Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için

16.2K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55304

⸱

16 Mart 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Illinois at Chicago, 2Department of Research, Jesse Brown VA Medical Center

* These authors contributed equally

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

3 boyutlu yetiştirilen Caco-2 hücreleri bir in vitro hücre kültürü modeli ve fare bağırsak bir ex vivo modeli kullanılarak bağırsak serotonin taşıyıcısı (SERT) fonksiyonu ve ifadesinin düzenlenmesi çalışma basit bir yöntem tarif eder. Bu yöntemler, diğer epitelyal taşıyıcılar çalışma için de geçerlidir.

Özet

bağırsak epiteli yabancı parçacıklara bir bariyer sağlarken vücudun normal fizyolojik fonksiyonlarında önemli rol oynayan önemli ulaşım ve bariyer fonksiyonları vardır. Bozulmuş epitel taşımacılığı (iyon, besin veya ilaç) birçok hastalıkla ilişkili bulunmuştur ve epitel bütünlüğünü ve bağırsak mikrobiyomları etkileyerek gibi taşıyıcılar, normal fizyolojik fonksiyonları ötesine sonuçlar doğurabilir. fonksiyonu ve transport proteinleri düzenlenmesini anlamak geliştirilmiş terapötik girişimlerin geliştirilmesi için kritik öneme sahiptir. epitel taşıma çalışmada büyük zorluk yerli bağırsak epitel hücrelerinin önemli özelliklerini özetlediği uygun bir model sistemi geliştiriyor. Bu Caco-2, T-84 ve HT-29-Cl.19A hücreleri gibi çeşitli in vitro hücre kültürü modelleri, tipik olarak epitel taşıma araştırmalarında kullanılmıştır. Bu hücre hatları e modelleme için bir indirgemeci yaklaşımı temsilpithelium ve epitel-mikrobiyal etkileşimleri bunların incelenmesi de dahil olmak üzere pek çok mekanik çalışmalar, kullanılmıştır. Ancak, hücre mono tabakaları doğru hücre-hücre etkileşimleri hem de in vivo mikro-yansıtmamaktadır. 3D yetiştirilen hücreler, ilaç geçirgenliği çalışmaları için modeller umut verici olduğu gösterilmiştir. Bu 3D Caco-2 hücreleri, epitel taşıyıcıları incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Caco-2 hücrelerinde yapılan çalışmalar, hücre spesifik etkileri ekarte etmek ve dikkate yerli bağırsağın karmaşıklığı almak için diğer modelleri ile tamamlanmaktadır olması da önemlidir. Çeşitli yöntemler, daha önce bu izole epitel hücrelerinde veya izole edilmiş plazma zar veziküllerinde dışa eğik kesesi ve emme olarak taşıyıcılar, işlevselliğini değerlendirmek için kullanılmıştır. modellerine saygı ve taşıma fonksiyonu ölçümü ile dikkate alan zorlukları alırsak, biz burada 3D Caco-2 hücreleri büyümek ve bir gibi bir Ussing odasının kullanımını tanımlamak için bir protokol göstermektediretkin bir yaklaşım gibi sağlam polarize bağırsak epitel olarak serotonin naklini ölçmek için.

Giriş

bağırsak epitel lümeninde sıvı salgılanması ve iyonların çeşitli taşıyıcı proteinler (kanalları, ATPazların, ko-nakliyeciler ve değiştiriciler) besin, elektrolit emilimi kadar sayısız fonksiyonları yerine, ve uyuşturucu ile donatılmıştır. Transport proteinleri vektörel bir şekilde iyonlar veya moleküller hareketine olanak elektrokimyasal eğimler oluşturur. Bu polarize epitel hücrelerinin en üst ve taban zarlarında taşıma sistemleri asimetrik dağılımları ile elde edilir. Buna ek olarak, bitişik epitel hücreleri urgan sıkı bağlantıları, en üst ve taban membran alanları arasında bileşenlerin zar içi difüzyon karşı bir engel olarak hizmet eden bu süreçte önemli bir rol oynar. Yerli bağırsak bu karakteristik özelliklerini taklit uygun model sistemler (örneğin polarizasyon, farklılaşma ve sıkı kavşak bütünlüğü) functio çalışma için kritikepitel taşıma sistemlerinin tesi.

modelleri ile ilgili olarak, intestinal epitel taşıma araştırmalarında anda kullanılan tipik hücre çizgileri, Caco-2, tam olarak farklılaşmış bir modeli olan küçük bağırsak epitel hücreleri absorbe; ve T84 hücreleri veya HT-29 alt klonlar, kript kaynaklı kalın bağırsak epitel hücreleri 1 modeller. Geleneksel olarak, bu hücre hatları plastik yüzeyler içinde mono-tabaka olarak veya kaplanmış Transwell yetiştirilir. Bir dereceye kadar trans-iyi hücre kültür ekleri polarize hücreleri basolaterally beslemeye izin vererek in vivo ortamda benzer. Bununla birlikte, geleneksel 2B kültür sistemlerinde bir sınırlama hücreleri, suni düz ve katı bir yüzeye uyum sağlamak zorunda olmasıdır. Böylece, yerli epitel fizyolojik karmaşıklığı doğru bir 2D sisteminde yansıtılmaz. Bu sınırlama, bu jelatinimsi proteini MIXTUR'a gibi belirli bir mikro-3D hücrelerin büyümesini yöntemler ile aşılmıştırE, hücre dışı matris bileşenleri, 2, 3, çeşitli ihtiva etmektedir. Bununla birlikte, in vitro kültürleri birden hücre tiplerini ve bağırsakta bölgeye özgü bir mimariye sahiptir bağırsak epiteli, karmaşıklığı taklit edemez. Bu nedenle, hücre kültürü modelleri kullanılarak çalışmalar, ana bağırsakta daha fazla değeri gerektirir. In vitro 3D hücre kültürü ve fare bağırsak mukozasını kullanarak, bağırsak serotonin transporter (SLC6A4, SERT) düzenlenmesi incelemek için buraya basit yöntemler açıklanmaktadır.

Bağımlı işlemi - SERT taşıyıcı hızla Na + / Cl üzerinden taşındığında, önemli bir hormon ve nörotransmitter, 5-hidroksitriptamin (5-HT) hücre dışı durumu düzenler. SERT, anti-depresanlar, bilinen bir hedef ve en son, ishal ve bağırsak iltihabı gibi GI bozukluklarının, yeni bir terapötik hedef olarak ortaya çıkmıştır.Yöntem bağırsak epitelial hücrelerinde 5-HT alım daha önce tarif edilmiştir araştırmak. Örneğin, plastik destek ya da geçirgen eklerde yetiştirilen Caco-2 hücreleri, üst ve taban üzerindeki etki 4 hem de fluoksetin duyarlı 3H-5-HT geri alımını sergiledikleri gösterilmiştir. Insan organ donörü ince bağırsaklarda hazırlanan izole fırça kenar zar vezikülleri (BBMVs) SERT fonksiyonunun ölçülmesi de bizim 5 tarafından tarif edilmiştir. İnsan BBVMs 3 H-5-HT alım fluoksetin duyarlı Na + / Cl olduğu gösterilmiştir - bağımlı ve 300 K m nM 5 doygunluk kinetiği göstermiştir. Benzer yöntemler kullanarak, aynı zamanda, daha önce, fare bağırsak BBMVs 6, 3H-5-HT alımı, SERT fonksiyonu ölçülen. Bununla birlikte, temiz plazma zar veziküllerinin hazırlanması doku mukozanın gerektirir. Bu radiog gibi diğer yöntemler,3H-5-HT alım siteleri sonuçlarda be- lirgin görselleştirme da gine domuzu ve sıçan ince bağırsak 7 daha önce gösterilmiştir.

Ussing odası çeşitli epitel doku iyonların, besin ve ilaç taşıma ölçmek için daha fizyolojik bir sistem sağlar. Ussing odası tekniğin önemli avantajı, sağlam, polarize bağırsak epiteli elektriksel ve nakil parametrelerinin hassas ölçüm mümkün kılmasıdır. Dahası, içsel nöromüsküler sistemin etkisini en aza indirmek için, bağırsak mukozasının seromusküler sıyırma epiteli 8 taşıyıcılar düzenlenmesini araştırmak için yapılabilir.

Bu jelatinimsi protein üzerinde 3D yetiştirilen Caco-2 hücreleri, farklı üst ve taban üzerindeki işaretleri ifade eden bir içi boş lümen olduğu belirlenmiştir. Bu hücreler, 2D Caco-2 hücreleri daha SERT yüksek ifadesini gösterir. Yöntemler 3D hücreleri büyümek ve perform immün veya RNA ve protein çıkarma açıklanmıştır. Buna ek olarak, bir Ussing odası tekniği kullanılarak ince bağırsak mukozasında, TGF-ß1 bir pleiotropik sitokin tarafından SERT fonksiyonu ve düzenleme çalışma yöntemleri tarif eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

jelatinli protein karışımı ile ilgili artan 3D Caco-2 hücre kültürü: Caco-2 3D kültür sisteminde bağırsak taşıyıcılar 1. Çalışma

  1. Çözülme büyüme faktörü 8 saat boyunca buz üzerinde, jelatinimsi bir protein karışımı düşük (ya da O / N), 4 ° C'de ilave edildi. Bir kez 1 mL veya daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C'de kullanıma veya deposu için 500 uL alikot yapmak çözülmüş.
  2. kültür gününde, buz üzerinde kültürü (RNA ve protein ekstraksiyonu için) plakaları ya da (immün) odacıklı slaytlar ön soğutma. Sekiz oyuklu bölmeli-cam slayt (ya da 6-plaka oyuk başına 120 uL) her bir oyuğuna, jelatinimsi protein karışımı 30 ul ekleyin ve yayılır. sürecinde hava kabarcığı oluşturmak için özen gösterin.
  3. 15, 37 ° C'de bir hücre kültür inkübatörü içinde kayar ve / tabak koyun - 30 dakika ve jelatinli protein karışımı, katılaşmaya sağlar.
  4. jelatinimsi bir protein karışımı, katılaşan iken, Caco-2 hücrelerinin konfluent balon trypsinize.
  5. sayısını sayınve hücrelerin 5 dakika boyunca masa üstü santrifüjde 500 xg'de bunları dönerler. gerektiği gibi 3D Caco-2 Orta hücre pelet yeniden askıya.
  6. (Plakalar için kuyu başına 20.000) kuyu başına 4,000 hücre cam haznesi slaytlar Tohum. Hücreler 37 ° C'de% 5 CO2 nemlendirilmiş inkübatör içinde büyümeye olanak sağlar. 4 d - orta her 3 değiştirin.

3D Caco-2 hücrelerinde Epitel Taşıyıcılar 2. İmmünofloresan Boyama: 1. Gün

  1. orta aspire ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca (NaOH ile 8.5'a ayarlanmıştır pH PBS)% 2 paraformaldehit 400 uL (PFA) ile hücrelerin tespit.
    Not: PFA Çözelti 4 ° C 'de en fazla 1 hafta saklanmamalıdır ve taze çözelti kullanılabilir. DİKKAT: PFA son derece zehirlidir ve potansiyel kanserojendir. Her zaman kimyasal kaput dikkatli ve kişisel koruyucu ekipman kullanarak başa.
  2. (1 x PBS ile iki kez kuyu durulayın ve PBS içinde 4 ° C'de slaytlar depolamak 400 uL /iyi). Bir kez, sabit bir haftaya kadar 4 ° C 'de muhafaza edin.
  3. RT'ye odası slaytlar (bu jelatinimsi protein karışımı yatak sertleşmesine ve yıkama adımları sırasında aspirasyon için kolay hale getirecek) ısıtın.
  4. Artık daha 15 dakika boyunca PBS içinde% 0.5 Triton ile hücrelerin geçirgenliği.
  5. PBS-glisin tamponu (130 mM NaCl, 7 mM Na 2 HPO 4, 3.5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glisin) hazırlayın. Oda sıcaklığında 10 dakika her biri için 1 x PBS-glisin ile 3 kez yıkayın.
  6. Immünofloresan tamponu (IF) hazırlanması: 130 mM NaCI, 7 mM Na 2 HPO 4, 3.5 mM NaH 2 PO 4, 100 mM glisin, 7.7 mM NaN3,% 0.1 BSA,% 0.2 Triton X-100 ve% 0.05 Tween-20 .
  7. IF yıkayın 3x oda sıcaklığında 10 dakika her biri için tampon. % 5 blok IF tamponu Normal Keçi Serum (NGS). IF +% 1 keçi serumu içinde seyreltilmiş birincil antikor, 200 uL inkübe / oyuk, 1 - oda sıcaklığında 2 saat. 10 dakika her biri için IF tampon 3x ile yıkayın.
  8. İkincil anti-ile inkübegövde (1: 200), oda sıcaklığında 1 saat, eğer +% 1 NGS, 200 uL / ​​oyuk içinde seyreltilmiş.
  9. 10 dakika her biri için bir IF tamponu ile üç kez yıkanır. Bu aşamada karanlıkta slaytlar tutun. onun kenar temas kuyuların kenarına kadar tutucu sayesinde beyaz bir kaldırıcı bir siyah tutucu bölme slayt yerleştirerek ve sürgülü cam slaytlar plastik odaları kaldırın. Yavaşça odaları (tutucu ve kaldırıcı kültür slaytlar ile gelmelidir) yukarı çekin.
  10. Yavaş, anti-solma ortamı ile monte ve oda sıcaklığında 10 dakika boyunca kurumaya bırakılır.
  11. Tamamen kurumuş sonra, oje ve konfokal mikroskobu ile görüntü onlara olan slaytlar mühür. iki hafta ya da daha fazla ay -20 ° C 'de 4 ° C' de slaytlar saklayın.

3D Caco-2 hücreleri, 3. RNA ve protein çıkarımı

  1. TGF-p ß1 bir test maddesi ile 14 D (10 ng / ml, 1 H), - 12 jelatinimsi protein karışımı ile kültürlenen hücrelerin tedavi edin.
  2. Tedaviden sonra, 1 hücreleri yıkayınX PBS ile yıkandı. 30 dakika jelatinli protein karışımı sıvılaştırılması için buz üzerinde hücreleri tutun.
  3. soğutulmuş PBS ile kuyu yıkayın ve bireysel santrifüj tüplerine hücreleri toplamak. 500 xg ile 10 dakika boyunca 4 ° C 'de düşük hızda santrifüjleme kullanılarak hücreler toplanır. Standart prosedürler kullanılarak RNA ekstrakte ve gerçek zamanlı RT-PCR kullanımı.
  4. Protein ekstre için, 1 x proteaz kokteyli inhibitörü ile desteklenmiş 1 x hücre parçalama tamponu kullanılarak hücrelerin lize. pelet hücre parçalama tamponu ilave edildikten sonra, sonikasyon ile hücreler lize edildi ve 7,500 x g'de 10 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüj ile hücre debrisini uzaklaştırmak.

Bir Ussing Odası kullanılması Fare ileumda 5-HT Alımına 4. Ölçümü: Bağırsak Hazırlık seromusküler Sıyırma

  1. Ötenazi ardından, fareler incelemek ve (mide sonra çekum öncesi) küçük bağırsak kaldırın. üç bölüme ince bağırsak bölün. Orta üçüncü atın proksimal üçte kullanmakjejunum olarak ve ileum olarak uzak üçte kullanın. epiteline zarar görmesini önlemek için kendi mezenterik eki bağırsak çekerek kaçının. buz gibi soğuk Krebs-Ringer bikarbonat (KBR) tampon ile kaplayıp doku bölümü soğuk tutmak.
  2. uzunlamasına makas kullanılarak bağırsak açın. KBR seromüsküler sıyırma önce 10 dakika boyunca 1 uM indometasin ihtiva eden gazla, buz gibi soğuk taze kesilmiş bağırsak bölümlerinde inkübe edin.
  3. % 7 agaroz veya tedavi silikon elastomer (0.5 cm kalınlığında) içeren bir plaka aşağı bağırsak bölümü (uzunluğu ~ 1 cm) mukozal tarafı sabitleyin.
  4. alt aydınlatma ile bir diseksiyon stereomikroskop altında seromusküler katmanları soyun. Bir tüy neşter bıçak kullanarak seromusküler katman kesti. bağırsak uzunlamasına ekseni boyunca tabakanın kenar elde etmek için ince forseps kullanın.
    NOT: sıyırma işlemi sırasında, stereomicroscope alt aydınlatma Peyer yama ile alanları belirlemek ve önlemek için yardımcı olures.
  5. seromüsküler sıyırma tamamlanmasından sonra, Ussing yarı bölmenin pimlerin üzerine dikkatli bir şekilde mukozayı monte edin. Tüm süreç boyunca, yırtılmasını önlemek için kenarlarından elimden mukozal doku tutmaya özen gösterin.

5. Dengeleme ve Doku Tedavisi

  1. Krebs çözeltisi hazırlayın: 115 mM NaCI, 25 mM NaHCO 3, 2,4 mM K 2 HPO 4, 1.2 mM CaCl2, 1.2 mM MgCl2, ve% 95 O 2/5 ile% gazlı pH 7.4'te 0.4 mM KH 2 PO 4, 37 ° C'de CO2. ozmotik dengesini korumak için mukozal banyosuna bir enerji substrat ve 10 mM mannitol olarak hizmet serozal banyosuna 10 mM glukoz ekleyin.
    Not: Krebs solüsyonu, hücre içi, 5-HT bozulmasını önlemek için, L-askorbik asit (100 uM) ve pargilin (100 uM, monoamin oksidaz inhibitörü) ile takviye edilmektedir.
  2. apikal (lümen) si, hem maruz odasına kaydırıcıyı yerleştirinde ve Krebs solüsyonu doku bazolateral (serozal) yan.
  3. 10 dakikalık bir dengeleme döneminden sonra, J ms (mukozal-To-serozal akışı) apikal tarafında, 30 dakika için fluoksetin (10 uM) ile ön işleme tabi ileal doku.
  4. Bazolateral tarafında, 1 saat boyunca, TGF-ß1 (10 ng / ml) ile doku tedavi ve apikal taraftan 30 dakika boyunca 3 [H] -5-HT (20 nM) ile inkübe edin.

Serozal Flux (J ms) ve 3 [H] Doku -5-HT Birikim mukozal 6. sayısallaştırılması

  1. Bir sıvı sintilasyon sayacında radyoaktivite ölçmek ve mukozal-to-serozal (J MS) akış oranı hesaplamak için (toplam 5 mL) serozal haznesinden 0.75 mL alikotları toplamak; Fluoksetin duyarlı akı 3 [H] -5-HT alımını SERT aracılı temsil eder.
  2. serozal tarafında ve yeniden numune almak, bir akı dönemde mukoza boyunca hidrostatik basınç farklılıkları önlemek içinBanyo ortamının eşit hacimleri ile koyun.
    NOT: akı hesaplama ucu numune (4.25 ml / 5 ml = 0.85) seyreltilmesi için düzeltir.
  3. 3 [H] doku biriken -5-HT ölçümü için, sürgü mukoza çıkarmak buz soğukluğunda KRB tamponu ile bir kez yıkanır, camdan yapılmış bir kültür tüpleri içine yerleştirin.
  4. gece boyunca 37 ° C'de% 10 KOH 0.5 mL mukoza inkübe edin. bir sıvı ışıma sayacı kullanılarak (üçlü olarak) lizatlarının 150 uL alikotları radyoaktivite ölçülür.
  5. Bradford metodu kullanılarak protein konsantrasyonunu ölçmek için lizatlarının - (5 uL 3) alikotları kullanın.
    Not: Radyoaktif serotonin içeren kuluçka ortamı 10 ml, bir standart olarak kullanılır. 5-HT pmol / mg protein / dakika olarak ifade edilir doku içinde muhafaza.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

3B, Caco-2 kisti immün, Şekil 1 'de gösterilmiştir. Phalloidin aktin ile boyandı 3D kist iyi sınırlı lümen gösteren bir XY düzleminde bir temsilcisi görüntü Şekil 1A gösterilmiştir. lümen bakan tarafı apikal tarafı gösterir. Sağlam epitel fenotip bir 3D ortamda sonucunda kültüre epitel hücreleri. Aktin ve SERT eş lekeli gün 12, Farklı Caco-2 kistleri, Şekil 1B'de gösterilmiştir. Bir XY düzlemine (Şekil 1A'da ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bağırsak taşıma 10, 11, 12, 13, 14, 15 okumak için epitel mono tabakaları polarize tam olarak farklılaşmış Caco-2 hücre mono tabakaları yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bağırsak epitel hücrelerinin fizyolojik organizasyonunu taklit etmek için, 3D bir Caco-2 kültürün gelişmesinde önemli bir ilgi olmuştur. Bağırsak epite...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

RKG laboratuvarında MD/PhD öğrencisi olan Bay Christopher Manzella'ya makalemizi düzenlemeye ve düzeltmeye yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
10x PBSATCC ATCC& kayıt; HTB ve utangaç; 37&ticaret;Hücre
Konfokal Görüntüleme için10x PBSCarl Zeiss
3[H]-5-HT LabtekII152453Mikroskopi için kültür hücreleri
5-HT Gibco70013-032Tehlikeli madde değil
%95 O2-% 5 CO2 silindirKPL71-00-27Tehlikeli bir madde değil
Agar (Agar plakaları için)FischerBP151-100Akut toksisite, Ora
Agar (elektrot için)SigmaG7126-1KGTehlikeli bir madde değil
Alexa Fluor PhalloidinSigmaC3867-1VLTehlikeli bir madde değil
Sığır Serum Albümini (BSA)SigmaP6148-500GYutulduğunda veya solunduğunda zararlı
CaCl2LifeTechnologiesA12380Tehlikeli bir madde değil
Caco-2 HücreleriSigmaA8806-5GTehlikeli bir madde değil
Hücre lizis TamponuFischerBP337-100Değil tehlikeli madde
Chabered slaytlarSigmaS5886-1KGTehlikeli bir madde değil
Kollajen Tip-1 ÇözeltisiSigmaS8045-500G
ElektrotlarSigmaS-0876
EMEMGibco by Life Technologies25200-056
Fetal sığır serumu (FBS)Corning356234Hücre dışı matris olarak kullanılır
FluoksetinQiagen74104
GentamisinATCC30-2003Hücre kültürü
Ortamı GlisinHücre Sinyali, Danvers, MA
Hepes Roche11836145001
IndomethacinGibco15070-063
K2HPO4GibcoLife Technologies tarafından 15710-064
KOHGibco Life Technologiestarafından 15630-080
L-askorbik asit Gibco by Life Technologies10082147
Sıvı sintilasyon sayacı Gibco by Life Technologies70013--032
LSM710 Meta FizyolojikAletler, San Diego, CA EM-CSYS-8
Mannitol FizyolojikAletler, San Diego, CA P2304
MatrigelFizyolojik Aletler, San Diego, CA VCC MC8
MgCl2>Fizyolojik Aletler, San Diego, CA DM MC6
Çok Kanallı Gerilim / Akım KelepçesiFizyolojik Aletler, San Diego, CA ve nbsp;P2300
NaClFizyolojik Aletler, San Diego, CA P2023-100
NaClFisher Scientific, Hampton, NHBP1423
NaHCO3Sigma-Aldrich, St Louis, MOS5886
Normal Keçi Serumu (NGS, %10)Fisher Scientific, Hampton, NHS233
Paraformaldehit (PFA)Sigma-Aldrich, St Louis, MOP288
Kalem-StrpSigma-Aldrich, St Louis, MOC3881
Protein tahlil reaktifiSigma-Aldrich, St Louis, MO10420
Proteinaz İnhibitörü KokteyliMEDOX, Chicago, IL stil G-12300
RNA kolay Mini kitSigma-Aldrich, St Louis, MOM4125
Tek Kanallı Elektrot Giriş Modülü Sigma-Aldrich, St Louis, MOA92902
Snapwell Odaları için KaydırıcılarSigma-Aldrich, St Louis, MOH9523
Sodyum Fosfat (Na2< / sub>HPO4< / sub>)Sigma-Aldrich, St Louis, MOF132
Sodyum-Hidroksit (NaOH)Sigma-Aldrich, St Louis, MOT7039
TGF-β 1Perkin-Elmer, Waltham, MANFT1167250UC
Triton X-100Packard Instruments, Downers Grove, ILB1600
Tripsin EDTASigma-Aldrich, St Louis, MO221473
Tween-20Bio Rad Laboratuvarları, Herkül, CA5000006
Ussing Odası (yalnızca oda)Sigma-Aldrich, St Louis, MOI7378
Ussing Oda SistemleriSigma-Aldrich, St Louis, MOA1296
MicrosopeLife Technologies tarafından

Kaynaklar

  1. Simon-Assmann, P., Turck, N., Sidhoum-Jenny, M., Gradwohl, G., Kedinger, M. In vitro models of intestinal epithelial cell differentiation. Cell Biol Toxicol. 23 (4), 241-256 (2007).
  2. Shen, C., Meng, Q., Zhang, G. Design of 3D printed insert for hanging culture of Caco-2 cells. Biofabrication. 7 (1), 015003(2014).
  3. Jaffe, A. B., Kaji, N., Durgan, J., Hall, A. Cdc42 controls spindle orientation to position the apical surface during epithelial morphogenesis. J Cell Biol. 183 (4), 625-633 (2008).
  4. Martel, F., Monteiro, R., Lemos, C. Uptake of serotonin at the apical and basolateral membranes of human intestinal epithelial (Caco-2) cells occurs through the neuronal serotonin transporter (SERT). J Pharmacol Exp Ther. 306 (1), 355-362 (2003).
  5. Gill, R. K., et al. Function, expression, and characterization of the serotonin transporter in the native human intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 294 (1), G254-G262 (2008).
  6. Esmaili, A., et al. Enteropathogenic Escherichia coli infection inhibits intestinal serotonin transporter function and expression. Gastroenterology. 137 (6), 2074-2083 (2009).
  7. Wade, P. R., et al. Localization and function of a 5-HT transporter in crypt epithelia of the gastrointestinal tract. J Neurosci. 16 (7), 2352-2364 (1996).
  8. Clarke, L. L. A guide to Ussing chamber studies of mouse intestine. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 296 (6), G1151-G1166 (2009).
  9. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30 (3), 256-268 (2003).
  10. Vedeler, A., Pryme, I. F., Hesketh, J. E. Insulin induces changes in the subcellular distribution of actin and 5'-nucleotidase. Mol Cell Biochem. 108 (1), 67-74 (1991).
  11. Botvinkin, A. D., Selimov, M. A., Zgurskaia, G. N., Kulikov, L. G., Aksenova, T. A. [Detection of rabies virus antibodies in human blood serum by an immunoenzyme method]. Vopr Virusol. 31 (3), 333-334 (1986).
  12. Woods, G. L., Mills, R. D. Effect of dexamethasone on detection of herpes simplex virus in clinical specimens by conventional cell culture and rapid 24-well plate centrifugation. J Clin Microbiol. 26 (6), 1233-1235 (1988).
  13. Chase, A. O. Acyclovir for shingles. Br Med J (Clin Res Ed. 295 (6603), 926-927 (1987).
  14. Churchill, P. F., Churchill, S. A., Martin, M. V., Guengerich, F. P. Characterization of a rat liver cytochrome P-450UT-H cDNA clone and comparison of mRNA levels with catalytic activity. Mol Pharmacol. 31 (2), 152-158 (1987).
  15. Steiner, M., Tateishi, T. Distribution and transport of calcium in human platelets. Biochim Biophys Acta. 367 (2), 232-246 (1974).
  16. McClelland, M., Nelson, M., Cantor, C. R. Purification of Mbo II methylase (GAAGmA) from Moraxella bovis: site specific cleavage of DNA at nine and ten base pair sequences. Nucleic Acids Res. 13 (20), 7171-7182 (1985).
  17. Chatterjee, I. shita, K, A., Gill, R. avinder K., Alrefai, W. addah A., Dudeja, P. radeep K. 3D Cell Culture of CaCo2: A Better Model to Study the Functionality and Regulation of Intestinal Ion Transporters. Gastroenterology. 146 (5, Supplement 1), S-654(2014).
  18. Fagg, R. H., Hyslop, N. S. Isolation of a variant strain of foot-and-mouth disease virus (type O) during passage in partly immunized cattle. J Hyg (Lond). 64 (4), 397-404 (1966).
  19. Shilkina, N. P. [The aspects of the problem of systemic vasculitis open to discussion]). Ter Arkh. 61 (12), 102-106 (1989).
  20. Derichs, N., et al. Intestinal current measurement for diagnostic classification of patients with questionable cystic fibrosis: validation and reference data. Thorax. 65 (7), 594-599 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Düzeltme


Formal Correction: Erratum: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

A correction was made to the Authors section in: Methods to Study Epithelial Transport Protein Function and Expression in Native Intestine and Caco-2 Cells Grown in 3D.

One of the authors' names was corrected from:

Arivarasu N. Anabazhagan

to:

Arivarasu N. Anbazhagan

Etiketler

3B KültürUssing OdacığıSerotonin TransportuBağırsak EpiteliSERT ProteiniWestern BlotİmmünofloresansHücre Kültürü
Yöntem 3D Yetiştirilen Yerli Barsak ve Caco-2 Hücreler Epitel Ulaşım Protein Fonksiyonu ve Anlatım Eğitim için
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.