Birçok biyolojik yapılar zor, modern morfometrik yöntemleri uygulamak için yapım, kolayca tanımlanabilir yerlerinden yoksundur. İşte biz boyutunu ölçmek ve varyasyonu şekillendirmek için kullanılan yarı işaretlerini belirlemek için hesaplama yöntemleri takip diseksiyon ve MikroBT'lerin tarama dahil fare baculum (penis bir kemik), çalışma yöntemleri göstermektedir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Baculum diseksiyonu, mikroBT Tarama ve Morfometrik Analizleri
Bu makalede
Özet
Özet
Modern Morfometri boyutu ve şekli varyasyonu ölçmek için güçlü bir yöntem sağlar. Bir temel gereksinimi yerlerinden tanımlayan koordinatların bir listesi; ancak bu tür koordinatlar örneklerin arasında homolog yapılar temsil etmelidir. Birçok biyolojik nesneler homoloji varsayımı karşılamak için kolayca tespit yerlerinden oluşan ederken, birçok tür yapıları yoksundur. Bir potansiyel çözüm örneklerinin arasında aynı morfolojik bölgeyi temsil bir nesne üzerinde yer yarı işaretlerini matematiksel olarak etmektir. Burada, matematiksel fare baculum (penis kemiği) yarı-işaretlerini tanımlamak için yeni geliştirilmiş bir boru hattı göstermektedir. Bizim yöntemler nesnelerin geniş bir geçerli olmalıdır.
Giriş
Morfometrik alan boyutu ve biyolojik formunun biçimine, bilimsel araştırma, 1, 2, 3, 4, 5, 6 temel bir adım ölçmek için yöntemler çeşitlilik bulunmaktadır. Geleneksel olarak, boyut ve şekil istatistiksel analizi, bir biyolojik yapısına işaretlerini belirlenmesi ve daha sonra, bir çok değişkenli çerçevesinde analiz edilebilir, doğrusal uzaklık, açı ve oranları ölçülerek başlar. Landmark tabanlı Geometrik Morfometri analizi ve görselleştirme 5 üzerinden veri toplama geometrik bilgiler koruyarak yerlerinden uzaysal konumunu koruyan bir yaklaşımdır. Genelleştirilmiş Procrust Analizi (GPA) m numuneler arasında bir uyum üretmek için konum, ölçek ve yerlerinden rotasyon farklılıkları ortadan kaldırmak için uygulanabilironların kare farklılıkları inimizes - ne kalır şekil farklılık 7'dir.
Herhangi bir morfometrik analizi önemli bir kavram benzerliği veya bir güvenilir örneklerin ya da yapılar arasında uygun biyolojik olarak anlamlı ve ayrık özellikler gösteren yerler belirleyebilir fikirdir. Örneğin, insan kafatasları morfometrik analizleri etkinleştirebilirsiniz homolog süreçleri, foraminanın, sütürler ve kanalları var. Ne yazık ki, karşılık gelen noktalara tanımlanması düz yüzeyler veya eğri 8, 9, 10, özellikle de, bir çok biyolojik yapılar arasında zordur.
Biz hesaplamalı geometri kullanarak aşağıda bu sorunu yaklaşım. genel iş akışı hepsi bu böylece nokta bulutu noktaları bir bulut olarak temsil edilebilir nesnenin üç boyutlu tarama oluşturmak ve sonra döndürmek ve dönüştürmektirpecimens ortak bir koordinat sistemi üzerinde odaklı. Sonra matematiksel nesnenin belirli bölgelerde yarı-işaretlerini tanımlar. Bu tür bölgelere yerleştirilen ayrık yarı görülecek 11 biyolojik keyfi vardır. Keyfi yerleştirilen görülecek biyolojik homolog olmayabilir çünkü not ortalamasına ve sonraki istatistiksel analizler yürütülmesi istenmeyen eserler 8, 12 üretebilir. Bu nedenle, biz bu yarı-görülecek matematiksel "slayt" için izin verir. Bu prosedür, yapılar arasında potansiyel farkı en aza indirir. Başka bir yerde açıklandığı gibi burada kullanılan kayar algoritması yoksun içindeki anatomik bölge ölçmek için uygun olan, kolayca görülecek 3, 6, 8, 10, 11, 12 karşılık gelen tespit edilmiştir. Bu yöntemler kendi li varmitations 13 fakat farklı bir boyut ve şekle sahip nesnelere uyarlanabilir olmalıdır.
Burada, bu yöntemin fare baculum 14 son çalışmada uygulanan nasıl göstermek, kazanmış ve memeli evrimi 15 sırasında birden çok bağımsız kez kesildi penis bir kemik. Diseksiyon ve belirli bir kemik hazırlanmasını baculum (Protokol 1), MikroBT'lerin görüntülerin üretimi (Protokol 2) ve tüm alt hesaplama geometri sağlayan bir biçime, bu görüntülerin dönüşüm ele (Protokoller 3 ve 4). ~ 100K xyz koordinatları bu adımlardan sonra, her numune temsil edilir. Biz o zaman etkili bir şekilde ortak yönelim içine tüm örnekler (Protokol 5) hizalamak dönüşümün bir dizi yürümek, sonra hizalanmış numunelerden yarı işaretlerini (Protokol 6) tanımlar. Protokoller 1-4 bakılmaksızın nesne analiz edilen benzer olmalıdır. Protokol 5 ve Protokol 6 SPE vardırkabinini bir baculum için tasarlanmış, ancak bu adımları ayrıntılı tarafından, araştırmacılar kendi ilgi nesnesi için uygun olacağını değişiklikler hayal edebiliyorum bizim umudumuz. Örneğin, bu yöntemlerin değişiklikler balina pelvik kemikleri ve kaburga kemikleri 16 çalışma uygulandı.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler ve personel Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi Güney Kaliforniya Enstitüsü Üniversitesi (IACUC), protokol # 11394 tarafından onaylanmıştır.
1. baculum Diseksiyon ve Hazırlık
- İlgili Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından belirlenen protokollere göre, aşırı maruz kalma karbondioksit yoluyla cinsel olgun erkek fare Euthanize.
- yatar pozisyonda hayvan Lay ve başparmak prepusyal açılması yanal ile basınç uygulayarak penis uzatmak.
- Penis uzamış sonra, mümkün olduğu kadar üstderi ile doku genişletmek.
- makasla, baculum bulunduğu peniste penil vücut proksimal kesti.
- 1.7 ml tüp disseke penis aktarın ve 200 ul musluk suyunu ekleyin. Penis tamamen sıvıya olduğundan emin olun.
- 3-5 gün için 50 ° C sıcaklıkta su içinde doku inkübe edin.
- Uygun inkübasyondan sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında forseps kullanarak, baculum çevreleyen doku kaldırmak. Yavaşça doku kalan defol ve kemik temizlemek için% 70 etanol fışkırtma.
- Açık bir kap ile, yeni bir mikrosantrifüj tüpü içine parçalara baculum yerleştirin. Açık O kap bırakın / N kemik kurumaya.
2. mikroBT Tarama
- çiçekçi köpük bir silindir oluşturmak için çiçekçi köpük tuğla içine MikroBT'lerin tarama silindirik tutucu basın.
- çiçekçi köpük silindir Özü ve 2-5 cm kalınlığında ~ dilimleri kesti.
- tarama sırasında girişimi en aza indirmek için tek bir dilimin çevresi etrafında, çiçekçi bir köpük halinde kurutuldu bacula itin. Kemiklerin kesin oryantasyon Protokolde 4 bireysel örneklerin uygun şekilde tanımlanması için izin söylediği edilmelidir.
- Yavaşça MikroBT'lerin tutucu içine gömülü kemikler dilimler yerleştirin.
- MikroBT'lerin taramaları kazanır. Fare Bacula 14 halinde , aşağıdaki ayarları altında USC Moleküler Görüntüleme Merkezi'nde uCT50 tarayıcı (Scanco Medical AG, Bruttisellen, İsviçre) kullanıldı 500 ms ve 15.5 mm voksel boyutu.
3. mikroBT İşleme: Tek .xyz Dosyaya bir .DCM Stack dönüştürme
NOT: Her MikroBT'lerin taraması .DCM destesini, ya da "DICOM", nesnesi üzerinden alınan görüntü dilimleri temsil eden dosyalar oluşturur. x, y, ve her bir pikselin z koordinatlarını ve -5.000 (siyah) dan +5,000 arasında değişen pikselin yoğunluğu, - tüm alt hesaplamalı geometri dört sütun içeren bir metin dosyası sadece olan düz .xyz dosyaları gerektirir (beyaz). 3000 üzerinde bir piksel eşik genellikle kemikleri tanımlamak için bir eşik olarak çalışır.
- Install Python (www.python.org) ve PYTHON modülleri KOMUTLARI, DICOM, PyLab, SYS ve numpy.
- Aç "01_process_dicom.py "herhangi bir metin editörü ile {Figshare}. Gerekirse Değişkenler bölümünde, değişim yolunda, piksel eşikleri ve dizin adları altında.
- "Python 01_process_dicom.py" çalıştırın. İlerleme ekrana basılacaktır. Adım 3.2 adlı her dizin içinde, yeni bir dosya adı imal edilmektedir; örneğin, PT3000 piksel eşiğini gösterir directory_name.PT3000.xyz aşama 3.2'de gösterilen.
4. mikroBT işleme: segmentlere-out Bireysel Numune Files .xyz
- Kütüphane RGL'nin ile Ar (https://www.r-project.org/) yükleyin.
- herhangi bir metin editörü ile dosya '02_segment_dicoms.r' {Figshare} açın. Değişkenler bölümünde, yukarıda Protokolde 3 oluşturulan .xyz dosyaya işaret yolu adını değiştirin.
- R içinden, (çift tırnak işaretleri olmadan) komutu "kaynak ( '02_segment_dicoms.r')" çalıştırın.
- Protokol 3'te oluşturulan .xyz dosyasının üç boyutlu görüntü sonra görünür numbe giringenel .xyz dosyasında örneklerin R. Sonra etiket ve kaydırma ve yakınlaştırma işlevleri kullanarak her örnekten noktalarını seçin.
NOT: Arka planda, ayrı .xyz dosyalar her numune için yapılacaktır. Bunlar PT3000 kullanılan piksel eşiğini gösterir, örneğin, XYZ_FILES_PT3000 için, adlı bir dizinde görünür.
"Hizalama" 5. Numune Ortak Koordinatlar Dosyaları .xyz.
- ek modül mattdean_modules.py {Figshare} yanı sıra, iki kendi başına ayakta durabilen uygulama gerektirir Python komut "03_transform.py" {Figshare} açın "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) ve "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) Bu komut dosyası tarafından kullanılan.
- Değişkenler bölümünün altında, rotate_path ve qconvex_dir mattdean_modules.py tam yol adları tespit. Buna ek olarak, bireysel .xy içeren dizinin tam yolunu belirlemek4. adımda oluşturduğunuz z dosyalar.
- soneki .TRANSFORMED.xyz ile örnek başına yeni bir dosya oluşturur çalıştırın 03_transform.py.
Dosyalar .xyz 6. "Dilimleme" Bağlantısızlar Numune Yarı işaretlerini tanımak.
- Açık ve Python komut "04_identify_landmarks.py" run {Figshare}. Değişkenler bölümünde, .TRANSFORMED.xyz dosyalarını içeren dizinin tam yol adlarını belirlemek. Bu komut yapısının boyutu ve şekli ölçmek için kullanılabilir 802 yarı işaretlerini tanımlar.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Protokolde 6 üretilen yarı yerlerinden xyz koordinatlar doğrudan herhangi bir dönüm noktası tabanlı geometrik morfometrik analizi 17 içine alınabilir. Hesaplamalı boru hattı üzerinde fare Bacula 14, yanı sıra balina pelvik ve kaburga kemikleri 16 incelemek için uygulanmıştır. Yarı yerlerinden hesaplama tanımı ile ilgili daha fazla detay araştırmacıların ilgi kendi özel nesne karşılamak için modifiye edilebilir adımla...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Yukarıdaki protokol kritik adımlar 1) Bacula diseksiyon vardır, 2) MikroBT'lerin görüntüleri toplama, 3) xyz düz bir dosyaya MikroBT'lerin çıktı dönüştürme, 4) Her numune en nokta bulutu dışarı segmentlere koordinatları, 5) Her numune dönüştürülmesi standart koordinat sistemi, ve 6) yarı yerler tanımlayan. Bu adımlar kolayca farklı nesneleri yerleştirmek için modifiye edilmiştir.
Bu yöntemler, olasılıkla çok kavisli en azından esas olarak "çubuk biçimli" ya da herhangi bir ...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.
Teşekkürler
Tim Daley ve Andrew Smith ilk günlerinde birçok yararlı hesaplama tartışmalar sağlanan; Tim Daley Hesaplamalı kaynakları Güney Kaliforniya Üniversitesi'nde Yüksek Başarımlı Hesaplama Cluster tarafından sağlanan Protokolün 5. için gerekli program rotate_translate_cylindrical yazdı. Bu çalışma NIH hibe # GM098536 (MDD) tarafından desteklenmiştir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Diseksiyon makası | VWR | 470106-338 | Çoğu boyut çalışmalıdır |
| Diseksiyon Forseps, İnce Uç, Kavisli | VWR | 82027-406 | |
| 1.7 mL mikrosantrifüj tüpü | VWR | 87003-294 | |
| Mutlak Etanol | Fisher Scientific | CAS 64-17-5 | Diseksiyonlar için% 70'e seyreltilmelidir |
| Çiçek Köpüğü | Toptan Çiçek | 6002-48-07 | |
| uCT50 tarayıcı | Scanco Medical AG, Bruttisellen, İsviçre |
Kaynaklar
- Slice, D. E. Geometrics morphometrics. Annu. Rev. Anthropol. 36, 261-281 (2007).
- Slice, D. E. Modern morphometrics in physical anthropology. 6, Springer. (2005).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , 2nd, Elsevier. (2012).
- Bookstein, F. Morphometric tools for landmark data: geometry and biology. , Cambridge University Press. (1991).
- Rohlf, F. J., Marcus, L. F. A Revolution in Morphometrics. Trends. Ecol. Evol. 8 (4), 129-132 (1993).
- Zelditch, M. L., Swiderski, D. L., Sheets, H. D., Fink, W. L. Geometric morphometrics for biologists: a primer. , Elsevier. (2004).
- Rohlf, F. J., Slice, D. E. Extensions of the Procrustes method for the optimal superimposition of landmarks. Syst. Zool. 39 (1), 40-59 (1990).
- Gunz, P., Mitteroecker, P. Semilandmarks: a method for quantifying curves and surfaces. Hystrix. 24 (1), 103-109 (2013).
- Gunz, P., Ramsier, M., Kuhrig, M., Hublin, J. J., Spoor, F. The mammalian bony labyrinth reconsidered, introducing a comprehensive geometric morphometric approach. J. Anat. 220 (6), 529-543 (2012).
- Mitteroecker, P., Gunz, P. Advances in geometric morphometrics. Evol. Biol. 36 (2), 235-247 (2009).
- Bookstein, F. J. Landmark methods for forms without landmarks: morphometrics of group differences in outline shape. Med. Im. Anal. 1 (3), 225-243 (1997).
- Gunz, P., Mitteroecker, P., Bookstein, F. Modern morphometrics in physical anthropology. Slice, D. E. , Kluwer Press. 73-98 (2005).
- Oxnard, C., O'Higgins, P. Biology Clearly Needs Morphometrics. Does Morphometrics Need Biology? Biological Theory. 4 (1), 84-97 (2009).
- Schultz, N. G., et al. The genetic basis of baculum size and shape variation in mice. G3. 6 (5), 1141-1151 (2016).
- Schultz, N. G., Lough-Stevens, M., Abreu, E., Orr, T. J., Dean, M. D. The baculum was gained and lost multiple times during mammalian evolution. Integr Comp Biol. 56 (4), 644-656 (2016).
- Dines, J. P., et al. Sexual selection targets cetacean pelvic bones. Evolution. 68 (11), 3296-3306 (2014).
- Adams, D. C., Otárola-Castillo, E. geomorph: an R package for the collection and analysis of geometric morphometric shape data. Methods Ecol. Evol. 4 (4), 393-399 (2013).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
