Method Article

Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

DOI:

10.3791/55304

⸱

March 16th, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

In This Article

Erratum Notice

Important: There has been an erratum issued for this article. Read More ...

Erratum

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3 boyutlu yetiştirilen Caco-2 hücreleri bir in vitro hücre kültürü modeli ve fare bağırsak bir ex vivo modeli kullanılarak bağırsak serotonin taşıyıcısı (SERT) fonksiyonu ve ifadesinin düzenlenmesi çalışma basit bir yöntem tarif eder. Bu yöntemler, diğer epitelyal taşıyıcılar çalışma için de geçerlidir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bağırsak epiteli yabancı parçacıklara bir bariyer sağlarken vücudun normal fizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynayan önemli ulaşım ve bariyer fonksiyonları vardır. Bozulmuş epitel taşımacılığı (iyon, besin veya ilaç) birçok hastalıkla ilişkili bulunmuştur ve epitel bütünlüğünü ve bağırsak mikrobiyomları etkileyerek gibi taşıyıcılar, normal fizyolojik fonksiyonları ötesine sonuçlar doğurabilir. fonksiyonu ve transport proteinleri düzenlenmesini anlamak geliştirilmiş terapötik girişimlerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. epitel taşıma çalışmada büyük zorluk yerli bağırsak epitel hücrelerinin önemli özelliklerini özetlediği uygun bir model sistemi geliştiriyor. Bu Caco-2, T-84 ve HT-29-Cl.19A hücreleri gibi çeşitli in vitro hücre kültürü modelleri, tipik olarak epitel taşıma araştırmalarında kullanılmıştır. Bu hücre hatları e modelleme için bir indirgemeci yaklaşımı temsilpithelium ve epitel-mikrobiyal etkileşimleri bunların incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok mekanik çalışmalar, kullanılmıştır. Ancak, hücre mono tabakaları doğru hücre-hücre etkileşimleri hem de in vivo mikro-yansıtmamaktadır. 3D yetiştirilen hücreler, ilaç geçirgenliği çalışmaları için modeller umut verici olduğu gösterilmiştir. Bu 3D Caco-2 hücreleri, epitel taşıyıcıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Caco-2 hücrelerinde yapılan çalışmalar, hücre spesifik etkileri ekarte etmek ve dikkate yerli bağırsağın karmaşıklığı almak için diğer modelleri ile tamamlanmaktadır olması da önemlidir. Çeşitli yöntemler, daha önce bu izole epitel hücrelerinde veya izole edilmiş plazma zar veziküllerinde dışa eğik kesesi ve emme olarak taşıyıcılar, işlevselliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. modellerine saygı ve taşıma fonksiyonu ölçümü ile dikkate alan zorlukları alırsak, biz burada 3D Caco-2 hücreleri büyümek ve bir gibi bir Ussing odasının kullanımını tanımlamak için bir protokol göstermektediretkin bir yaklaşım gibi sağlam polarize bağırsak epitel olarak serotonin naklini ölçmek için.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

bağırsak epitel lümeninde sıvı salgılanması ve iyonların çeşitli taşıyıcı proteinler (kanalları, ATPazların, ko-nakliyeciler ve değiştiriciler) besin, elektrolit emilimi kadar sayısız fonksiyonları yerine, ve uyuşturucu ile donatılmıştır. Transport proteinleri vektörel bir şekilde iyonlar veya moleküller hareketine olanak elektrokimyasal eğimler oluşturur. Bu polarize epitel hücrelerinin en üst ve taban zarlarında taşıma sistemleri asimetrik dağılımları ile elde edilir. Buna ek olarak, bitişik epitel hücreleri urgan sıkı bağlantıları, en üst ve taban membran alanları arasında bileşenlerin zar içi difüzyon karşı bir engel olarak hizmet eden bu süreçte önemli bir rol o....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

jelatinli protein karışımı ile ilgili artan 3D Caco-2 hücre kültürü: Caco-2 3D kültür sisteminde bağırsak taşıyıcılar 1. Çalışma

  1. Çözülme büyüme faktörü 8 saat boyunca buz üzerinde, jelatinimsi bir protein karışımı düşük (ya da O / N), 4 ° C'de ilave edildi. Bir kez 1 mL veya daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de kullanıma veya deposu için 500 uL alikot yapmak çözülmüş.
  2. kültür gününde, buz üzerinde kültürü (RNA ve protein ekstraksiyonu için) plakaları ya da (immün) odacıklı slaytlar ön soğutma. Sekiz oyuklu bölmeli-cam slayt (ya da 6-plaka oyuk başına 120 uL) her bir oyuğuna, jelatinimsi protein karışımı 30 ul ekleyin ve yayılır. sürecin....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

3B, Caco-2 kisti immün, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Phalloidin aktin ile boyandı 3D kist iyi sınırlı lümen gösteren bir XY düzleminde bir temsilcisi görüntü Şekil 1A gösterilmiştir. lümen bakan tarafı apikal tarafı gösterir. Sağlam epitel fenotip bir 3D ortamda sonucunda kültüre epitel hücreleri. Aktin ve SERT eş lekeli gün 12, Farklı Caco-2 kistleri, Şekil 1B'de gösterilmiştir. Bir XY düzlemine (Şekil 1A'da gösterilen d.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bağırsak taşıma 10, 11, 12, 13, 14, 15 okumak için epitel mono tabakaları polarize tam olarak farklılaşmış Caco-2 hücre mono tabakaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bağırsak epitel hücrelerinin fizyolojik organizasyonunu taklit etmek için, 3D bir Caco-2 kültürün gelişmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Bağırsak epite.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RKG laboratuvarında MD/PhD öğrencisi olan Bay Christopher Manzella'ya makalemizi düzenlemeye ve düzeltmeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
10x PBSATCC ATCC& kayıt; HTB ve utangaç; 37&ticaret;Hücre
Konfokal Görüntüleme için10x PBSCarl Zeiss
3[H]-5-HT LabtekII152453Mikroskopi için kültür hücreleri
5-HT Gibco70013-032Tehlikeli madde değil
%95 O2-% 5 CO2 silindirKPL71-00-27Tehlikeli bir madde değil
Agar (Agar plakaları için)FischerBP151-100Akut toksisite, Ora
Agar (elektrot için)SigmaG7126-1KGTehlikeli bir madde değil
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLTehlikeli bir madde değil
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaP6148-500GYutulduğunda veya solunduğunda zararlı
CaCl2LifeTechnologiesA12380Tehlikeli bir madde değil
Caco-2 HücreleriSigmaA8806-5GTehlikeli bir madde değil
Hücre lizis TamponuFischerBP337-100Değil tehlikeli madde
Chabered slaytlarSigmaS5886-1KGTehlikeli bir madde değil
Kollajen Tip-1 ÇözeltisiSigmaS8045-500G
ElektrotlarSigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
Fetal sığır serumu (FBS)Corning356234Hücre dışı matris olarak kullanılır
FluoksetinQiagen74104
GentamisinATCC30-2003Hücre kültürü
Ortamı GlisinHücre Sinyali, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco15070-063
K2HPO4GibcoLife Technologies tarafından 15710-064
KOHGibco Life Technologiestarafından 15630-080
L-askorbik asit Gibco by Life Technologies10082147
Sıvı sintilasyon sayacı Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 Meta FizyolojikAletler, San Diego, CA EM-CSYS-8
Mannitol FizyolojikAletler, San Diego, CA P2304
MatrigelFizyolojik Aletler, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2>Fizyolojik Aletler, San Diego, CA DM MC6
Çok Kanallı Gerilim / Akım KelepçesiFizyolojik Aletler, San Diego, CA ve nbsp;P2300
NaClFizyolojik Aletler, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Normal Keçi Serumu (NGS, %10)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Kalem-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Protein tahlil reaktifiSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Proteinaz İnhibitörü KokteyliMEDOX, Chicago, IL stil G-12300
RNA kolay Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Tek Kanallı Elektrot Giriş Modülü Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Snapwell Odaları için KaydırıcılarSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Sodyum Fosfat (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Sodyum-Hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Tripsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratuvarları, Herkül, CA5000006
Ussing Odası (yalnızca oda)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Oda SistemleriSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296
MicrosopeLife Technologies tarafından

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. B....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Caco 2 Cells3D CultureUssing ChamberSerotonin TransportEpithelial TransportIntestinal EpitheliumSERT ProteinWestern BlotImmunofluorescenceCell Culture

Related Articles