Yöntem makalesi

Tanımlı ve hepatosit benzeri Hücrelerinin Ölçeklenebilir Nesil insan pluripotent kök hücreleri gelen

DOI:

10.3791/55355

⸱

2 Mart 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan yöntem, pluripotent kök hücrelerinden insan hepatosit benzeri hücreler üretmek için ölçeklenebilir ve iyi üretim uygulamaları (GMP) 'ya hazır farklılaşma sistemini anlatmaktadır. Temel ve Uygulamalı İnsan karaciğer araştırma için insan hepatosit benzeri hücrelerin oluşturmak için bir düşük maliyetli ve standart bir sistem olarak hizmet vermektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) biyomedikal araştırmalar için büyük bir değere sahip. hPSCs ölçekli ve insan vücudunda bulunan tüm hücre tiplerine ayırt edilebilir. insan hepatosit benzeri hücreler (hlcs) için hPSCs farklılaşması yoğun çalışmalar olmuştur ve verimli farklılaşma protokolleri kurulmuştur. hücre-dışı matris ve büyüme faktörleri, sitokinler ve küçük moleküller de dahil olmak üzere, biyolojik uyaranlara, bileşimi mümkün primer insan hepatositleri benzer hlcs oluşturmak için yaptık. Ancak, prosedürlerin çoğunluğu hala toplu partiye varyasyon sebebiyet veren, tanımlanmamış bileşenleri kullanır. Bu teknolojinin uygulanmasında önemli bir engel olarak görev yapar. Bu sorunu çözmek için, bir serumsuz farklılaşma ile kombinasyon halinde hücre dışı matrisler gibi insan rekombinant laminins kullanılarak, hepatosit farklılaşımı için tanımlanmış bir sistem geliştirilmiştir. Yüksek verimli hepatosit şartname de birlikte, elde edildiHLC ve fenotip hem de iyileşmeler monstrated. Önemli olarak, bu sistem, araştırma ve GMP dereceli hPSC çizgileri hücre bazlı modelleme ve tedaviler umut verici gelişmeleri kullanarak büyütmek için kolaydır.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Primer insan dokusu ve türev hücre tipleri düzenli hücre bazlı tarama ve klinik hem de kullanılır. Ancak, bu hücrelere ciddi şekilde yetersiz organ bağışı ve post-izolasyonu 1 hücre fenotipleri kaybı ile sınırlıdır. hPSCs birincil dokuya gelecek vaat eden bir alternatifi temsil ve genetik olarak tanımlanmış ve yenilenebilir insan somatik hücrelerinin üretilmesini kolaylaştırır. hPSCs türetilen hepatosit benzeri hücreler (hlcs) zaten bu alanda söz göstermiştir. Hlcs ilaçlar, virüsler, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, hücre morfolojisi, hepatosit gen ekspresyonu, metabolik fonksiyonu ve hassasiyet dahil olmak üzere çeşitli yönleriyle primer insan hepatositleri, benzer. Buna ek olarak, sınırsız çoğalması vehem araştırma- ve GMP dereceli hPSCs kendini yenileme kapasitesi uygulama 9, 10 kolaylaştırır.

Araştırma on yıl içinde etkili bir hepatosit farklılaşımı prosedürleri 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, bir dizi üretti. Ancak, bu sistemlerin en hepatoselüler özellikleri sürücü tanımsız bileşenleri ve / ya da viral transdüksiyon kullanın. ölçekte teknolojinin güvenilirliğini artırmak için, sağlam bir hepatosit farklılaşmasını geliştirmek önemlidirxeno serbest gerçekten tanımlanan sistem, ve GMP uyumlu.

Laminins (LN) hücre yapışmasını, çoğalması, göç ve farklılaşma etkileyebilir önemli hücre dışı matriks proteinleri vardır. Laminins bir a, bir p ve bir γ zinciri oluşan heterotrimerik glikoproteinlerdir. Son zamanlarda, rekombinan insan laminins üretilir ve hücre biyolojisi kullanılmıştır. LN-521 ve E-kadherin bir karışımı klonal türev ve insan embriyonik kök hücreleri 22 genişlemesine izin verirken LN-511, hPSCs 21 bakım destek gösterilmiştir. LN-111, diğer taraftan, hPSCs 23 türetilmiş hepatoblast benzeri hücrelerin bakım destekler. Ancak, bizim raporu öncesinde, 521 laminins ve 111 hPSCs 10 olgun özelliklere sahip hlcs oluşturmak için kullanılan edilmemişti.

Burada, LN-521 üzerinde hPSCs kültürü için biz detay prosedürlerive onları ayırt ya LN-521 veya LN-521 ve LN-111 (LN-521 / LN-111) bir karışımı. Biz birçok biçimleri 14 hlcs son derece tekrarlanabilir ve homojen tek tabaka oluşturmak için tek hücreli tohumlama kullanarak farklılaşma protokolü optimize edilmiş. Biz tanımlanmış farklılaşma sistemi alanında önemli bir adım temsil uygulama için aktif hlcs üretimi için basit ve düşük maliyetli bir yöntem olduğuna inanıyoruz.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

NOT: Bu protokolde kullanılan tüm reaktifler için Satıcı bilgileri Tablo 1'de listelenen edilmiştir. Hücreler onlarla doğrudan temas etmek zaman tüm medya / plakaları steril ve en azından oda sıcaklığında olmalıdır.

1. Pasajlanması insan pluripotent kök hücreleri (hPSCs) Laminin 521 üzerine

Not: Aşağıda tarif edilen hücre pasajlarının prosedürü tek hücre göre ve hPSCs gelen hepatosit benzeri hücrelerin homojen popülasyon türetilmesi için idealdir. Koloni kaplama da uygulanabilir ve daha önce 24 tarif edilmiştir.

  1. Gerektiğinde laminin kaplanmış plakalar hazırlayın.
    1. 4 ° C'de yeniden birleştirici laminin 521 (LN-521), 100 ug / ml stok çözülme.
    2. Buz soğukluğunda 1x DPBS çözülmüş LN-521 seyreltilir (Ca2 + ile birlikte / Mg2 +), 5 ug / ml çözelti elde edilerek hazırlanır.
    3. 5 ug 1 ml / ml LN-521, 6 gözlü bir plakanın çözeltisi kaplamak için bir deve kaya kuyuda eşit bir şekilde yaymak için.
    4. Acil kullanım için veya gece boyunca 4 ° C buzdolabında 4 saat - 2 için bir 37 ° C /% 5 CO2 hücre kültürü inkübatöründe inkübe edin.
    5. gerektiğinde 4 ° C'de buzdolabında laminin kaplanmış plakalar saklayın. düz bir yüzey üzerinde plakaları tutmak ve buharlaşmayı ve kirlenmeyi önlemek için onları mühür.
      NOT: kaplamalı kuyular kurumaya izin vermeyin; Gerekirse (Ca 2+ / Mg 2+) ile ekstra 1x DPBS ile kontör. 2 hafta içinde tabak kullanın.
  2. 1 saat - önceden kaplanmış plakalar gerekli sayıda 0.5, 37 ° C'de plakaları kullanılmadan önce oda sıcaklığına ulaşması ya inkübe izin verin.
  3. Dikkatle kaplanmış yüzeye zarar vermeden kaplama LN-521 çözümü aspire. Not: Üzerinde hücrelerin ekim önce kaplı yüzeye zarar vermemek için kritik öneme sahiptir.
  4. Hemen 10 uM Rho-kinaz ilişkili (rock) inhibitörü Y2 ile takviye edilmiş, önceden ısıtılmış mTeSR1 ortam 1 ml7632, 6-çukurlu plaka de bir görüntüdür. Hücreleri almak için hücre kültürü inkübatör plaka bırakın.
    NOT: laminin kaplı kuyular kurumaya izin vermeyin.
  5. yaklaşık% 75 ila% 85 confluency bakımlı hPSCs gelen orta aspire. Oda sıcaklığında 1 x DPBS 1 mL (Resim Ca 2 + / Mg2 +) ile bir kez, 6 gözlü bir plakanın bir kuyudan alınan hücreler yıkanır.
  6. hücrelere 1x Accutase 0.5 ml ilave edilir ve 6, 37 ° C'de inkübe - hücreleri ayırmak 8 dakika.
    NOT: sindirim yeterince uzun olup olmadığını kontrol hafifçe plaka dokunun ve hücreleri kolayca ayırmak olup olmadığını kontrol etmek için. Evet ise, o zaman, enzimatik reaksiyonu durdurmak için zamanı; 2 dakika - değilse, extra 1 sindirimi uzatmak.
  7. hücrelere 10 uM Y27632 ile desteklenmiş taze mTeSR1 orta 2 mL eklenerek ayrışma sonlandırma. Pipet yukarı ve bir tek hücre süspansiyonu yapmak için P1000 bir uca birkaç kez kullanarak aşağı.
  8. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücreleri saymak.Leke Tripan Mavi kullanın ve dışarıda ölü hücreler 14
  9. gereken hücrelerin toplam sayısını hesaplayın. Rutin hPSC geçirilmesi için, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğu başına 4 x 10 5 x 10 5 5 hücreleri, tohum (yani, 4.21 x 10 4 cm2 başına 5.26 x 10 4). Hepatosit farklılaşması için hPSCs geçirilmesi için, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğu için 6.5 x 10 5-7,5 x 10: 5 (yani, cm2 başına 7.89 x 10 4-6,84 x 10 4) hücreler tohum.
    NOT: Her bir hücre hattı için ekim yoğunluğu karaciğer farklılaşma için burada verilen ampirik yoğunluğuna dayalı küçük optimizasyonu gerekebilir.
  10. Oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 115 x g'de steril bir 15-ml, 50-ml santrifüj tüpü ve santrifüj içine gerekli hücre süspansiyonu aktarın.
  11. yavaş yavaş süpernatant aspirat ve sonra 10 uM Rho-ilişkili kinaz (ROCK) inhibitör ile desteklenmiş taze, sıcak mTeSR1 ortamında hücre peletR Y27632, arzu edilmekte olan hücre yoğunluğuna yapmak için yeterli işleminin gerçekleştirilmesi.
    Not: KAYA inhibitörünün yüksek hücre eki ve hayatta kalma oranını arttırmak için tavsiye edilir.
  12. Hazırlanan plakalara hücreleri Tohum ve eşit hücreleri dağıtmak için yan ve geriye ve yan onları sallayın.
    NOT: hücrelerin plaka rutin hücre kültürü veya hepatosit farklılaşma deney için olup olmadığını kuyularda eşit dağıtılmış olduğundan emin olmak için önemlidir.
  13. Hücre inkübatör tabak yerleştirin ve onları takmak ve kurtarmak için izin vermek, 24 saat boyunca 37 ° C /% 5 CO 2 hücreleri korumak.
  14. Hücreleri ertesi gün inceleyin ve hücre-hücre temas kuruldu eğer ROCK inhibitörü çekilme. Rutin kültürü için mTeSR1 orta hücreleri korumak veya gerektiği gibi farklılaşma ortamına geçin.
    NOT: Hücreler belirtilen yoğunluğu ile ekilmiştir ise confluency rutin bakım veya hepatosit differentiatio için ideal olmalıdırn.

2. Rekombinant Laminins ilgili hepatosit benzeri hücreler için hPSCs Farklılaşan

  1. farklılaşma ortamı hazırlayın.
    1. İnsan Aktivin bir stok çözelti yapmak: İnsan aktivin, steril% 0.2 sığır serum albümini (BSA) / DPBS içinde 100 ug / ml stok çözelti yapmak için bir toz çözülür. az miktar yapın ve -20 ° C'de saklayın. 1 de kullanın: 1,000.
    2. fare Wnt 3a stok solüsyonu olun: steril% 0.2 BSA / DPBS 10 mcg / ml stok çözelti yapmak için fare Wnt 3a tozu çözülür. az miktar yapın ve -20 ° C'de saklayın. 1 de kullanın: 200.
    3. İnsan hepatosit büyüme faktörü (HGF) stok solüsyonu yapmak: steril% 0.2 BSA / DPBS içindeki bir 10 ug / ml stok çözelti yapmak için, insan HGF tozu çözülür. az miktar yapın ve -20 ° C'de saklayın. 1 de kullanın: 1,000.
    4. Onkostatin M (OSM) stok solüsyonu olun: steril% 0.2 BSA / DPBS 20 mcg / ml stok çözelti yapmak için Onkostatin M (OSM) toz çözülür. az miktar ve s yapmak-20 ° C sıcaklıkta tekrar yırtıldı. 1 de kullanın: 1,000.
    5. Endoderm emişli hazır ortamının 500 ml yapmak:% 2 B27 Yedek (50x eksi vitamin A) ve% 1 penisilin / streptomisin (100 U / ml ve 100 ug sırasıyla / mL, en son konsantrasyonlar); Roswell Park Memorial Institute 1640 (1640 RPMI) bazal ortamı kullanarak 500 mL kontör. NOT: 4 ° C'de stok Mağaza ve iki hafta içinde kullanın. stoktan kısım, orta ve her ortam değişimi (100 ng / ml ve 50 ng / mL nihai konsantrasyonlar) tatlı Aktivin A ve Wnt 3a ekleyin.
    6. % 80 nakavt DMEM (KO-DMEM),% 20 nakavt Serum değiştirme (KSR),% 0.5 Glutamax,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA), 0.1 mM P-merkaptoetanol: KSR / DMSO farklılaştırma ortamının 500 ml yapmak % 1 DMSO, ve% 1 penisilin / streptomisin (100 U / ml ve 100 ug / mL nihai konsantrasyonlar). vakum altında filtre. 4 ° C'de saklayın ve iki hafta içinde kullanın.
    7. % 1 Gl: HepatoZYME olgunlaştırma ortamının 500 ml yapmakutaMAX, 10 uM hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzu (HCC) ve% 1 penisilin / streptomisin (100 U / ml ve 100 ug sırasıyla / mL, en son konsantrasyonlar); HepatoZYME bazal ortamı kullanarak 500 mL kontör. NOT: 4 ° C'de stok Mağaza ve iki hafta içinde kullanın. Kısım stoktan ortamı ve her bir değiştirilen ortam içinde (10 ng / mL ve 20 ng / mL nihai konsantrasyonlar) tatlı HGF ve OSM ilave edin.
  2. LN-521 / lN-111 alt-tabaka olarak kullanılacak ise, bölüm 1'de tarif edildiği gibi LN-521, hepatosit farklılaşması için tohum hPSCs, kaplama LN-521 ve LN-111 plakaları (1: 3 oranı) 5 ug / ml nihai laminin konsantrasyonu; Gerisi tedavisi saf LN-521-kaplı plakalar aynı olmalıdır.
    Not: LN-521 / lN-111 hPSCs rutin kültürü için ideal değildir; Bu tek fark deneyleri için kullanılır.
  3. tohumlama sonra hücre confluency 24 saat kontrol edin. Hücre confluency yaklaşık% 40 ulaştığında hücresel farklılaşmayı başlatın. Rharcanan mTeSR1 orta birikimleri temizlenmelidir ve 100 ng / ml Aktivin A ve 50 ng / ml Wnt 3a ile desteklenmiş taze endoderm emişli orta ekleyin. Bu farklılaşma gün 1 arayın.
    NOT: Bu son derece hücrelerin ekim gün sonra farklılaşma başlatmak için tavsiye edilir.
  4. İnsan embriyonik kök hücreleri için 3 gün (hESC) için endoderm emişli orta her 24 saatte değiştirin. İnsan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs) gelince, kesin endoderm benzeri hücrelere hazırlamak için 2 gün daha hücreleri bu aşamada genişletmek, ancak 100 ng sadece takviye endoderm emişli orta kullanmak / ml Aktivin A bu iki gün 12 .
    NOT: Başarılı endoderm özellikleri sağlamak için, böyle bir FOXA2 ve SOX17 olarak Endodermal belirteçleri, ifadesini inceleyebilirsiniz. immünofloresan boyama göre, elde edilen hücrelerin% 80'den fazla laboratuarımızda her iki belirteçler için olumludur.
  5. (HESC için) 4. günde KSR / DMSO farklılaşma ortamı / (hiPSCs için) gün 6 geçin. orta d değiştirmeİlk 3 gün sonra bu farklılaşma aşamasında beşinci gününde ünlük.
    NOT: Hiçbir besleme Bu farklılaşma aşamasının dördüncü gününde ihtiyaç vardır. Birçok ölü hücreler varsa orta değişiklikten önce bir kez hücreleri yıkamak için katkısız KO-DMEM kullanın. Bu aşama için farklılaşma başarılı olup olmadığını kontrol etmek ya da değil, böyle bir AFP, CK19 ve HNF4A olarak karaciğer progenitör hücre belirteçleri, ifadesini test edebilirsiniz. hücrelerin yaklaşık% 90 bizim deneyime dayalı bu belirteçlerin için olumlu olacaktır.
  6. KSR / DMSO farklılaşma aşamasının 5 gün sonra, HepatoZYME olgunlaşma aşamasına geçin. KSR / DMSO orta çıkardıktan sonra düz HepatoZYME bazal ortamı ile bir kez hücreleri yıkayın. Orta 10 ng / ml HGF ve 20 ng / ml OSM ile takviye HepatoZYME olgunlaşmasını ekleyin.
  7. Hücreler, standart karakterizasyonu ya da daha fazla kullanıma hazır olduğu noktada, 10 gün, 7 - orta her 48 saatte değiştirin.
    NOT: Hepatosit işaretleyici ifade muayeneleri, metabolik, Üre ve albümin salgılama testleri, glikojen depo testleri ve İndosiyanin yeşil (ICG) alım testleri (örneğin sitokrom P450 aktivitesi gibi) fonksiyon testleri tipik karakterizasyon yöntemleri vardır.
    NOT: farklılaşma protokolünün zaman çizelgesi Şekil 5'te gösterilmiştir. Laboratuvarda, rutin türetilmiş hlcs 'hepatosit özgü işaretleyici ifade seviyelerini, albümin salgılanmasını ve sitokrom P450 (CYP) 3A ve 1A2 aktivitesini kontrol edin.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

hPSCs gelen Hepatoselüler Farklılaşma

Bir insan embriyonik kök hücre hattı, H9, ve bir insan uyarılmış pluripotent kök hücre hattı, 33D6, hepatosit farklılaşımı kullanılmıştır. Şekil 4'te bu 33D6 hücrelerinden ise, Şekil 1-3 ile sonuçlanır, H9 hücreleri vardır. laminins tohumlanmıştır tek hücreler 24 saat sonra, hücre-hücre teması kurulmuştur. Hücreler% 40 confluency etrafında ulaştıktan sonra, farklılaşma süreci (Şekil 1A ve Şekil 4A) başlatılmıştır. Laminins Açık (LN-521 ve LN-521, hem / LN-111), bu hücreler sıralı morfolojik değişiklikler ile gitti ve polarize hlcs (Şekil 1 ve Şekil 4A) doğurdu.

Hepatosit benzeri Hücre Karakterizasyonu

day 18 hlcs toplanır ve temsili hepatosit belirteçleri, HNF4A ve ALB (Şekil 2A) ifadesi açısından değerlendirildi. Gün 18 hlcs immün hücrelerin yaklaşık% 90 HNF4α (Şekil 2B) olarak ifade olduğunu göstermiştir. E-kaderin ve F-aktin ifade (Şekil 2B) ile işaretlenmiş olarak bu hücrelerin, bir çokgen görünüm laminins üzerindeki polarize ve sergiledi.

Sitokrom P450 (CYP) aktivitesi tayin edilmiştir. CYP450s hepatosit önemli bir metabolik işlevi yerine. Bu Matrigel, LN-521 ya da LN-521 / lN-111 gibi bir jelatinimsi protein karışımı ile elde edilen Gün 18 hlcs CYP3A aktivitesi için test edildi. Hlcs matrigel ziyade laminin substratların (Şekil 3) anlamlı olarak yüksek CYP3A aktivite göstermiştir. Ticari insan birincil hepatositlerin karşılaştırıldığında da önemlisi, (HU1339), bu substratlar üzerine yeniden kaplama, hlcs yaklaşık 10 kat yüksek seviyelerdeCYP3A aktivitesinin 10.

hiPSCs farklılaşma HESC edilene benzerdi. Hücreler görünüm (Şekil 4A) ardışık değişiklikler sergilemiştir. Türetilmiş hlcs önemli bir hepatosit transkripsiyon faktörünü, HNF4α (Şekil 4B) olarak ifade ve CYP3A aktivitesi ve salgılanan albümini (Şekil 4C, D) sahipti. Özellikle, 33D6 türetilen hlcs hlcs (Şekil 3) elde edilen H9 hücreleri ile karşılaştırıldığında CYP3A indirgenmiş görüntülenen, ancak yine de insan primer hepatosit 10 için karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, bu hlcs albümin salgılama primer hepatositlerinde 10 çok daha düşük olmuştur.

figure-results-1
Şekil 1: Karaciğer Farklılaşma sırasında Sıralı Morfolojik Değişiklikler. <tek hücreler% 40 confluency etrafında tohumlama 24 saat sonra ulaşıldı olarak / strong> (A) ayrım hESC numaralı seribaşı. (B) priming sonra, hücreler, onlar gün 9. (D) net bir çokgen şekil gösterdi olgunlaşma aşamasından sonra, polarize hlcs için hazır olduklarını hepatoblast benzeri aşamaya ulaştıktan sonra günde 4. (C) tipik endodermal morfoloji sergiledi günde 18 Ölçek çubuğu = 200 mikron burada gösterilen ileri karakterizasyon. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: hlcs karakterizasyonu. (A) hepatosit spesifik belirteçler Gen ifadesi, HNF4A (solda) ve ALB (sağda). ifade düzeyi gün türetilmiş 18 hlcs kullanılarak analiz edildiLN-521 ve LN-521 / LN-111 hem de hESC ve ev bakıcısı geni GAPDH normalize edilmiştir ve HESC göre ifade edilmiştir. Sonuçlar üç biyolojik çoğaltır temsil eder ve hata çubukları standart sapmayı (SD) temsil etmektedir. * P <0.05, ** p <0.01; eşleştirilmemiş t-testi. Önemli karaciğer marker, HNF4α ve polarizasyon belirteçleri E-kadherin ve F-aktin (B) protein ifadesi. LN-521 ve LN-521 / lN-111 Yukarıdaki belirteçler için boyandı ve Hoechst 33342. bir negatif kontrol ile zıt ilgili Gün 18 hlcs karşılık gelen immünoglobulin G (IgG) ile gerçekleştirildi. HNF4α-pozitif hücrelerin yüzdesi ve SD gösterilmiştir. Bu bakış dört rastgele alanları hesaplanmıştır. Çıkan 20X büyütmede alınmıştır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.


Şekil 3: hlcs metabolik fonksiyon Karakterizasyonu. Matrigel (MG), LN-521 ya da LN-521 / lN-111 kültür hücreleri CYP3A Sitokrom P450 aktivitesi test edilmiştir. Veri üç biyolojik çoğaltır temsil eder ve hata çubukları SD temsil etmektedir. ** P <0.01; tek yönlü ANOVA Tukey post-hoc testi ile. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 4: hlcs Standart Karakterizasyonu. LN-521 kültür hiPSCs hlcs ayrışmıştır edildi. Standart karakterizasyon deneyleri günde 17 hlcs yapıldı. (A) karaciğer farklılaşma sırasında hücrelerin ardışık morfolojisi; zaman noktalarında gösterilen r EPRESENT gün 1, 4, 9 hücreleri ve HNF4α ifade 17. (B) immün. Pozitif hücrelerin yüzdesi ve SD bakış dört rasgele alanlara göre gösterilmiştir. Çıkan 20X büyütmede alınmıştır. Ölçek çubuğu = 100 mikron. Günde 17 hlcs üzerinde (C) CYP3A etkinliği. Veri altı biyolojik çoğaltır temsil eder ve hata çubuğu SD temsil eder. Kültür içerisinde 24 saat boyunca türetilmiş hlcs (D) Albümin salgı. veri dört biyolojik çoğaltır temsil eder ve hata çubuğu SD temsil eder. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 5: Farklılaşma Protokolün şematik Timeline.t = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçerli iyi üretim uygulama kılavuzları gerekli uyum, insan pluripotent kök hücre araştırmaları ve translasyonel tıp, xeno ücretsiz sistemlerini geliştirmek için. herhangi bir farklılaşma sürecinin anahtarı ekstraselüler matriks (ECM) 'dir. ECM sadece hücre eki destekler, ancak aynı zamanda hücre tespiti ve fenotip 25, 26 etkileyen, anahtar sinyal faktörleri erişim sağlar.

Laminins in vivo çok fonksiyonlu hücre dışı matris proteinleri bulunmaktadır. Karaciğerde laminin salgısı kısmi hepatektominin 27 sonra karaciğer rejenerasyonu için çok önemlidir ve karaciğer progenitör hücre bakımı 28 için gereklidir. Karaciğer bakım ve rejenerasyon laminins önemi bizim hepatosit farklılaşma sisteminde piyasada mevcut rekombinant insan laminins test etmek için temeli oldu.

üstün oMatrigel göre patocyte farklılaşma LN-521 ve LN-521 / LN-111 yüzeylerde elde edildi. Türetilmiş hlcs açıkça polarize ve çanak düzenlenen ve onların jelatinimsi protein karışımı muadillerine kıyasla kendi hücresel fonksiyon önemli ölçüde geliştirilmiş oldu edildi. Bu iyileştirmeler temelinde fibroblast-, colon- kirletici baskılanması ve hücre ile ilişkili laminins ilgili genlerin yanı sıra, hücre proliferasyonu ve göçü ile ilişkili gen ekspresyonu, 10 bir azalma kaynaklanıyor.

Sonuç olarak, burada açıklanan protokol erişkin insan hepatositlerde doğada yakın olan hepatosit benzeri hücreler üretir. süreç otomasyonu, tekrarlanabilir müsait ve maliyet-etkin bir uygulama için ölçekli olabilir. Önemli olarak, partiden partiye değişkenlik önemli ölçüde bu alanda araştırmacı için geliştirilmiş bir farklılaşma sistemi ile sonuçlanan, Matrigel kullanımı teknikleri ile karşılaştırıldığında düşmüştür.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dr David C. Hay Stemnovate Limited'in bir eş-kurucusu ve yöneticisidir.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma UK Rejeneratif Tıp Platformu'ndan ödülleri (MRC MR / L022974 / 1 ve MR / K026666 / 1) ve Çin Bursu ile desteklenmiştir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
İnsan Rekombinant Laminin 521BioLaminaLN521-02
İnsan Rekombinant Laminin 111BioLaminaLN111-02
Rekombinant fare Wnt3aR& D Systems1324-WN-500/CF
Human Activin APeprotech120-14E
İnsan Hepatosit Büyüme FaktörüPeprotech100-39
İnsan Oncostatin MPeprotech300-10
Rho ile ilişkili kinaz (ROCK) inhibitörü Y27632 Sigma-AldrichY0503-1MG
Hidrokortizon 21-hemisüksinat sodyum tuzuSigma-AldrichH4881
DMSOSigma-AldrichD5879
mTeSR1 ortaKÖK HÜCRE Teknolojileri05850
RPMI 1640Yaşam Teknolojileri21875
Nakavt DMEMYaşam Teknolojileri10829
HepatoZYMEYaşam Teknolojileri17705
B27 takviyesiYaşam Teknolojileri12587-010
Nakavt Serum ReplasmanıYaşam Teknolojileri10828
GlutaMaxYaşam Teknolojileri35050
Esansiyel olmayan amino asitlerYaşam Teknolojileri11140
2-merkaptoetanolYaşam Teknolojileri31350
AccutaseMilliporeSCR005
Kalsiyum ve Magnezyum ile DPBSThermoFisher14040133

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory. J Hepatol. 62 (1 Suppl), S157-S169 (2015).
  2. Hay, D. C., et al. Highly efficient differentiation of hESCs to functional hepatic endoderm requires ActivinA and Wnt3a signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (34), 12301-12306 (2008).
  3. Hay, D. C., et al. Direct differentiation of human embryonic stem cells to hepatocyte-like cells exhibiting functional activities. Cloning Stem Cells. 9 (1), 51-62 (2007).
  4. Medine, C. N., et al. Developing high-fidelity hepatotoxicity models from pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 2 (7), 505-509 (2013).
  5. Szkolnicka, D., et al. Accurate prediction of drug-induced liver injury using stem cell-derived populations. Stem Cells Transl Med. 3 (2), 141-148 (2014).
  6. Zhou, X., et al. Modulating innate immunity improves hepatitis C virus infection and replication in stem cell-derived hepatocytes. Stem Cell Reports. 3 (1), 204-214 (2014).
  7. Rashidi, H., Alhaque, S., Szkolnicka, D., Flint, O., Hay, D. C. Fluid shear stress modulation of hepatocyte-like cell function. Arch Toxicol. 90 (7), 1757-1761 (2016).
  8. Szkolnicka, D., et al. Reducing Hepatocyte Injury and Necrosis in Response to Paracetamol Using Noncoding RNAs. Stem Cells Transl Med. 5 (6), 764-772 (2016).
  9. Wang, Y., Hay, D. C. Mass production of stem cell derived human hepatocytes for experimental medicine. Expert Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (7), 769-771 (2016).
  10. Cameron, K., et al. Recombinant Laminins Drive the Differentiation and Self-Organization of hESC-Derived Hepatocytes. Stem Cell Reports. 5 (6), 1250-1262 (2015).
  11. Cai, J., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells into functional hepatic cells. Hepatology. 45 (5), 1229-1239 (2007).
  12. Sullivan, G. J., et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 329-335 (2010).
  13. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  14. Szkolnicka, D., Farnworth, S. L., Lucendo-Villarin, B., Hay, D. C. Deriving functional hepatocytes from pluripotent stem cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 30, 1-12 (2014).
  15. Rashid, S. T., et al. Modeling inherited metabolic disorders of the liver using human induced pluripotent stem cells. J Clin Invest. 120 (9), 3127-3136 (2010).
  16. Si-Tayeb, K., et al. Highly efficient generation of human hepatocyte-like cells from induced pluripotent stem cells. Hepatology. 51 (1), 297-305 (2010).
  17. Touboul, T., et al. Generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells under chemically defined conditions that recapitulate liver development. Hepatology. 51 (5), 1754-1765 (2010).
  18. Touboul, T., et al. Stage-specific regulation of the WNT/beta-catenin pathway enhances differentiation of hESCs into hepatocytes. J Hepatol. 64 (6), 1315-1326 (2016).
  19. Mathapati, S., et al. Small-Molecule-Directed Hepatocyte-Like Cell Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells. Curr Protoc Stem Cell Biol. 38, 1-1 (2016).
  20. Takayama, K., et al. Efficient generation of functional hepatocytes from human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells by HNF4alpha transduction. Mol Ther. 20 (1), 127-137 (2012).
  21. Rodin, S., et al. Long-term self-renewal of human pluripotent stem cells on human recombinant laminin-511. Nat Biotechnol. 28 (6), 611-615 (2010).
  22. Rodin, S., et al. Clonal culturing of human embryonic stem cells on laminin-521/E-cadherin matrix in defined and xeno-free environment. Nat Commun. 5, 3195(2014).
  23. Takayama, K., et al. Long-term self-renewal of human ES/iPS-derived hepatoblast-like cells on human laminin 111-coated dishes. Stem Cell Reports. 1 (4), 322-335 (2013).
  24. Medine, C. N., Lucendo-Villarin, B., Zhou, W., West, C. C., Hay, D. C. Robust generation of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cell populations. J Vis Exp. (56), e2969(2011).
  25. Sales, V. L., et al. Transforming growth factor-beta1 modulates extracellular matrix production, proliferation, and apoptosis of endothelial progenitor cells in tissue-engineering scaffolds. Circulation. 114 (1 Suppl), I193-I199 (2006).
  26. Taylor-Weiner, H., Schwarzbauer, J. E., Engler, A. J. Defined extracellular matrix components are necessary for definitive endoderm induction. Stem Cells. 31 (10), 2084-2094 (2013).
  27. Martinez-Hernandez, A., Delgado, F. M., Amenta, P. S. The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest. 64 (2), 157-166 (1991).
  28. Lorenzini, S., et al. Characterisation of a stereotypical cellular and extracellular adult liver progenitor cell niche in rodents and diseased human liver. Gut. 59 (5), 645-654 (2010).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Rekombinant LamininTan mlanm DiferansiyasyonSerumsuz S reH cre D MatriksH cre K lt r nk bat rFonksiyonel Hepatositlerl eklenebilir retimDeneysel Tekrarlanabilirlik

İlgili makaleler