Yöntem makalesi

Bitki Buz yakınlık Arıtma kullanma Buz yeniden kristalleşme İnhibisyon ve İzolasyonu Değerlendirilmesi sayesinde Proteinler Buz bağlayıcı tanımlanması

DOI:

10.3791/55302

⸱

5 Mayıs 2017

 ,  , 
1Department of Biology, Queen's University, 2Department of Biomedical and Molecular Sciences, Queen's University, 3School of Environmental Sciences, Queen's University

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, buz yeniden kristalleşme engelleme etkinliği ve buzlu afinite saflaştırmasını kullanarak yerel öğren daha sonra tecrit değerlendirme yoluyla dondurularak dayanıklı bitkiler buz bağlayıcı proteinin tanımlanmasını açıklar.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buz-bağlayan proteinler (öğren) sıfırın altındaki sıcaklıklara maruz belirli organizmalar tarafından sentezlenir stres kaynaklı bir protein ailesine aittir. Hücre dışı buz kristalleri büyüdükçe bitkilere, dondurarak hasar plazma membranları ve olası hücre ölümünün yırtılması sonuçlanır. Buz kristallerine öğren adsorpsiyonu, böylece, hücresel hasarı düşürerek, buz yeniden kristalleşme engelleme (IRI) olarak bilinen bir süreç ile daha fazla büyümesini kısıtlar. Öğren, denge erime noktasının altında bir çözeltisine, termal histerezis (T-H) aktivitesi olarak bilinen bir özelliği, donma noktasını düşürmek için yeteneğini göstermektedir. Bu koruyucu özellikler nedeniyle, endüstriyel, tıbbi ve tarımsal uygulamalarda potansiyel kullanımlarına yeni öğren belirlenmesinde çekmektedirler. Bu çalışma, 1 ile bitki öğren belirlenmesini) indüksiyonu ve çıkarma öğren bitki dokusunda, 2) IRI aktivitesi için özleri tarama, ve 3) izolasyon ve Purif tarifÖğren ait ication. Düşük sıcaklık maruz öğren sağlanmasının ardından, özü ve standart bir ışık mikroskobu kullanılarak, buz kristali büyümesinin gözlem sağlayan bir 'splat tahlili' kullanılarak IRI aktivitesi için test edilir. Bu deney, düşük protein konsantrasyonu gerektirir ve hızlı bir şekilde elde edilebilir ve kolayca buz bağlayıcı aktivitesi için bir başlangıç ​​ekranını sağlayan yorumlanır sonuçlar üretir. Öğren sonra 'buz-afinite saflaştırma' adı verilen bir teknikle, buz adsorbe etmek öğren özelliğini kullanarak kirletici proteinler izole edilebilir. Bitki özlerinden derlenen hücre lizatları kullanılarak, bir buz yarımküre yavaş yavaş bir pirinç sonda üzerinde yetiştirilebilir. Bu polikristal buz kristal yapısına öğren içermektedir. Bir IBP önsel biyokimyasal ya da yapısal bilgiye gerektiren bu yöntem, aktif proteinin geri kazanımını sağlar. Buz ile saflaştırılmış protein fraksiyonları moral tanımlanması da dahil olmak üzere alt uygulamalar için kullanılabilirkütle spektrometrisi ve doğal proteinlerin biyokimyasal analizi ile başlıktaki dizileri.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Buz-bağlayan proteinler (öğren) bitkilerde 1, böcekler 2, balık 3 ve mikroplar 4 de dahil olmak üzere bir organizma sayısı tespit edilmiştir koruyucu proteinlerin farklı bir familyasıdır. Bu proteinlerin önemli bir özelliği, özellikle ve verimli bir şekilde büyümesini düzenleme, buz kristallerine adsorbe için kendi benzersiz yeteneğidir. Öğren birkaç belgelenmiş özelliklere sahip iki en iyi karakterize edilmiş olan termal histerezis (TH) ve buzlu rekristalizasyon inhibisyon (IRI) ile yıkanmıştır. TH aktivitesi daha kolay dondurularak tolere hayvanlarda üretilen öğren gözlenir. donmayı önlemek için organizmaların dolaşım veya geçiş sıvıların donma noktası düşürmede Bu etki gösterir. Buna karşılık, kaçınılmaz olarak sıfırın altındaki sıcaklıklarda donacak dondurularak toleranslı organizmalar, içinde, öğren düşük TH aktivitesine sahip görünmektedir. Düşük TH aktivite rağmen yüksek bir IRI aktivite buz ağlama kısıtlamak içinStal büyüme genellikle bu proteinlerle görülmektedir. Dondurularak toleranslı organizma için bu IRI aktivitesi muhtemelen dışı bölümlerde buz kontrolsüz büyümesi hücreleri korumaya yardımcı olur.

"Yatak düğmesi" modeli öğren buz kristallerinin 5 büyümesini önlemek mekanizmayı tarif etmek için kullanılabilir. Bu modelde, öğren özellikle su molekülleri bağlı öğren arasındaki boşlukta gelişen buz kristal kafesi ile birleştirmek için bu şekilde aralıklarla buz kristali yüzeyine adsorbe eder. Bu ilave su moleküllerinin eklenmesi elverişsiz kılan bir eğrilik Gibbs-Thompson etkisiyle 6 ile tarif edilebilir bir olay oluşturur. Bağlantılı klatrat suları hipotez buz kristali yüzeyine öğren spesifik bağlanmasını için bir mekanizma sağlar; reo spesifik olarak, protein buz bağlanma alanı üzerine yerleştirilmiş yüklü kalıntıların varlığı, sonuçSu moleküllerinin rganization böylece buz kristal kafes 7'nin bir ya da daha fazla uçak eşleşir.

TH aktivite erime arasındaki fark ölçülerek ve bir IBP mevcudiyetinde bir tek buz kristali donma sıcaklığının ile kantifiye edilebilir. TH aktivitesi öğren (a derece, tipik olarak sadece bir kısmı), bitki öğren tarafından üretilen düşük GAP etkinliğini değerlendirmek için yaygın olarak kabul edilen yöntem olsa da, normal olarak yüksek bir protein konsantrasyonu, özel ekipman ve operatör deneyimi gerektirir. olmayan öğren buz kristali büyümesinin sınırlamak olsa da, tüm öğren ve böylece IRI aktivitesi için test edilmesi ile paylaşılan bir özellik, özellikle düşük TH aktivitesine sahip olanlar için, öğren mevcudiyeti için etkili bir başlangıç ​​ekran. Bu aktiviteyi test etmek için kullanılan yöntem, bir protein numunesi flaş olmadığını belirlemek için belirli bir süre boyunca gözlenir küçük buz kristallerinin, bir tek tabaka üretmek için dondurulur ve böylece, bir 'splat tahlili' olarak bilinirbuz kristali büyümesi ile sınırlıdır. Öğren varlığı için bir kaynak doku örneği taramak için kullanılan diğer yöntemlerin aksine, bu yöntem 10-100 ng aralığında düşük protein konsantrasyonları için geçerlidir, kolayca imal teçhizatı kullanmaktadır ve hızlı ve kolay bir yorumlanır verileri üretir. Bununla birlikte, deneyin, TH belirlenmesi ve buz kristali şekillendirme ile takip edilmelidir öğren için bir başlangıç ​​ekranını sağladığını vurgulamak önemlidir.

doğal proteinlerin izolasyonu genellikle ilgi konusu bir proteinin yapısal ve biyokimyasal özellikleri ile ilgili bilgi gerektiren zor bir iştir. buz öğren afınite saflaştırma amaçları için bir alt-tabaka olarak buz kullanılarak bu proteinlerin izolasyonu sağlar. moleküllerin büyük çoğunluğu, buz kristali büyümesi, yüksek saflaştırılmış örnekteki bir IBP örnek sonuçlarının mevcudiyetinde bir buz yarıkürenin düşük büyüme, büyük quantit yoksun esnasında öncesinde buz-su sınır itilir yanaproteinler ve çözünmüş kontamine ler. Bu yöntem, böcek 8, 9, 10, bakteriler 11, balık 12 ve bitkiler 13, 14 öğren tanımlamak için kullanılmıştır. Buna ek olarak, bu yöntem sayesinde elde edilen IBP zenginleştirilmiş kısımlar, aynı zamanda aşağı biyokimyasal analiz için kullanılabilir. Bu kağıt öğren indüksiyonu ve ekstraksiyon yoluyla bitkilerde öğren tanımlanmasını açıklar, IRI faaliyeti analizi proteinlerin, ve buz afinite saflaştırması kullanılarak proteinlerin izolasyonunu doğrulamak için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Splat tertibat Ayar

  1. etilen glikol (% 50 v / su içinde hacim) olan bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun.
    Not: Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir.
  2. Harici odasını monte etmek için, bir çift duvarlı cam kaseye su banyosu takmak için yalıtılmış plastik boru kullanılmalıdır. polistiren köpük cam kase izole ve bir plastik petri kabı bir kapak ile kaplayın. Işık kaynağı, cam odasının içinden görülebilir ve böylece polistiren bölmenin tabanında yer alan 3-4 inçlik bir delik.
  3. Bir kamera portu ve bir 10x oküler lens ile bir 4X polarize objektif lens ile donatılmış bir diseksiyon mikroskobu üzerinde dış odasını, monte edin. Dış haznenin altına polarize filmin ek bir parça yerleştirin.
  4. imbik tezgahının tabanında boru altında yer alan bir soğutma bloğu ile birlikte, büyük bir polistiren kap içinde bir otoklav standı ve yer üzerine 1-1.5 m borusu (~ 5 cm çapında) kelepçe.

Doğal protein 2. Hazırlık IRI Analiz için özler

  1. Düşük ışık koşullarında (6 saat ışık / 18 saat karanlık) altında, 4 ° C 'de en fazla 1 hafta dondurularak dayanıklı otları ve diğer donma toleranslı bitki türleri, soğuk iklime alışmaları bitkilerde öğren ekspresyonunu indüklemek için. Bu zaten düşük sıcaklık koşullarında ve aklimasyonundan dönemleri maruz kalmış sahadan toplanan numuneler için geçerli değildir.
  2. sapının kesilerek yaprak dokusunun yaklaşık olarak 0.1 g elde edilir ve daha sonra 1.5 ml bir tüp içinde yer. Kullanımdan hemen kadar -80 ° C'de sıvı azot ve mağaza örnek flaş dondurma.
  3. , Hücreler lize edildi, sıvı azot altında bir havan ve havan tokmağı kullanılarak ince bir toz halinde doku öğütülmesine için. Sıvı azot homojenleştirme işlemi sırasında buharlaşmaz emin olun.
  4. Hemen buz üzerinde yer örnekleri yer ve sıvı azot tamamen buharlaşmasına izin verin. bir doğal protein extracti 1 ml ekleyin10 mM Tris-HCl, 25 mM NaCl (pH 7.5) ihtiva eden, iki EDTA içermeyen proteaz inhibitörü tableti içeren tampon, kullanımdan hemen önce eklenmiştir. Karıştırmak için pipet; Girdapsız davranma
    NOT: lizat ikincil metabolitler içeriyorsa ilave katkı maddelerinin kullanılması gerekebilir (bkz. Tartışma).
  5. Örnekleri gece boyunca (18-24 saat) 4 ° C'de hafifçe çalkalayın. Kalan adımları 4 ° C'de gerçekleştirin.
  6. 5 dakika boyunca ~ 16,000 xg'de numuneleri santrifüj ederek hücre döküntülerini alın. Hücresel enkaz devam ediyorsa, çözünür fraksiyonu ve santrifüjü ilave 5 dakika muhafaza edin. Açıklanan numuneler kullanıma kadar -20 ° C'de saklanabilir.

3. Splat Assay Deney öncesi kurulum

  1. Polarize film ile kurulan harici odaya 100 mL hekzan dökün ve slaytlar üzerinde nem oluşmasını önlemek için 5-6 kurutucu boncuk ekleyin. Hamamı kaplayan plakaya az miktarda vakum gres ekleyin ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamak ve hekzanın buharlaşmasını önlemek için bükün.
  2. Deneye başlamadan önce, arasında -4 ° C ve -6 ° C programlanabilen bir su banyosu kullanılarak yaklaşık olarak 2-3 saat heksan banyosu soğutulur. deney başlamadan önce bir termometre ile hekzan sıcaklığını kontrol etmek emin olun.
  3. Doğrudan plastik tüp altında bir polistiren kutu soğutma blok yerleştirin ve kuru buz tamamen deney başlamadan önce 40 dakika kapsamaktadır.
  4. tahlil başlamadan önce tüp seviyesi olduğundan emin olun. Örnek düşecek soğutma bloğu, birinci test ile burada su ile prosedür belirlemek ve (aşağıda tarif edildiği gibi) bir numune, bir marker ile düşünceye göstermek için.
  5. Soğuk bloğun üstünden kuru buz çıkarın ve suyla belirlenmiştir damla işareti üstünde cam mikroskop kapak slayt yerleştirin.
  6. Hemen Deneye başlamadan önce, ışık kaynağı açmak ve cam bölmenin alt kısmında oluşturulmuş olan herhangi bir buz kazıyın. buz kristalleri sürece ışık kaynağını tutmamaya özenheksan ısıtma önlemek için görüntülenmiştir edilmektedir.

4. Splat tahlili yapılması

  1. bir kağıt havlu fazla yağı kaldırmak kullanarak, immersiyon otomatik pipet (1-20 ul) yapıştırılmış atılabilir ucu batırın. Bu adım örnek düşmek yerine pipet dışına uymak sağlayacaktır.
    NOT: pipet fazla yağı çıkarma yağ damlacıkları görselleştirme zorlaştırır buz kristalleri üzerinde oluşturmuyor sağlamak için kritik öneme sahiptir.
  2. şirketinden örnek bırakmadan önce plastik boru üzerine numune ve yer pipetin pipet 10 uL. Numune buz kristallerinin bir tek tabaka oluşturmaya, cam kapak slayt çarptığında bir tat 'splat' sesi duyulmalıdır.
  3. Çabuk ve dikkatle polarize filmin üstünde hekzan banyosuna cımbız ve yer kullanarak soğuk bloktan mikroskop lamı çıkarın.
  4. Mikroskop altında bakıldığında, görünümü ve reklamın alanına mikroskop lamı koymakSadece objektif lens böylece çapraz polarizasyon yüksek kontrast buz kristallerinin olarak gösterebilir. 40x büyütme ayarlayın.
  5. mikroskoba kamera takın ve buz kristallerinin net görüntülenmesine yol açar ve görüntüyü yakalamak için "makro" için ayarları yapın.
    NOT: 1 saat kadar bekleyen buz kristalleri daha net bir görüntü verebilir büyümeye izin vermek.
  6. Tekrarlayın tüm numuneler için 4,1-4,5 adımları tekrarlayın. Tipik olarak, heksan odasında farklı numune ile 6 slaytlar yerleştirebilir.
  7. sıkı bir mühür sağlanması ışık kaynağını kapatın ve hekzan küvetin üzerinde plastik tabak koyun. (Belirli bir analiz içinde, tutarlı bir tavlama süresi tutarak, 12-24 saat) buz kristalleri gece boyunca tavlanmasına izin verin. İnkübasyon sonrasında, buz filmlerin yakalama görüntüleri yukarıda açıklandığı gibi.
    NOT: Bazı numuneler diğerlerinden daha çabuk rekristalize edilebilir. bir yeniden kristalizasyon, 12 saat sonra olması halinde, 24 saate kadar herhangi bir yeniden kristalize olmasını sağlamak için kristaller tavlanmasına izin verecekkıymetleştirme meydana gelecektir.

5. Splat tahlili Veri Analizi

  1. Fotoğrafları bilgisayara yükleyin ve doğrudan öncesi ve tavlama sonrası buz kristallerinin büyüklüğünü karşılaştırın. bir IRI faaliyeti olmayan örnekler fark daha büyük buz kristallerinin oluşturulması yeniden kristalleşen ise buz yeniden kristalleşme aktivitesi olan örnekler, büyüme olmaz. Işık girişim büyük buz kristalleri biraz farklı tonlar görünür ve böylece görmek kolaydır yapacaktır.

6. Buz yakınlık Arıtma Ekipmanları Kurulumu

  1. etilen glikol ile bir sıcaklığa programlanabilir dolaşan su banyosu doldurun. Yeşil otomotiv etilen glikol kullanılabilir.
  2. Yalıtımlı plastik boruyu 15 kullanılarak içi boş, pirinç proba banyo bağlayın.
  3. 150 mL çanak kuytu uyabildiği bir polistiren kap oluşturmak. pirinç soğuk parmağı için merkezi bir delik olan kap için bir kapak oluşturun.

7.Buz-afinite temizliği için Örneklerinin Hazırlanması

  1. Soğuk iklime alışmaları bitki dokusu olarak bölüm 2.1'de anlatıldığı.
  2. 20 ml tüpler içinde öğütülmüş biyokütle (aşama 2.3) ~ 100-150 g toplayın ve hemen dondurularak yanıp söner. Numuneler, kullanımdan önce -80 ° C'de muhafaza edilebilir.
  3. bölümlerde 2.3-2.5 tarif edildiği gibi örnek hazırlayın. yaprak dokusunun yeniden süspanse edilmesi için: 1 oranında (doğal protein ekstraksiyon tamponu ml doku mg olarak verir:), 1 kullanın. endojen proteaz ile öğren bozulmasını önlemek için ek proteaz inhibitör tabletleri kullanın.
    Not: 2 veya 1: 3 (dokusunun mg: doğal protein ekstraksiyon tamponu mL) doku örneği, çok konsantre olduğunda, 1 oranının ayarlanması.
  4. Hücresel enkaz kaldırmak için tülbent 2 kat, 3 kat aracılığıyla lizat eleyin. 4 ° C'de 40 dakika boyunca 30,000 x g'de santrifüj ile artık taneleri.
  5. doğal protein çıkarma tamponu kullanarak 120 mL numune hacmini artırır. buz afinite temizliği için hemen lizat kullanınbuz bağlayıcı aktivitesi kaybını önlemek.

8. İletken buz afinite saflaştırma

  1. saflaştırma öncesinde, -0.04 ° C / saatlik bir oranda ° -3 için -0.5 ° C'den soğumaya programlanabilen bir su banyosu ayarlayın.
    Not: soğutma hızı numunenin başlangıç ​​hacmine bağlı olarak ayarlanabilir.
  2. -0.5 ° C'ye kadar buz parmak soğutun ve daha sonra soğuk damıtılmış su ihtiva eden bir 50 mL tüp içine daldırılması. parmağına oluşturmak üzere buz ince bir tabaka buz çekirdekleşmeyi kolaylaştırmak ve sağlamak için bir kaç buz yongaları ekleyin. Bu işlem, tipik olarak, 20 ile 30 dakika sürer.
    Not: buzla kaplanmış parmak bütün topaklar önceki çalışmalar yerleştirilmesi için bir eldivenli eli ile düzeltilmelidir. bir buz tabakası -0.5 ° C de meydana değilse, -0.75 ° C'ye sıcaklığını düşürmek.
  3. Manyetik karıştırıcı üstünde bir polistiren kap içine küçük bir manyetik karıştırma çubuğu içeren 150 mL glass beher içinde yer örneği. buz parmak olduğundan emin olunmerkezli ve sıvı numune içine en az yarı yol düşürdü. bir kap kapağı.
  4. 24 saatte bir kontrol programı yaklaşık iki gün boyunca çalışmasına izin verin. Numunenin% 50 dondurulmuş sonra, bir program dur. Buz yarımkürede içine öğren katılması "buz aşındırma" sonuçlanacaktır.
    NOT: Arıtma deneyleri program çalışır buna göre ayarlanır hangi süreye sahip büyük örnek hacimleri kullanılarak yapılabilir.
  5. 4 ° C'ye kadar prob, buz yarı-küresinin kaldırmak ısınmaya amacıyla, bağlanmamış proteinin ayrılması için damıtılmış su ile yarım küre yıkayın ve daha sonra 4 ° C'de eritin.
    Not: çoğu öğren su ve uygun bir tampon içinde kararlı değildir (diğer bir deyişle, 50 mM Tris-HCI, pH 8 ya da 50 mM amonyum bikarbonat, pH 8) çözülme işlemi sırasında periyodik olarak ilave edilmesi gerekir (yaklaşık 1 mL / 2 saat) . Buz hemisfer alüminyum folyo ile sarılmış ve önceki eritme -20 ° C'de saklanabilir.
  6. buz yarımküre hala içeriyorsas pigment ya da örnek saflaştırma geliştirmek için, tekrar 8,1-8,5 2-3 yineleyin.
    Not: IBP konsantrasyonu düşük saflaştırma çok sayıda mermi aşağıdaki rağmen, saflık saflaştırılmış örnekleri MS kullanılarak analiz edilecektir verim daha değerlidir. yeterli malzeme mevcut ise, buzlu afinite saflaştırma üç tur önerilmektedir.

Öğren 9. tanımlanması

  1. Öğren buz yarıküre erimeyi takiben büyük hacimde içerdiği için, numune konsantre edin. Küçük protein kaybını önlemek için bir 3000 Da molekül ağırlığı kesmesi ile santrifüj konsantrasyon tüpler kullanılarak ~ 1-3 mL doku ~ 100 g içeren örnekler konsantre edilir.
  2. MS örnekleri göndermeden önce, bu tür bir BCA veya Bradford analizi gibi bir protein miktar tahlil kullanılarak protein konsantrasyonunu belirlemek. SDS-PAGE gibi jel elektroforezi ile numunelerin saflık tahmin. se önce IRI aktivitesi için saflaştırılmış proteinler testMS nding aktif protein saflaştırma ve konsantrasyon adım adım muhafaza edildiğinden emin olmak için.
  3. Kütle spektrometre analizi 10 doğrudan konsantre örnekleri kullanın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kurulum kolaylığı için, Şekil 1 ve Şekil 2, sırasıyla IRI analizi ve buzlu afinite temizliği için kullanılan ekipman, görsel bir gösterge olarak dahil edilmiştir. Öğren olan ve olmayan hardal otu toplanan özler kullanılarak IRI analiz sonuçları Şekil 3'te gösterilmiştir. Bu sonuçlar, dondurularak dayanıklı değildir hardal otu, toplanan ekstraktlar bağlı öğren mevcut olmaması buz k...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Öğren başarıyla analiz ve saflaştırma için, proteinlerin bazı sıcaklığa duyarlı doğasını anlamak önemlidir. Bazı bitki öğren açılması, çökeltme ve işlem içinde elde edilen, 0 ° C'nin üzerindeki sıcaklıklarda stabil hale gelir. Aktif öğren elde etmek için, bitkiler, soğuk bir odada (~ 4 ° C) içinde işlenir ve numuneler, deney sırasında buz üzerinde tutulur, çok daha önemlidir. Bütün hücreli ham lizatları kullanılarak endojen proteazlar tarafından proteinlerinin parçalanma olduğunda diğer bir faktör dikkate. Bitkilerd...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma VKW bir NSERC (Kanada) hibe ile finanse edildi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
1,5 mL mikrosantrifüj tüpleriFisher05-408-129
Ayarlanabilir laboratuvar jakıFisherS63080
Tezgah üstü santrifüjDesaga MC2
Pirinç probÖzel yapım
Kamera/kamera bağlantı noktasıCanonCanon Power Shot SX110 dijital kamera; özel yapım mikroskop bağlantı noktası
TülbentPurewipe/Fisher Scientific06-665-25A
Konsantrasyon tüpleri (0,5 mL)EMD MilliporeUFC501008
Konsantrasyon tüpleri (15 mL)EMD MilliporeUFC900308
Konik tüpler (50 mL)Thermo FisherAM12502
Soğutma bloğuVWR13259Metal bir ısıtma bloğu kullanın
Nem AlmaWhirlpool50 pint Energy Star nem alma cihazı; yerel tedarikçiden satın alma
Dessciation boncuklarıt.h.e. Dessicant/VWREM-DX0017-26-8 ağ boyutu; %100 gösterge
Diseksiyon mikroskobuOlympus Tokyo
Çift cidarlı cam kaseJenerikYerel laboratuvar cam eşya tedarikçisinden satın alma
buzJenerikYerel tedarikçiyi kullanın; tehlikeli 
EDTA-proteaz inhibitör tabletleriSigma Aldrich11836170001Roche cOmplete mini
Etilen glikolJenerikYeşil otomotiv etilen glikolü herhangi bir yerel hırdavatçıdan satın alınabilir (yani Home Depot)
HekzanSigma Aldrich296090Susuz, %95; tehlikeli
Daldırma yağıSigma Aldrich56822
JA10 / 20 santrifüjBeckman
Büyük plastik Petri kabıJenerik
Sıvı nitrojenJenerikKullanım yerel tedarikçi; tehlikeli 
Manyetik karıştırma plakasıHanna InstrumentsHI190M
Mikroskop kapak slaytlarıFisher12-542A
Plastik tüpGenelYerel hırdavatçıdan PVC boru satın alın
Polarize filmEdmund Optics43-781
Polistiren köpükJenerikPolistiren nakliye kutularından yapılabilir
Poreclain harcı ve havaneliFisherFB961
PVPPSigma Aldrich77627110 & m parçacık boyutu
İmbik StandıFisher12-000
Küçük karıştırma çubuğuFisher14-513-51
Sıcaklık programlanabilir su banyosuVWR13271-118
Vakum gresiDow Corning/Sigma AldrichZ273554
Vinil boruJenerik
Cihazı Kuru

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sidebottom, C., et al. Heat-stable antifreeze protein from grass. Nature. 406 (6793), 256(2000).
  2. Duman, J. G. Antifreeze and ice nucleator proteins in terrestrial arthropods. Annu Rev Physiol. 63, 327-357 (2001).
  3. Davies, P. L., Hew, C. L. Biochemistry of fish antifreeze proteins. FASEB J. 4 (8), 2460-2468 (1990).
  4. Gilbert, J. A., Hill, P. J., Dodd, C. E., Laybourn-Parry, J. Demonstration of antifreeze protein activity in Antarctic lake bacteria. Microbiology. 150 (Pt 1), 171-180 (2004).
  5. Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. L. 59 (20), 409-418 (1991).
  6. Yeh, Y., Feeney, R. E. Antifreeze proteins: structures and mechanisms of function. Chem. Rev. 96 (2), 601-618 (1996).
  7. Smolin, N., Daggett, V. Formation of ice-like water structure on the surface of an antifreeze protein. J. Phys. Chem. B. 112 (19), 6193-6202 (2008).
  8. Graham, L. A., Davies, P. L. Glycine-rich antifreeze proteins from snow fleas. Science. 310 (5747), 461(2005).
  9. Hawes, T. C., Marshall, C. J., Wharton, D. A. Antifreeze proteins in the Antarctic springtail, Gressittacantha terranova. J. Comp. Physiol. B. 181 (6), 713-719 (2011).
  10. Basu, K., Graham, L. A., Campbell, R. L., Davies, P. L. Flies expand the repertoire of protein structures that bind ice. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 112 (3), 737-742 (2015).
  11. Guo, S., Garnham, C. P., Whitney, J. C., Graham, L. A., Davies, P. L. Re-evaluation of a Bacterial Antifreeze Protein as an Adhesin with Ice-Binding Activity. PLoS One. 7 (11), e48805(2012).
  12. Marshall, C. B., Fletcher, G. L., Davies, P. L. Hyperactive antifreeze protein in a fish. Nature. 429 (6988), 153(2004).
  13. Zhang, D. Q., Liu, B., Feng, D. R., He, Y. M., Wang, J. F. Expression, purification and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants. Protein Expr. Purif. 35 (2), 257-263 (2007).
  14. Gupta, R., Dreswal, R. Low temperature stress modulated secretome analysis and purification of antifreeze protein from Hippophae rhamnoides, a Himalayan wonder plant. Proteome Res. 11 (5), 2684-2696 (2012).
  15. Kuiper, M. J., Lankin, C., Gauthier, S. Y., Walker, V. K., Davies, P. L. Purification of antifreeze proteins by adsorption to ice. Biochem. Biphys. Res. Commun. 300 (3), 645-648 (2003).
  16. Middleton, A. J., et al. Isolation and characterization of ice-binding proteins from higher plants. Methods Mol. Biol. 1166, 255-277 (2014).
  17. Bredow, M., Vanderbeld, B., Walker, V. K. Ice-binding proteins confer freezing tolerance in transgenic Arabidopsis thaliana. Plant Biotechnol. J. , (2016).
  18. Olijve, L. L., et al. Blocking rapid ice crystal growth through nonbasal plane adsorption of antifreeze proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 113 (14), 3740-3745 (2016).
  19. Zakharov, B., et al. Ice Recrystallization in a Solution of a Cryoprotector and Its inhibition by a Protein: Synchrotron X-Ray Diffraction Study. J. Pharm. Sci. 105 (7), 2129-2138 (2016).
  20. Capicciotti, C. J., et al. Small molecule ice recrystallization inhibitors enable freezing of human red blood cells with reduced glycerol concentrations. Sci. Rep. 5, 9692(2015).
  21. Knight, C. A., Cheng, C. C., DeVries, A. L. Adsorption of alpha-helical antifreeze peptides on specific ice crystal surface planes. Biophys. J. 59 (2), 409-418 (1991).
  22. Van Driessche, E., Beeckmans, S., Dejaegere, R., Kanarek, L. Thiourea: the antioxidant of choice for the purification of proteins from phenol rich plant tissues. Anal. Biochem. 141 (1), 184-188 (1984).
  23. Marshall, C. J., Basu, K., Davies, P. L. Ice-shell purification of ice-binding proteins. Cryobiology. 72 (3), 258-263 (2016).
  24. Basu, K., et al. Determining the ice-binding planes of antifreeze proteins by fluorescence-based ice plane affinity. J. Vis. Exp. (83), e51185(2014).
  25. Sandve, S. R., Rudi, H., Asp, T., Rognli, O. A. Tracking the evolution of a cold stress associated gene family in cold tolerant grasses. BMC Evol. Biol. 8 (245), (2008).
  26. Middleton, A. J., Brown, A. M., Davies, P. L., Walker, V. K. Identification of the ice-binding face of a plant antifreeze protein. FEBS Lett. 583 (4), 815-819 (2009).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Splat AnaliziTermal HisterezisBitki Dokusu EkstraksiyonuBuz Hemisfer Olu umuK tle SpektrometrisiNanolitre OsmometreDonma Tolerans

İlgili makaleler