Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

Xuetao Sun; Sara S. Nunes

doi:10.3791/55373

Method Article

Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

DOI:

10.3791/55373

⸱

May 6th, 2017

Xuetao Sun¹ , Sara S. Nunes¹^,²^,³^,⁴

¹Toronto General Research Institute, University Health Network, ²Institute of Biomaterials and Biomedical Engineering, University of Toronto, ³Heart & Stroke/Richard Lewar Centre of Excellence, University of Toronto, ⁴Laboratory of Medicine and Pathobiology, University of Toronto

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kalp biowire platformu elektrik stimülasyonu ile üç boyutlu hücre ekimi birleştirerek, insan embriyonik ve uyarılmış pluripotent kök hücre türevli kardiyomiyositlerde (hPSC-CM) olgun için kullanılan bir in vitro yöntem olup. Bu el yazması kardiyak biowire platformunun ayrıntılı kurulum sunar.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

İnsan pluripotent kök hücre kökenli kardiyomyositler (hPSC-CM'ler) gelecek vaat eden hücre kaynağı olmuş ve böylece ilaç keşfi, hastalık modelleme, doku mühendisliği ve rejeneratif tıp dahil kardiyak araştırmalarındaki potansiyel uygulamaların soruşturma teşvik ettik. Ancak, mevcut protokoller tarafından üretilen hücrelerin, doğal yetişkin ventriküler kardiyomiyositlerde kıyasla olgunlaşmamış bir dizi gösterir. Birçok çabaları şimdiye dek elde sadece ılımlı olgunlaşma, hPSC-CMS olgun yapılmıştır. Bu nedenle, biowire adı verilen bir mühendislik sistemi, in vitro olarak daha olgun bir duruma hPSC CMS kurşun fiziksel ve elektriksel iki ipuçları temin ederek oluşturulmuştur. Sistem bir giderek artan bir sıklık ile elektriksel alanla uyarıma tabi hizalanmış kardiyak doku (biowire) içine monte etmek için bir bükülmez şablon dikiş boyunca jel kolajen türü hPSC CMS tohum bir mikro-platformu kullanır. stimüle kontroller ile karşılaştırıldığında,biowired kardiyomiyositlerde yapısal ve elektrofizyolojik olgunlaşma geliştirilmiş bir derecede sergileyebilir uyarmıştır. Bu tür değişiklikler stimülasyon hızına bağlıdır. Bu yazının ayrıntılı olarak biowires tasarım ve oluşturulması açıklanmıştır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücresel tedavi kardiyak onarım / yenilenme ulaşmak için en umut verici ve incelenen stratejilerden biridir. Bu kalp doku mühendisliği ve biyomalzeme ^{^1,} ² eş zamanlı verilmesi ile yardımcı olmuştur. En uygun hücre kaynakları hasarlı, hastalıklı veya yaşlı kalpleri ³ üzerindeki potansiyel yararlı etkileri için hayvan modellerinde incelenmiştir. Özellikle, önemli çabalar insan pluripotent kök hücresinin kullanmak için yapılmıştır (hPSC) kardiyomiyositlerde (hPSC-CM), kardiyak doku mühendisliği için potansiyel olarak sınırsız otolog hücre kaynağı -türetilmiş. hPSC-CM'ler çeşitli yerle....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ana Tasarım ve İmalat

NOT: araç imalatı için yumuşak litografi kullanın. Polidimetilsiloksan (PDMS), kalıplanması için bir iki tabakalı SU-8 ana olun.

Cihaz (sol, Şekil 1A), bir tasarım kullanarak ve yazılım hazırlanması tasarımı. ayrı ayrı ana her tabakası çizin. Ana ¹⁵ iki katmana tekabül eden 20.000 dpi'de iki fotoğraf maskeleri cihaz tasarımı Baskı. şeffaf gibi cihaz modeli ve koyu olarak çevredeki ayarlayın; maskeleri (diğerleri ¹⁵ tarafından tarif edildiği gibi), optik olarak litografi SU-8 üzerine cihaz desen transfer etmek için bir şablon olarak hiz....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

biowires bir ameliyat dikiş ipliği kullanımı için rasyonel bir eksen hizalamak ve kalp liflerin şekli taklit 3D yapıları oluşturmak için bir şablon olarak hizmet etmektir. Biz biowire kültür yedi gün sonra, hücreler, ameliyat dikiş ipliği (Şekil 3A) yaklaşık jel yenilenmiş göstermektedir. Dikiş ekseni boyunca monte hücreler kalp dokusunu (Şekil 3) hizalanmış oluşturulur. ön kültür 7 gün sonra, biowires 7 elektriksel alan stimülasyonu gün kardiyomiositler.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu yazının hPSC-CM'ler olgunlaşmasını geliştirmek için, mühendislik platformu, biowire kurulumunu ve uygulanmasını açıklar. Cihaz, standart mikroimalat tesislerinde yapılabilir ve biowires ortak hücre kültürü teknikleri ve bir elektrik uyarıcı ile üretilebilir.

Bildiğimiz kadarıyla, biowires benzer hiçbir rapor yöntem yoktur. Bu strateji, yüksek uyarım oranı rampa rejimi (3 Hz karşı 6Hz) tabi biowires elde edilen daha büyük bir olgunlaşma düzeyi ile kanıtlandığı gibi gelişmiş olgunlaşma .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan ederim.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Kanada Kalp ve İnme Kuruluşundan (G-14-0006265) hibe yardımı, Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitülerinden işletme hibeleri (137352 ve 143066) ve bir JP Bickell vakfı hibesi (1013821 ) SSN'ye gönderir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
L-Askorbik asit	Sigma	A-4544	hPSC-CM kültür ortamı bileşeni
AutoCAD	Autodesk, Inc		Cihaz tasarlamak için yazılım
Karbon çubuklar, & Oslash; 3 mm			Elektrik stimülatör odası bileşeni
Kollajen, tip 1, sıçan kuyruğu	BD Biosciences	354249	Kollajen jeli: 24.9 mM glikozda 2.1 mg / mL sıçan kuyruğu kollajen tip I, 23.8 mM NaHCO_{3< / sub>, 14.3 mM NaOH, 10 mM HEPES, 1x M199 ortamında% 10 büyüme faktörü azaltılmış Matrigel ile.}
Kollajenaz tip I	Sigma	C0130	PBS'de Ca^{2 + < / sup> ve Mg^{2 < / sup> ile PBS'de% 0.2 kollajenaz tip I (a) ve% 20 FBS . 0.22 & mu ile sterilize edin; m süzgeç ve 12 mL alikot yapın. -20 ° C'de saklayın.}}
Deoksiribonükleaz I (DNaz I)	EMD Millipore	260913-25MU	Suda 1 mg / mL DNaz I stok çözeltisi yapın. Steril süzün ve 0,5 mL alikotları & eksi derecede saklayın; 20 derece > C
Matkap ve matkap uçları (Ø 1 mm ve 2 mm)	Dremel		Polikarbonat çerçevelerde delikler açın
Elektrik stimülatörü	Grass	s88x
Fetal sığır serumu (FBS)	WISENT Inc.	080-450
D- (+) - Glikoz	Sigma	G5767	Kollajen jel bileşeni
L-Glutamin	Thermo Fisher Scientific	25030081
H₂O	MilliQ		18.2 MΩ &orta nokta; 25 & derece'de cm; C, ultra saf, tüm çözeltileri yapmak için
HEPES	Sigma	H4034	Kollajen jel bileşeni
Sıcak plaka	Torrey Pines	HS40
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Orta (IMDM)	Thermo Fisher Bilimsel	12440053
Maskesi hizalayıcı	EVG ve nbsp;	EVG 620
Matrigel, büyüme faktörü azaltıldı	Corning	354230	Kollajen jel bileşeni
Orta 199 (M199)	Thermo Fisher Scientific	11825015	Kollajen jel bileşeni
Monotiyogliserol (MTG)	Sigma	M-6145	hPSC-CM kültür ortamı bileşeni
Orbital çalkalayıcı	VWR	89032-088
Penisilin / Streptomisin (P / S)	Thermo Fisher Scientific	15070063
Ca ^{2 + < / sup> ve Mg < sup>2 + < / sup> içeren fosfat tamponlu salin (PBS);}	Thermo Fisher Scientific	14040133
Plakası (6 kuyulu)	Corning	353046
Plakası (6 oyuklu), düşük bağlantı	Corning	3471
Platin teller, 0,2 mm			Elektrik stimülatör odası bileşeni
Polidimetilsiloksan (PDMS)	Dow Corning	Sylgard 184
Propilen glikol monometil eter asetat (PGMEA)	Doe & Ingalls A.Ş.		Gofret Kılıfını geliştirmek için
sterilizasyonu için	soyulabilir	Dönüştürücüler	92308
Silikon gofret, 4 inç	UniversityWafer Inc.
Sodyum bikarbonat (NaHCO₃)	Sigma	S5761	Kollajen jel bileşeni
Sodyum hidroksit	Sigma	S8045	Kollajen jel bileşeni
Sprin kaplayıcı	Özel Kaplama Sistemleri	G3P-8
StemPro-34 kültür ortamı	Thermo Fisher Scientific	10639011	hPSC-CM kültür ortamı. 50 mL yapmak için 1.3 mL takviye, 500 & mu ekleyin; L 100 kez; L-Glutamin, 250 & mu; L 30 mg / mL transferrin, 500 & mu; l 5 mg / mL askorbik asit, 150 & mu; L / 26 μ l / 2 mL monotiogliserol (MTG) ve 500 μ L (% 1) penisilin / streptomisin.
Medyayı			Yıkama ortamı: FBS (1: 1)
SU-8 50	MicroChem A.Ş.		fotorezist, ana bileşen
SU-8 2050	MicroChem A.Ş.		fotorezist, ana bileşen
Transferrin	Roche	10-652-202	hPSC-CM kültür ortamı bileşeni
Tripsin / EDTA,% 0.25	Thermo Fisher Scientific	25200056	hPSC-CM kültür ortamı bileşeni
% 1 Penisilin / Streptomisin içeren	yıkama ortamı

, buhar durdur IMDM

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sun, X., Nunes, S. S. Overview of hydrogel-based strategies for application in cardiac tissue regeneration. Biomed Mater. 10 (3), 034005(2015).
Sun, X., Altalhi, W., Nunes, S. S. Vascularization strategies of engineered tissues and t....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Elektriksel Uyarı Biowires İnsan Kök Hücre kaynaklı kardiyomiyositlerde Olgunlaşma

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles