu makalenin amacı, bir daha det sağlamaktırBu karaciğer hücre izolasyon prosedürü ve alt küme analizi ailed protokol tekniğinin uygun üreme için izin vermek. Ayrıca, protokol yeni protokole göre farklılıklar göstermek için önceki izolasyon yöntemi ile bir karşılaştırmasını içerir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Tüm deney prosedürleri Homburg Üniversitesi Tıp Merkezi etik ve hayvan bakım komitelerinin onayı ile yapılmıştır.

Malzeme ve Tamponlar hazırlanması 1.

  1. Taze bakteri kontaminasyonu önlemek için steril bileşenleri ve laminar kaput kullanarak karaciğer sindirim için gerekli tüm tamponlar hazırlamak.
  2. RPMI ortamı içinde 49.5 mL ve fetal sığır serumu, 0.5 mL karıştırılarak toplama tamponu (CB) hazırlama (FBS, düşük endotoksin, ısı ile inaktive edilmiş),% 1 (h / h) çözeltisi elde etmek için. Daha fazla kullanım kadar buz üzerinde çözüm saklayın.
    Not: Yaklaşık olarak 25 CB ml bir bütün karaciğer sindirimi gereklidir.
  3. Aşağıdaki bileşenler kullanılarak sindirim tamponu (DB) hazırlayın: RPMI ortamı,% 1 (h / h) FBS (düşük endotoksin, ısı ile inaktive edilmiş), kolagenaz P (0.2 mg / ml), DNAz I (0.1 mg / mL) ve dispaz (0.8 mg / ml).
    Not: yaklaşık 25 dB mL bir bütün karaciğer sindirimi gereklidir. t DB ön ısıtmakKullanmadan önce o 37 ° C su banyosu.
  4. Hanks dengeli tuz çözeltisi içinde girişte enzimler (HBSS; collagense P ve dispaz) sulandırın veya DNase I tamponu (% 50 (h / h) gliserol, 1 mM MgCl2, 20 mM Tris-HCI, pH 7.5) bunu kısım, ve -20 ° C'de saklayın. DNaz-ı saklayın 4 ° C'de tampon ve iki ay içinde kullanın.

Karaciğer Tek hücreli Süspansiyon 2. Hazırlık

  1. Yerel etik ve hayvan bakım komiteleri çerçevesinde servikal dislokasyon ile tedavi edilmemiş vahşi tür fareler Euthanize.
  2. Bir diseksiyon gemide fareler yerleştirin ve% 70 etanol ile kürk ıslak. makas kullanarak, bacaklarda karşı Y-kesi ardından derinin bir yarık ile karın açın. makas kullanarak sternum periton açın. karaciğer ortaya çıkarmak için, bir pamuklu çubuk kullanarak sağ tarafına hafifçe bağırsak yerinden.
  3. makas ve forsepsle yardımıyla, karaciğer lobları kaldırmageride Safra kesesi bırakarak ve bağ dokusu ile kirlenmesini önlemek. karaciğer tartılır ve HBSS içeren bir Petri kabındaki buz üzerine yerleştirin.
  4. kuru Petri kabı karaciğer lobları yerleştirin ve bir neşter kullanılarak homojen küpler halinde yaklaşık 2 mm yan karaciğer doku kesti. 15 ml konik santrifüj tüpüne parçaları aktarın.
  5. Karaciğer parçaları içeren 15 ml konik santrifüj tüpüne DB 2.5 ml ekleyin ve sindirim işlemini başlatmak için bir 37 ° C su banyosunda yerleştirin (sağlıklı bir karaciğer 60-70 dakika sürer ve bir sirozlu karaciğer 80-90 dakika sürer ).
    NOT: Bir bütün karaciğer sindirilir ediliyorsa, karaciğer iyi hücre canlılığı sağlamak için iki adet 15-ml konik santrifüj tüplerine ayrılmalıdır.
  6. serbest karaciğer hücreleri toplamak için yeni bir 15-ml konik santrifüj tüpü hazırlayın. tüpün üst poliamid 100 mikron filtre örgü yerleştirin ve CB 800 uL örgü ıslak. buz üzerinde konik santrifüj tüpü yerleştirin.
  7. Sam mixples karaciğer parçaları ihtiva eden 15 mL konik santrifüj tüpü çalkalayarak sindirim sürecini desteklemek için 5 ve 10 dakika sonra 37 ° C su banyosu içinde.
  8. 15 dakika sindirim başladıktan sonra, yavaşça kolayca geçmesine karaciğer parçaları sağlayan bir kesim ucu ile 1.000 mcL pipet kullanarak karaciğer parçaları karıştırın. geri su banyosu içine tüpler yerleştirin ve parçaları 2 dakika yerleşmek için izin verir.
  9. (Tipik 700 uL 2x) yaygın hücreleri içeren süpernatant kaldırmak ve adım 2.6 hazırlanan tüp ekleyin. DB ile kaldırılan süpernatant (2x 700 mL) değiştirin ve geri 37 ° C su banyosunda içine yerleştirin.
  10. Yaklaşık 60-70 dakika sindirim başından beri geçene kadar (tipik olarak 30, 40, 50, 55, ve 60 dakika) adım 2.8 açıklanan prosedürü tekrarlayın. itibaren 40 dk, kalan karaciğer parçaları bir kesilmemiş 1000-ul pipet geçmesine kadar küçük olmalıdır.
    NOT: Sağlıklı karaciğer dige olduğunuFibrotik karaciğer tipik olarak 80-90 dakika ihtiyacı olduğu, 60-70 dakika içinde tam olarak sted. Bu zaman noktasında göre, karaciğer doku karaciğer parçaları içeren konik 15 ml santrifüj tüpüne görünür olmamalı ve tüm serbest hücreler adım 2.6 hazırlanan tüpe transfer edilmelidir.
  11. Sindirim işlemi sonunda, hücreler toplama ve 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de bunları santrifüj (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
  12. liziz tamponunda, amonyum-klorid-potasyum, 1 mL (ACK) hücre pelletini ve kırmızı kan hücrelerinin lize edilmesi için oda sıcaklığında 1 dakika için inkübe edilir. CB 5 mL ilave ederek reaksiyonu durdurun ve 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de hücreleri santrifüj (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2). CB 4 mL hücrelerin yeniden süspanse ve buz üzerinde saklayın. Aşama 3'te tarif edildiği gibi, hücre sayımı.
    Not: Hücre topağı gevşek ve bu nedenle süpernatan boşaltıldı yerine uzak pipetlenir.

Akım Sitometri Kullanımı Cep Count 3. Belirlenmesi

NOT: ideal, aşağıda açıklanan akış sitometri tabanlı hücre ölçümü yerine klasik Neubauer odası dayalı yöntemin önerilmektedir hücre sayımı, otomatik hücre sayıcı ya da belirlemek için. aşama 2'de tarif edilen karaciğer, tek hücreli bir süspansiyon büyük ölçüde farklılık gösteren boyutlarda ve granularities ile parankimal olmayan parankimal hücreler (NPC) içerir. Akım sitometri kullanarak NPC'ler yolluk-ileri saçılma, yan dağılım (FSC-SSC) özelliği ile birlikte hücresel enkaz doğru dışlama tarif edilen protokol 12 başarı sağlar.

  1. Karaciğer hücre süspansiyonu (20 uL) bir kısım hazırlamak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) ve propidyum iyodin 6 uL 174 mcL (PI bitiş konsantrasyonu 0.375 mg / ml). Hücrelerin ölçümü için izin sayma boncuk ekleyin.
  2. S KapısıSC-A-FSC-A enkaz önlemek ve daha fazla FSC-H ve FCS-A kullanılarak ikilileri dışlamak için.
    NOT: Şekil 2'de gösterilen yolluk strateji takip etmek önemlidir.
  3. Kapı dışarı PI-pozitif ölü hücreler, senin örneklerden 30 mcL ölçmek ve olayları kaydetmek. hücre sayısını hesaplamak için üreticinin kılavuz izleyin.
    NOT: ölçme flow sitometri adımlarını 4 izleyin manyetik tabanlı progenitör hücre izolasyonu için 5. ve 6. adımları ve progenitör alt popülasyonlarının tür flow sitometri için 7 adımları.

Progenitör Alt Grupları ve Fow Sitometri Analizi Karaciğer Tek hücreli Süspansiyon 4. Boyama

Antikor Klon Host / İzotip Hazır Konsantrasyon [mg / ml] seyreltme
CD64 X54-5 / 7.1 Fare IgG1, κ 0.5 1: 100
CD16 / 32 93 Fare IgG2a, λ 0.5 1: 100
CD45 30-F11 Sıçan IgG2b, κ 0.2 1: 200
CD31 MEC13.3 Fare IgG2a, κ 0.5 1: 200
ASGPR1 Poliklonal keçi IgG 0.2 1: 100
podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0.2 1: 1400
podoplanin 2001/01/08 Syrian Hamster IgG 0.5 1: 1400
CD133 Mb9-3G8 sıçan IgG1 0.03 3 uL
CD133 315-2C11 fare IgG2A, λ 0.5 1: 100
CD34 RAM34 Fare IgG2a, κ 0.5 1: 100
CD90.2 53-2,1 Sıçan IgG2, κ 0.5 1: 800
CD157 BP-3 Fare IgG2b, κ 0.2 1: 600
EpCAM G8.8 Fare IgG2a, κ 0.2 1: 100
Sca-1 D7 Fare IgG2a, κ 0.03 10 uL
Fare IgG2b, κ MPC-11 0.2
sıçan IgG1 RTK2071 0.2
Sıçan IgG2b, κ RTK4530 0.2
Fare IgG2a, κ RTK2758 0.5
Fare IgG2a, κ RTK2758 0.2
Syrian Hamster IgG SHG-1 0.2
Syrian Hamster IgG SHG-1 0.5
Normal keçi IgG kontrol Poliklonal keçi IgG 1
Eşek anti-keçi IgG eşek IgG 2 1: 800
streptavidin 1 1: 400

Tablo 1.

Antikor 1 2 3 4 5
CD45 APC / Cy7 Sıçan IgG2b, κ
0.5 uL 		+ + + +
CD31 Biotin + Fare IgG2a, κ
0.5 uL 		+ + +
ASGPR1 saflaştınldı + + Normal keçi IgG kontrol
0.2 uL 		+ +
podoplanin APC + + + Syrian Hamster IgG
Bir 01:14 Seyreltme 1 uL 		+
CD133 PE + + + + sıçan IgG1
0.45 uL
Eşek anti-keçi
Alexa Fluor 488 		+ + + + +
streptavidin
Alexa Fluor 405 		+ + + + +

Tablo 2.

  1. Aşama 3'te tarif edildiği gibi belirlenir, 2.5 x 10 5 hücre ihtiva eden bir reaksiyon tüpüne (1.5 mL) içine adım 2.11 hücre süspansiyonunun bir kesri yerleştirin.
  2. 3 300 xg'de dk ve 4 ° C mikrosantrifüj kullanarak hücreleri Santrifüj.
    NOT: Bu noktada, bir vakum pompası dikkatle süpernatant kaldırmak için kullanılabilir.
  3. Fc Block karışımı hücre pelletini ve buz üzerinde 5 dakika için inkübe edilir. leke başına 50 ul toplam hacimde Fc Block karışımı hazırlayın. 1 ekleFcR bloke edici ayıracı 0 uL, saflaştırılmış anti-CD64 1 uL (1: 100; 0.5 ug / leke), ve boyama tamponu 40 uL (ST tamponu: HBSS,% 1 (h / h) FBS ve% 0.01 leke başına sodyum asid).
    NOT: Sodyum azit son derece toksiktir. nitril eldiven, laboratuvar kat ve bir yüz maskesi gibi uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın.
  4. hücrelere karışımı boyama 50 mcL (hücrelerin toplam hacmi şimdi 100 uL) ve antikor karışımı hücreleri, ışıktan korundu ve buz üzerinde 20 dakika inkübe edilir.
  5. leke başına 50 ul toplam hacim sahip antikor karışımı hazırlayın. CD31 (0.5 uL; 1: 200; 0.25 ug / leke), ASGPR1 (1 uL: CD45 (; 200 0.1 ug / leke 1 0.5 uL:) 50 uL ST tampon için, temel bir boyama aşağıdaki konjuge antikor ekleyin ; 1: 100; 0.2 ug / leke), podoplanin (1 01:14 seyreltme uL; 1: 1.400 uç seyreltme; 0.014 ug / leke) ve CD133 (3 uL; 0.09 ug / leke).
    NOT: Tablo1 antikor klonlar ve temel lekeler ve çeşitli alt grupları ek yüzey belirteçleri için kullanılan dilüsyonları özetlemektedir. Tablo 2'de de gösterildiği gibi, karşılık gelen izotip kontrolleri ve / veya floresan eksi kontrol (FMOs) ihtiva eden bir antikor karışımı için ekstra hücre süspansiyonları hazırlanır.
  6. eşek anti-keçi IgG 0.125 uL (1 ihtiva eden ikincil antikor karışımı, 100 uL hücreler her bir örnek için 400 uL ST tamponu ilave edin ve santrifüj hücreler, 4 dakika boyunca 300 x g ve 4 ° C.Discard supernatant ve tekrar süspansiyon: 800; 0.25 ug / leke) ve fluoresan streptavidin konjüge (1 0.25 uL: 400; 0.25 ug / leke) ST, tampon 100 ul.
  7. ışıktan ve buz üzerinde 20 dakika için antikor karışımı ile korunan ise hücreler inkübe edin. Her bir örnek için, 400 uL ST tamponu ilave edin ve 300 x g'de 4 dakika ve 4 ° C'de hücreleri santrifüj. Süpernatantı atın ve ST tutkunu 300 uL hücreleri tekrar süspansiyoner 0.25 mcg / ml PI içeren.
    NOT: projenitör hücrelerin hücre canlılığı zamanla azalır; nedenle, mümkün olan en kısa şekilde, taze numuneleri ölçmek için önerilmektedir.

Progenitör Hücreler 5. Manyetik microbead tabanlı Zenginleştirme

  1. Yeni bir 15 mL konik santrifüj tüpü içine, Aşama 3'te tarif edildiği gibi belirlenir hücre sayımına bağlı olarak 1.5-2 x 10 6 hücre içeren karaciğer tek hücre süspansiyonunun bir kesri aktarın.
  2. 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de hücreleri santrifüj (indirgenmiş Hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
    Not: Genellikle, bir sağlıklı C57BL / 6 fare karaciğer (ya da karaciğer dokusu, 1 g), üç 15-mL konik santrifüj tüpüne ayrılmış gerekecektir.
  3. HBSS% 0.5 (h / h) inek serumu albümini (BSA) 400 ul hücrelerin tekrar ve anti-CD31 mikro boncuklar 40 uL ve anti-CD45 mikro boncuklar 30 mcL ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca inkübe hücreleri.
    NOT: t aşmayınayırma saflığı önemli ölçüde azalacaktır gibi O, kuluçkalama süresinin.
  4. hücrelere 5 ml HBSS% 0.5 (h / h) BSA ekleyin ve 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de bunları santrifüj (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
  5. Ölü hücre çıkarma boncuk 100 uL hücre pelletini ve 15 dakika oda ısısında inkübe edilir. Bu arada, bir LS ayırma sütunu hazırlama ve HBSS 0.5 3 mL% (v / v) BSA ile kalibre edin.
    NOT: ayırma saflığı önemli ölçüde azalacaktır gibi, kuluçka süresi aşılmamalıdır.
  6. , Hücrelere 900 uL HBSS% 0.5 (v / v) BSA ekle 100 mikron poliamid filtre mesh kullanarak bunları filtre ve LS ayırma kolonuna yükleyin.
    NOT: Yük bir bütün karaciğer bir LS ayırma kolonuna.
  7. 3 mL HBSS% 0.5 (v / v) BSA ile sütun üç kez yıkayın ve flow-through toplamak.
  8. 180 x g'de 8 dakika, 4 ° C akış yoluyla santrifüj (düşük ACCE kullanılarakkard akselerasyonu arasındaki ilişki / 4 ve yavaşlama / 2).
  9. tampon (RB) (PBS ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA))% 0.5 daha fazla deneysel prosedür bağlı olarak (h / h) BSA veya ST tamponu ihtiva eden yıkama ya hücre pelletini.

Birden ciğeri Kombine progenitör hücre alt 6. Manyetik microbead tabanlı Otomatik Hücre Arıtma

Not: progenitör hücre alt nadir hücre popülasyonlarının temsil ettiğinden, çok karaciğerlerinden birleştiren hücreleri genellikle, daha başka deneyler için yeterli hücre sayıları elde etmek için gereklidir. Bir örnek olarak, CD133 + ve gp38 + hücre ayırma gibi, aşağıda tarif edilmektedir.

  1. CD133 + atalarıdır İzolasyonu
    1. 3. adımda açıklandığı gibi adım 5.9 sonra, hücre sayımı ve RB 100 uL 10 6 hücre (genellikle 4-6 sağlıklı karaciğer örnekleri havuzu) kadar tekrar süspansiyon.
    2. Ekleme, anti-CD64 1: 100 ve anti-CD16 / 32: 1 hücreleri ve inkubasyon 1005 dakika boyunca buz üzerinde yedi. hücrelere 100, anti-CD133 biyotinile antikor ve bir 10 dakika daha buz üzerinde inkübe: 1 eklenir.
    3. RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
    4. RB 400 uL hücreler tekrar süspansiyon ve anti-biyotin mikro-10 uL ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca örnek inkübe edin. Bu örneklerin saflığını azaltır, kuluçka süresi aşmayın.
    5. RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2). RB, 1 mL pelletini.
  2. Gp38 + progenitörlerin izolasyonu
    1. 3. adımda açıklandığı gibi adım 5.9 sonra, hücre sayımı ve RB 100 uL 10 6 hücre (genellikle 4-6 sağlıklı karaciğer örnekleri havuzu) kadar tekrar süspansiyon.
    2. Ekleme, anti-CD64 1: 100 ve anti-CD16 / 32: 1 hücre 100 ve 5 dakika süreyle buz üzerinde inkübe. Sonra, 1 ekleyin:100, anti-gp38 hücrelerine antikor biyotinile edilmiş ve 10 dakika daha buz üzerinde inkübe edilir.
    3. RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
    4. RB 400 uL hücreler tekrar süspansiyon ve anti-biyotin mikro-5 ul ekleyin. 4 ° C'de 15 dakika boyunca örnek inkübe edin. Bu örneklerin saflığını azaltır, kuluçka süresi aşmayın.
    5. RB 5 ml ilave edilir ve santrifüj 8 dakika boyunca 180 x g ve 4 ° C (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
    6. RB, 1 mL hücre pelletini.
  3. Adım 6.1 veya 6.2 sonra ortak adımlar
    1. Pozitif ve negatif fraksiyonları toplamak için iki ek boş tüpler bir soğutma 5 raf üzerinde manyetik olarak etiketlenmiş hücre süspansiyonu ihtiva eden 15 ml konik santrifüj tüpüne koyun. ayırıcı ayırma platformu üzerinde soğuk raf yerleştirin.
    2. Pozitif seçim programı kullanınHer numune (durulama seçeneği) arasında geniş bir yıkama aşaması ile (Possel_d2).
      NOT: numunenin saflığını azaltacaktır yerine otomatik ayırıcı hücrelerinin sütun tabanlı manuel olarak ayrılmasını kullanma.
    3. 180 x g'de 8 dakika ve 4 ° C'de pozitif kısmını ve santrifüj kazan (kullanılarak düşük hızlanma / 4 ve yavaşlama / 2).
    4. daha fazla deneysel prosedür bağlı olarak ya RB veya ST tampon hücre pelletini.
    5. saflık kontrolü için, hücrelerin bir kısım alır ve aşama 4'te tarif edildiği gibi bunların leke.

7. Akım Sitometri Hücre Sıralama

NOT: progenitör hücre alt kümesinin bir yüksek saflıkta şort aşağıda tarif edilen protokol ile elde edilebilir. hücrelerin toplam verimi bu aşama 6'da tarif edilen ve gen ekspresyon analizi için en çok daha düşüktür.

Parametre ayar
Nozul Boyutu 85 mikron
Sıklık 46,00-46,20
Genlik 38,30-55,20
Faz 0
Bırak Gecikme 28,68-28,84
zayıflama kapalı
ilk Damla 284-297
hedef Gap 9.-14
Basınç 45 psi

Tablo 3.

  1. (Aşama 5'te tarif edilen), manyetik bazlı zenginleştirme hücreleri elde edilmesi; Aşama 3'te tarif edildiği gibi, bunları saymak; 4. adımda açıklandığı gibi ve progenitör belirteçleri (CD133, gp38), CD31, ASGPR1 ve CD45 için onlara leke.
  2. fenol-kırmızı ücretsiz Dulbec: sıralama orta (SM) hazırlayın% 0.5 (h / h) BSA ve% 0.01 (h / h) sodyum azid ihtiva eden CO 'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamı (DMEM). SM lekeli hücrelerin tekrar polipropilen yuvarlak alt tüp içine aktarmak ve buz koyun.
    NOT: Sodyum azit son derece toksiktir. nitril eldiven, laboratuvar kat ve bir yüz maskesi gibi uygun kişisel koruyucu donanımları kullanın. kriteri hücreler fonksiyonel deneyleri için kullanıldığında sodyum azit kullanmayın.
  3. Hücre izolasyonu için kullanılan sıralayıcı türüne uygun yazılımı kullanın. yazılımını açın ve sıralama parametreleri ve makine özellikleri ayarlamak için üreticinin talimatlarını izleyin.
    NOT: Makine özellikleri Tablo 3'te özetlenmiştir. Makine özellikleri çeşitli kurumlarda farklı olabilir iken, (45 psi ve 85 mikron nozul) populat progenitör hücre canlılığı artırmak için sıralama basınç azalması ve daha geniş bir meme büyüklüğü gerekli olduğuna dikkat etmek önemlidiriyon ve sıralanmış hücrelerden hazırlanan RNA kalitesi. Tazminat ayarlamak için zenginleştirilmiş karaciğer progenitör hücreler kullanmak önemlidir. Diğer karaciğer ya da lökosit popülasyonları stromal nüfusun optimal çözünürlükte ve sahte yolluk strateji farklı oto-floresan ve sonucu var.
  4. Makineyi kalibre ve sıralama toplama cihazında SM 350 uL içeren 5 ml polipropilen yuvarlak alt tüp yerleştirin. Örnek toplama ve sıralama başlayın. alt populasyonun 1000 olayları toplayın ve örnek akışını durdurun.
  5. sıralama cihazdan dışarı tüpü alın ve akış sitometresinde sıralı hücreleri ölçün. canlı hücreler arasındaki mevcut sıralı hücre popülasyonunun yüzdesini belirleyin. Bu oran sıralanmış hücrelerin saflığını verir.
  6. Sıralama saflığı% 95'in üzerinde, sınıflandırmanın toplama cihazında RLT lizis tamponu 350 uL ihtiva eden bir 5-ml polipropilen yuvarlak dipli tüp yerleştirin.
  7. sıralama başlatın ve toplamak 7,000-stromal ICSI'nin başına 10.000 olaylar.
  8. daha sonra analiz -80 ° bir DNase- ve RNaz içermeyen reaksiyon tüpünde kriteri hücreleri içeren RLT lizis tamponu aktarın ve örnekleri saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Parankimal olmayan parankimal karaciğer hücreleri (Şekil 1 ve 2a) ihtiva eden bir tek hücre süspansiyonu enzimler sonuçlar için yeni bir karışımı ile karaciğer, sindirim için burada sunulan prosedür. Kırmızı kan hücrelerinin ACK-Lize etme sonrasında tek hücre süspansiyonu sitometri analizi doğrudan akım olanağı (Şekil 1 ve 2) 'dir. Yolluk strateji çiftler ve ölü hücreleri (Şekil 2a) dışlanması içerir...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Karaciğer iltihabı, farklı kökenlerden gelen hasarı progenitör hücre genişlemesi ve aktivasyon 2, 3 ile birlikte karaciğerdeki yenilenme sürecini tetikler. Bu karaciğer progenitör hücrelerin hücre özelliklerini kök sahip ve büyük olasılıkla çeşitli karaciğer hastalıklarının mekanizmasında önemli bir rol oynamaktadır.

Karaciğer progenitör hücrelerin heterojenliği uzun önerilmiştir. Farklı yüzey belirteçleri taşıyan alt kümelerini beli...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları var.

Teşekkürler

Bu çalışma VLK Alexander von Humboldt Vakfı Sofja Kovalevskaja Ödülü ile desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
RPMIYaşam Teknolojileri21875-034
fenol kırmızı içermeyen DMEMYaşam Teknolojileri31053-028
FBSYaşam Teknolojileri10270-106
Kollajenaz PSigma-Aldrich11249002001
DNAse-ISigma-Aldrich10104159001
DispaseYaşam Teknolojileri
ACK Lysing Tampon YaşamTeknolojileriA10492-01
HBSSYaşam Teknolojileri14025-050
PBSSigma-AldrichD8537
Sodyum AzidSigma-AldrichS2002%1 stok çözeltisi hazırlayın
%10 BSAMiltenyi Biotec130-091-376
autoMACS Durulama ÇözeltisiMiltenyi Biotec130-091-222%0,5 (h/h) BSA ekleyin ve buz üzerinde saklayın
Fenol kırmızısı içermeyen DMEMSigma-AldrichD1145
sayma Boncuk Sayısı BrightLife TechnologiesC36950
PIMiltenyi Biotec130-093-233
FcR Bloke ReaktifMiltenyi Biotec130-092-575
anti-CD31 Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-097-418
anti-CD45 Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-052-301
Ölü Hücre Temizleme KitiMiltenyi Biotec130-090-101
anti-Biotin Mikro BoncuklarMiltenyi Biotec130-090-485
CD64 SaflaştırılmışBioLegend139302Seyreltme: 1:100
CD16/32 SaflaştırılmışBioLegend101302Seyreltme: 1:100
CD45 APC/Cy7BioLegend103116Seyreltme: 1:200, hematopoetik hücreleri işaretler
CD31 BiotinBioLegend102504Seyreltme: 1:200, endotel hücrelerini işaretler
ASGPR1 SaflaştırılmışBio-TechneAF2755-SPSeyreltme: 1:100, hepatositleri
işaretler Podoplanin APCBioLegend127410Seyreltme: 1: 1.400, progenior hücreleri işaretler
Podoplanin BiotinBioLegend127404Seyreltme: 1: 1.400
CD133 PEMiltenyi Biotec130-102-210kullanım 3 & mikro; L, progenitör hücreleri işaretler
CD133 BiotinBioLegend141206Seyreltme: 1:100
CD34 BiotineBioScience13-0341-81Seyreltme: 1:100
CD90.2 Pasifik MavisiBioLegend140306Seyreltme: 1:800
CD157 PEBioLegend140203Seyreltme: 1:600
EpCAM Brilliant Violet 421BioLegend118225Seyreltme: 1:100
Sca-1 BiotinMiltenyi Biotec130-101-88510 & mikro kullanın; L
Fare IgG2b, κ PEBioLegend400311
Sıçan IgG1 PEBioLegend400407
Sıçan IgG2b, κ APC/Cy7BioLegend400624
Sıçan IgG2a, κ BiotinBioLegend400504
Sıçan IgG2a, κ Parlak Menekşe 421BioLegend400535
Suriye Hamsterı IgG APC BioLegend402012
Suriye Hamsterı IgG BiotinBioLegend402004
Normal Keçi IgG Kontrolü SaflaştırılmışBio-TechneAB-108-C
Eşek Anti-Keçi IgG Alexa Fluor 488Yaşam TeknolojileriA11055Seyreltme: 1:800
Streptavidin Alexa Fluor 405Yaşam TeknolojileriS32351Seyreltme: 1:400
100 & mikro; m Filtre ağıA. HartensteinPAS3
LS SütunMiltenyi Biotec130-042-401
QuadroMACS ayırıcıMiltenyi Biotec130-090-976
MACSQuant Analiz Cihazı 10Miltenyi Biotec130-096-343
AutoMACS Pro AyırıcıMiltenyi Biotec130-092-545
FACS AriaTMIIIBD Biosciences
FACSDiva yazılımıBD Biosciences
Polipropilen Yuvarlak alt tüpFalcon352063
Rneasy plus mini kitQiagen74134RLT lizis tamponu dahildir
17105041

Kaynaklar

  1. Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
  2. Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
  3. Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
  4. Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
  5. Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
  6. Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
  7. Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
  8. Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
  9. Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
  10. Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
  11. Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
  12. Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
  13. Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
  14. Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
  15. Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
  16. Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
  17. Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
  18. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12(2011).
  19. Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Karaci er Projenit r H creleriAk Sitometrisi AnaliziManyetik Mikroboncuk Ay rmaFACS S ralama Y ntemleriKaraci erin Enzimatik DisosyasyonuH cre Y zeyi BoyamaCD45 CD31 ASGPR1GP38 CD133 EkspresyonuProjenit r Alt K me zolasyonu

İlgili makaleler