Multimer-PAGE: Biyolojik örnekler olarak yakalamak için bir yöntem ve özümleme protein kompleksleri

Summary

stabilize edici ve yeni bir iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez bağlanmış bir amin-reaktif protein çapraz bağlayıcı kullanılarak modifiye edilmemiş doku lizattan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem olup (PAGE) sistemi sunulmuştur.

Abstract

arındırıcı ve tek proteinler ve peptidler çalışmak için pek iyi gelişmiş yöntemler vardır. Bununla birlikte, en çok hücresel işlev, sıklıkla, kovalent olmayan ve kolay bir saflaştırma teknikleri ile bozulmuş olan bir bağlanma araştırılması için zor olan etkileşimli protein komplekslerinin ağlar tarafından gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, stabilize edici ve iki boyutlu poliakrilamit jel elektroforez ile modifiye edilmemiş dokusundan doğal protein kompleksleri ayırmak için bir yöntem tarif eder. Doku lisatı, protein jel içine kısa bir mesafede yer değiştirmektedir kadar sonra bir elektrik akımı uygulandığında, bir denatüre edici olmayan mavi doğal poliakrilamid jel üzerine yüklenir. Taşınan protein ihtiva eden jel şeridi daha sonra kesilmiş ve kovalent protein kompleksleri stabilize amin reaktif çapraz bağlama reaktifi ditiobis (sukinimidil propionat) ile inkübe edilir. çapraz bağlı kompleksler ihtiva eden jel şeridi daha sonra bir sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel içine dökülür, ve t,O kompleksleri tamamen ayrılır. yöntem ucuz ve öğrenmesi kolay, yani teknikleri ve en moleküler biyologlar için tanıdık malzemelere dayanır. yeterince aşırı büyük kompleksleri ayırmak için yeteneği sınırlıdır ve evrensel başarılı olmamıştır da, yöntem iyi çalışılmış komplekslerinin çeşitli yakalamak başardı ve ilgi birçok sistemde muhtemelen geçerlidir.

Introduction

Normal hücre fonksiyonlarını protein-protein ^{etkileşimleri, 1, 2} bağlıdır. Bunun bir sonucu olarak, insan hastalıkları genellikle çeşitli protein kompleksleri ³ montajı ve davranış düzensizlik tarafından işaretlenir. Böyle etkileşimleri karakterize yeteneği dolayısıyla çok önemlidir. Bu etkileşimlerin tespit Mevcut araçları genellikle etkileşim ortakları çekme-aşağı ve ardından hedef proteinler, saflaştırılmasını gerektirir. Geleneksel saflaştırma diferansiyel santrifüj, çökeltme ve / veya kromatografi ⁴ ile gerçekleştirilir. Bu yöntemler zaman alıcıdır, h....

Protocol

1. Doku Hazırlanması

1. 4x BN-PAGE numune tampon maddesi (200 mM Bis (2-hidroksietil) amino-tris (hidroksimetil) metan (Bis-Tris), 200 mM NaCI,% 40 a / h gliserol,% 0.004 Ponceau S, pH 7.2, 10 mL hazırlanması ).
   NOT: Bu stok solüsyon önceden yapılmış ve 4 ° C'de saklanabilir.
2. 1x ticari proteaz inhibitörü kokteyli içeren 750 uL dH ₂ O 4x numune tamponu 250 uL seyreltin. Girdap ve buz üzerinde soğuk.
3. Temiz bir Dounce homojenleştirici 30 vuruş 1 mL 1x buz soğukluğunda BN-PAGE numune tampon maddesi içinde, hedef doku, 20 mg homojenize edilir.
   NOT: Bu gösteri deneme için, hedef doku bütün sıçan beyni dokudur. Homoje....

Results

Bu gösteri deneyinde, multimeir-PAGE bütün sıçan beyni lizatının gerçekleştirildi. Elde edilen ayrılan proteinler poliviniliden diflouride (PVDF) membran üzerinde lekelenir ve sonra kompleksler oluşturmak üzere bilinen proteinlere karşı antikorlar ile problanmıştır. Şekil 1, iki ile protokolünün bir doğrulama gösterir. İlk olarak, çapraz bağlanmış proteinler, çapraz bağlama reaktifi ile oluşturulmaktadır gözlenen daha yüksek molekül ağırlıklı türlerin, yani bir indirgeyi.......

Discussion

Protein-protein etkileşimleri canlılar yürütmek her görev için önemlidir. Bu nedenle, bunlar yoğun inceleme ve araştırma konusudur. Multimer-PAGE yakalama ayrılması ve protein kompleksleri çok çeşitli analiz etmek için bir yeni yöntemdir. Daha önce hastalıkla bağlantılı protein α-sinüklein ¹¹ oligimerization okuyan uygulanabilirliğini ortaya koymuştur. Şekil 2'de gösterildiği gibi Bununla birlikte, pek çok protein kompleksleri için uzatılabilir. protein kompleksleri okuyan di.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kimyasallar< / güçlü >
ve epsilon; -Aminokaproik asit	Sigma	A2504
Akrilamid	Akros Organikler	164855000	Toksik.
Akrilamid / bisakrilamid 37.5: 1 (% 40 T stok çözeltisi)	BioRad	161-0148	Toksik.
Amonyum persülfat	Sigma	A3678
Santa Cruz'dan	anti tavşan IgG-HRP	Biyoteknoloji sc-2004
Bikinkoninik asit test kiti	Thermofisher	23225
Bis-tris	Sigma	B9754
Sığır serum albümini	Sigma	A9647
Bütanol	Fisher Bilimsel	A399-1
Kemilüminesans substrat kiti	ThermoFisher	24078
Coomassie mavisi G-250	Sigma-Aldrich	B0770
Digitonin	Sigma	D141	Toksik.
Dimetil sülfoksit	Fisher Scientific	D128-1
Ditiobis (süksinimidilpropiyonat)	Thermo Scientific	22585
Kuru yağsız süt	LabScientific	M0841
Gliserol	Sigma	G9012
Glisin	Fisher Scientific	BP381-5
Halt Proteaz İnhibitörü Kokteyli	Thermofisher	78430
Hidroklorik asit	Fisher Scientific	A144SI-212	Titrasyon için. Kostik.
PVDF	Fisher Scientific	A412-4	. Zehirli.
Santa Cruz Biyoteknoloji	sc-7011-R
N, N'-metilenbisakrilamid	Acros Organics	16479	Toksik'ten
NP40	Boston Biyoürünleri	P-872
Polisorbat 20 (ara-20)	Fisher Scientific	BP337-500
Poliviniliden florür transfer membranları	Thermo Scientific	88518
Ponceau S	Sigma	P3504
Potasyum klorür	Fisher Scientific	P217-3
Potasyum fosfat monobazik	Sigma	P9791
Proteaz inhibitörü kokteyli	Thermo Scientific	88265
SDS çözeltisi (%10 a/h)	BioRad	161-0416
Sodyum klorür	Fisher Scientific	BP358-212
Sodyum dodesil sülfat	Sigma	L37771
Sodyum fosfat monobazik	Fisher Scientific	BP329-1
Tricine	Sigma	T0377
Tris tabanı	Fisher Scientific	BP152-500
Tris-HCl (0,5 M tampon, pH 6,8)	BioRad	161-0799
Tris-HCl (1,5 M tampon, pH 8,8)	BioRad	161-0798
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
>Instruments
GE Imagequant LAS 4000	GE Healthcare	28-9558-10
ImageJ yazılımı	NIH
Synergy H1 mikroplaka okuyucu	BioTek
Jel Şekillendirici + Stand	Biorad
Mikrofüj 22R santrifüj	Beckman Coulter
2 mL dounce homojenizatör
Vorteks karıştırıcı	Fisher Scientific
Ultrasonik doku homojenizatör	Fisher Scientific	FB120220