Fenotip ve Fonksiyon Analizi için algılama ve Nadir zenginleştirilmesi antijene özgü B hücreleri

Özet

Fonksiyonel ve fenotipik analizi için antijene reaktif B hücreleri tespit etmek ve ettirecek bir manyetik nano-tanecikleri kullanır basit ama etkili bir yöntem tarif edilmiştir.

Özet

Spesifik bir antijenle reaktif olan B hücreleri genellikle lenfositlerin %<0.05'i kadar bir sıklıkta ortaya çıkar. Onlarca yıldır araştırmacılar, fenotipleri ve biyolojileri üzerine yapılan çalışmalar için bu nadir hücreleri izole etmek ve zenginleştirmek için yöntemler aradılar. Yaklaşımlar, kaçınılmaz olarak, B hücrelerinin, sonunda farklılaşmış kızları tarafından salgılanacak olan antikorların özgüllüğünde temsil olan hücre yüzeyi reseptörleri sayesinde doğal antijeni tanıdığı ilkesine dayanmaktadır. Belki de soruna en belirgin yaklaşım, floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile birlikte florokrom konjuge antijenlerin kullanılmasını içerir. Bununla birlikte, bu yöntemlerin faydası, hücre frekansı ve elektronik sıralama ile elde edilebilir analiz ve izolasyon oranı ile sınırlıdır. Büyük başlangıç hücre popülasyonlarından antijen-reaktif B hücrelerinin yüksek verimli zenginleşmesi ile sonuçlanan manyetik nanopartiküller kullanarak nadir antijene özgü B hücrelerini zenginleştirmek için yeni bir yöntem tanımlanmıştır. Bu yöntem, bağışıklamadan sonra veya otoimmünite gelişimi sırasında olduğu gibi, in vivo antijen karşılaşmasından önce ve sonra antijen reaktif hücrelerin fenotipinin ve biyolojisinin daha iyi izlenmesini sağlar.

Giriş

Sınırlandırıcı sulandırma antikor salgılayan hücre ön-madde frekans analizleri, belirli bir antijene reaktif B hücreleri tipik olarak aşı statüsü ve antijen üzerinde mevcut olan epitopları boyutu / sayısına bağlı olarak, normal bir repertuar% 0.05 0.005 arasında bir sıklıkta gerçekleştirilir olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu hücrelerin düşük frekanslı zor bir yabancı antijene karşı, veya otoimmün orijinli bir hastalık sırasında aşağıdaki aşılama veya maruz kalma gibi bağışıklık tepkilerinin, gelişimi sırasında durumundaki değişiklikleri çalışma yapmıştır. Daha önce, araştırmacılar, antijen kaplı kırmızı kan hücresi sıfırlama antijen kaplı plakalar veya sütun adsorbanlar arasında değişen teknikler kullanılarak antijene reaktif B hücrelerinin izole ^{üstlenmiştir, 1, 2, 3, 4, 5, 6,} ayırma hücresi floresans ile aktive. thougBu teknikler antijene reaktif B hücreleri belirlenmesi ve izole başarılı olmuştur h sonuçlar verim, saflık ve ölçeklenebilirlik açısından değişmiştir. Son zamanlarda biz de algılamak ve manyetik nanopartiküller kullanarak nadir B lenfosit alt popülasyonlar zenginleştirmek için yeni bir yöntem geliştirdi. yöntem, geniş bir başlangıç ​​popülasyonlarından nispeten yüksek verim ve saflıkta zenginleştirme sağlar ve antijene yanıtların analizi ile uyumludur. Süspansiyon içinde bulunan hücrelerin popülasyonlardan zenginleştirerek metot, antijene kaplı levha veya gruplarından ve limit hacmi geometrisi ile ilişkili kısıtlamalar ortadan kaldırır. zenginleştirilmiş hücrelerin antijen ve bir flüoresan raportör ile birlikte devam Son olarak, çünkü, bunlar daha FACS sıralama ile saflaştırılabilir. Burada tarif edildiği gibi çeşitli autoi olan deneklerden daha önce periferal kan tetanos toksoid-reaktif B hücrelerinin çalışma ve insan deneklerin aşağıdaki aşılama yaklaşımı, hem de otoantijen-reaktif B hücreleri kullandıkTip 1 diyabetin, Graves hastalığı, ve Hashimoto hastalığı ⁷ de dahil olmak üzere mmune bozuklukları. yöntem, fare ve insan eşit derecede iyi çalışır ve çeşitli dokularda (hazırlama yazısı) antigen reaktif B hücrelerinin analizi ile uyumludur.

Temel biçiminde, periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ilk fenotipik analizi için gerekli olan hücre yüzey antijenlerine karşı antikorlar ile biyotinile edilmiş antijen ile inkübe edilir. Bu etiketleme adım yıkama ve tespit ve hücreleri biyotinlenmiş-antijeni (Şekil 1) tespiti için uzak-kırmızı-floresan boya bağlanmış streptavidin ilave edildi edilir. Daha önceki çalışmalar, benzer bir şekilde antijene spesifik B hücreleri tespit ettik ancak burada antijenler doğrudan florokrom ^{8, 9, 10, 11} konjüge. bu layık olmasına rağmenyaklaşım streptavidin ile bağlantılı olarak biyotinlenmiş antijenler kullanımı ^{antijenleri, 12, 13, 14} küçük, özellikle daha büyük bir sinyal amplifikasyon (bağlanma ve bağlayıcı hücrelerin dolayısıyla daha iyi farklılaşma) sağlar. Ek göz streptavidin yerine avidin, streptavidin deglikosile olduğundan, spesifik olmayan bağlanma azaltılması kullanılmasıdır. Ayrıca, biz nedeniyle, kuantum verimi (parlaklık) kendi foto stabilitesi ve küçük boyutu (~ 1.3 kD) için florokrom kadar kırmızı-floresan boya kullanın. Potansiyel olarak bir çok antijenik epitopları içerdikleri için protein, fikoeritrin olarak fluorochromes (~ 250 kD) ve alofikosiyanin (~ 105 kD) ¹⁵ optimal değildir. Bu uzak-kırmızı-flüoresan boya olarak, tek bir epitop oluşan küçük organik bir floresan boya kullanılması, izole edilmiş hücre popülasyonunun karmaşıklığını azaltır.

Hücreler sonra biyotinile-antigen ve uzak-kırmızı-floresan boya-streptavidin adsorbe, anti-uzak-kırmızı-floresan boya-konjuge manyetik nanopartiküller kullanılarak zenginleştirilmiştir. Tek nanopartiküller malzeme akışı sitometre ile tespit edilmez ve bu nedenle ayırma FACS ve alt deneyleri ¹⁶ ile saflaştırma öncesinde iyice uzaklaştırılması gerekmez. antijen-spesifik B hücreleri için manyetik seçim zamanı ve debi sitometresinde nadir olaylar sıralama maliyetini ortadan kaldırarak, ilgi nüfusu zenginleştirir.

Daha önce, yedi gün tetanos toksoid destekleyici aşılamadan sonra gönüllüden tetanoz toksoid özgü B hücrelerinin çoğalmasını, temsili sonuçlar göstermektedir görebilirsiniz. In vivo uyarım akut Aşağıdaki antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için bu yöntemin yeteneğini göstermek için, örnek olarak, bu özel uygulama seçtik. akış sitometrisi ile birlikte, bu yöntem, zenginleştirici ve ayırt antijene özgü saf, bellek kapasitesine sahip olan veplazmablast B hücreleri ve araştırmacı zamanla sıklığı değişiklikleri izlemenizi sağlar. Buna ek olarak, örneğin, hücreler, zenginleştirme Aşağıdaki antikor salgılayan kabiliyetini muhafaza göstermektedir bir ELISPOT deneyi, başka bir olası alt-deneyi içerir. Bu yöntemin başka bir uygulaması, bir konakçıya zenginleştirilmiş hücrelerinin adoptif transferini içerebilir. Daha önce hücreler izolasyon ve devri sonrasında antijen-spesifik T hücrelerine antijen sunan hücrelerin olarak hareket yeteneğini korumak göstermiştir (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, araya antijene özel bağışıklık tepkisinin anlaşılmasını bilgi yöntemi, bağlanmış olabilir aşağı taraftaki muhtemel bir çok deney mevcuttur. Biz genel verim, saflık, hücre özgünlüğünü belirleyen ve kat-zenginleştirme kontrolleri de dahil olmak üzere, yöntem aşağıda tarif var.

Protokol

İnsan PBMC 1. izolasyonu

1. heparinize kan toplama tüpleri kullanarak kan 30-50 ml toplayın.
   Not: kullanılan kan miktarı ilgi antijene özgü B hücreleri, kandaki özel deneysel söz ve frekansına bağlıdır. Heparin enjekte edilmiş kan hemen işleme ya da ertesi gün işlem oda sıcaklığında gece boyunca yavaşça sallandı edilebilir. işleme gecikmesi zenginleştirme verimliliği üzerinde çok az bir etkiye sahiptir ve canlılığı kaybıyla ilişkilendirilir.
2. tam kan 1 karışım: 1 steril oda sıcaklığında magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu tuzlu su (PBS) ile.
3. 50 ml'lik steril bir konik tüp, oda sıcaklığı yoğunluk gradyan çözeltisi 10 ml. 4 ° C'de karanlıkta açılan yoğunluk gradyanlı şişeleri saklamak fakat kullanmadan önce oda sıcaklığına kadar ısınmaya.
4. Mümkünse yavaş ayara pipet silahı ayarlamak ve / veya yavaş çok az, ancak tutarlı, tetik baskı uygulamakiki karıştırmak için dikkatli olmak, yoğunluk gradyanı üstünde seyreltilmiş kan 30-35 ml katman.
   NOT: sulandırılmış kan ekleyerek tutarlı bir sabit bir akış sağlamak ise 50 ml kenarına pipet ucu yerleştirilmesi konik.
5. Fren 20 ° C'de 30 dakika boyunca 400 x g'de santrifüje kapalı.
6. Aşağıdaki mononükleer hücre tabakası rahatsız etmemek için dikkatli olmak, plazma ve trombosit içeren üst katman, çıkarın.
7. Steril bir pipet kullanarak, tek çekirdekli hücre tabakası (buffy coat) toplanması ve ayrı bir steril 50 ml konik tüp içine yerleştirin.
8. 50 ml'lik bir hacme kadar hücre süspansiyonu PBS ekleyin. Fren 20 ° C 'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüjleyin.
9. Süpernatantı ve 10 ml PBS içinde tekrar süspansiyon pelet hücreleri. Hücreleri saymak ve bir hemasitometre veya otomatik hücre sayacını kullanarak canlılığı belirler.
10. Daha fazla işlem için hazır olana kadar 10 ⁷ hücre / ml ve buz üzerinde yer yeniden süspanse hücre.

Hücreler 2 boyanması

1. Her floresan tazminat / varsa, gerekli FMO kontrolü için 1-2 x 10 ⁶ hücreleri çıkarın. fren 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücrelerin geri kalanı.
2. 3-6 x 10 ⁷ hücre / ml steril filtre, soğuk FACS tampon maddesi (PBS +% 1 sığır serum albümini (BSA) +% 0.01 sodyum azid) içinde süspanse hücreleri (1.5 ml santrifüj tüpüne kaldırmak). FACS tampon soğuk olduğundan emin olun ve boyama işlemi boyunca buz üzerinde tutmak.
   1. tahlil optimize dörtte içine hücre popülasyonu (AD) bölün. zenginleştirme / boyanması özgünlüğünü belirlemek için faiz, kullanım fraksiyonları B ve C antijene özgü B hücreleri zenginleştirmek için fraksiyon A kullanın antijen-spesifik hücrelerin sıklığını ve sayısını belirlemek için, ve kullanım fraksiyon D (2.5 aşağıda 2.6 bakınız) unenriched nüfus verim hesaplama sağlamak ve kat-zenginleştirme için.
3. insan FcyR engelleme yeniden ekleBuz üzerinde fraksiyonlar MS madde Fc reseptörlerine antikorların bağlanma önler.
   NOT: Uygun koşullar için üreticinin talimatlarına uyun.
4. çapraz manyetik nano partiküller ile birleşmiş anti-uzak-kırmızı-flüoresan boya antikorları ile reaksiyona girer fluorochromes dahil için dikkatli olmak karanlıkta buz üzerinde 30 dakika boyunca kısımlar MS ilgi yüzey antijenlerini hücre florokrom-eşlenik antikor ekleyin.
   Not: Bu IR-yakını, floresan boya, Cy5 Cy5.5 ve Cy7, antikor eşlenikleri. ilave edilir herhangi bir canlılık lekeleri bir sabitleyici kullanımı ile uyumlu olması gerekmektedir. bir ELISPOT, örneğin, FACS kullanarak hücrelerin analiz, ancak antikor salgılayan sıklığını belirlemek niyetinde değilse, antikorlar ile yüzey boyama gereksizdir.
5. Testin özelliğini test etmek buz üzerinde 30 dakika için, etiketlenmemiş antijen yeterli miktarda B fraksiyonu inkübe edilmesi, böylece bir afiniteye sahip reseptörlerin çoğunun, en azından10 ^-6 M engellenir.
   Not: Genellikle, iyi bir başlangıç konsantrasyonu antijen miktarının 50-100 kat fazla (örneğin, 50-100 uM) altına 2.6 yeterli kabul edilir. etiketlenmemiş antijen Bu şekilde zenginleştirilmiş hücrelerin özgüllük teyit sağlayan aşağıda adım 2.6 ilave edilir biyotinile antijen bağlanma Bu yüksek afinite ile tüm B hücreleri bloke edilmelidir. Bu adım, önceki aşamada 2.4 ile bağlantılı olarak tamamlanabilir.
6. 30 dakika boyunca buz üzerinde fraksiyonlar A, B ve D kuluçkalanması biyotinile edilmiş antijen ekleyin.
   Not: biyotinlenmiş antijenin konsantrasyonu, yeterli algılama ve spesifik olmayan nötr hücreler hücreleri bağlanma ayrılmasını sağlamak için gerekli uygun miktarını belirlemek için titre edilmelidir. Tipik test etmek için iyi bir başlangıç ​​konsantrasyonu 1-5 uM'dir.
   Not: fraksiyonları A ve D, bu aşama, yukarıda adım 2.4 ile eş zamanlı olarak yapılabilir. B fraksiyonu için, bu adım betw aşama 2.5 (yıkamadan sonra yapılmalıdıreen aşama) gereksizdir.
7. Böyle bir streptavidin uzak-kırmızı-floresan boya ve manyetik boncuklar protokolde diğer reaktifler, B hücrelerinin bağlanmasını belirlemek amacıyla Fraksiyon C biyotinile edilmiş antijen sayın.
8. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de soğuk FACS 5 x 10 ⁷ hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml hücre süspansiyonu ile hücreler iki kez yıkanır.
9. Son yıkamadan sonra, 5 x 10 ⁷ hücre başına 1 ml% 2 formaldehid konsantre hücre süspansiyonu seyreltilmiş ve 5 dakika boyunca buz üzerinde karanlıkta bekletilir.
   NOT: Bu noktada hücrelerin tespiti biotinlenmiş antijen prosedürünün geri kalan BCR için bağlı kalmasını sağlar. canlı hücreler için - örneğin ELISPOTs veya evlat transferlerde olduğu gibi aşağı analiz için, sabitleme adımı atlayabilirsiniz.
10. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de iki kez soğuk FACS 5 x 10 ⁷ hücre başına tampon ve santrifüj 1 ml hücreleri yıkayın. 1 ml süspanse soğuk FACS 5 x 10 başına tampon7 hücreleri.
11. 1-2 ug streptavidin uzak-kırmızı flüoresan boya / ml ilave edilir ve karanlıkta 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. Her bir uygulama için streptavidin miktarını titre edilir.
12. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 1 ml soğuk FACS 5 x 10 ⁷ hücre başına tampon ve santrifüj ile hücreler iki kez yıkanır. manyetik boncuklar kullanılarak zenginleştirme uğramaz gibi D fraksiyonunun hazırlanması, bu noktada tamamlandı.
    NOT: Bu örnek, örnek frekansı ve antijene özgü B hücre sayısını belirlemek için kullanılır. Bu zenginleşme elde-zenginleştirme kat verim belirlemek ve kullanılacaktır.

3. Manyetik Nanoparçacık tabanlı Zenginleştirme

1. 40 um'lik bir filtreden soğuk ayırma tamponu (PBS +% 0.5 BSA + 2 mM EDTA) 5 x 10 ⁷ hücre başına geçmesi 1 ml numune ac hücreleri tekrar sütun tıkayabilecek herhangi bir yığınının ortadan kaldırmak için.
2. Anti-Cy5 / Anti-uzak-kırmızı-floresan boya nanopartiküller ekleyin. foEn iyi sonuçları r, nano-taneciklerinin konsantrasyonu her bir kullanım için titre edilmelidir, ama iyi bir başlangıç noktası, 5 x 10 ⁷ hücre / ml başına 50 ul süspansiyondur. 10 dakika boyunca 4 ° C'de karanlıkta döndürün.
3. 4 ° C'de 5 dakika boyunca 400 x g'de 1 ml soğuk ayırma tamponu ile iki kez yıkanır. 5 x 10 ⁷ hücre başına soğuk ayrılması 1 ml tampon içinde süspanse hücreleri.

LS veya LD sütunlar kullanma 4. Manyetik Zenginleştirme

1. Bir manyetik ayırıcı manyetik alanında üç LS veya LD sütunları yerleştirin ve sütunları ıslak ayırma tampon 3 ml ekleyin (sütun tipi en uygun olduğunu belirlemek için ürün açıklamasına bakınız). 3 ml sütununda geçer ve toplandıktan sonra çıkarmanıza izin verir.
   Not: Manyetik nanopartikül işaretli hücrelerin ayrılması ticari olarak temin edilebilir manyetik ayırma cihazların herhangi biri kullanılarak gerçekleştirilebilir, ancak laboratuar TE içinde LS sütun kullanımı ile en başarılı olmuşturverim, saflık ve zenginleştirme verimliliği rms.
2. sütununun altında, negatif seçilen hücreler için etiketlenmiş üç 15 ml konik tüpler "Fraksiyon A / (B) / (C) negatif", yerleştirin. ilgili kolonuna manyetik parçacık etiketli hücreler ekleyin ve bütün hacim geçmesine izin verir.
3. en soğuk ayırma tamponu 3 ml ilave edilir ve bu sütun içinden geçmek ve 2 ml tekrar sağlar. olumsuz seçilen hücreleri toplamak ve buz üzerinde bir kenara koyun.
4. manyetik alandan sütunu kaldırmak ve pozitif seçilen hücreler için "Fraksiyon A / (B) / (C) pozitif" etiketli 15 ml konik tüp üstüne yerleştirin.
5. sağlanan piston kullanılarak manyetik alana bağlı olan hücreleri toplamak için sütun üzerinden bu hacim dalma hemen ayırma tampon yaklaşık 6 ml üstüne sütun doldurun ve.
6. saflığını artırmak için, pozitif seçilen hücreler daha Proce tekrarlayarak, ikinci bir temiz kolonu kullanarak zenginleştirilmiş olabilirdure.
7. 4 ° C'de 10 dakika boyunca 400 x g'de negatif ve pozitif seçilen kısımlar hem Spin ve arzu edilen nihai hacim içinde askıya. Böyle FACS, ELISPOT veya evlat edinen transferi gibi aşağı analizi ile devam edin.

Sonuçlar

saflık, verim analizi ve kat zenginleştirme akış sitometri kullanılarak

kaçınılmaz olarak streptavidin uzak-kırmızı-floresan boya bağlı değil ama matris içinde sıkışıp kalırlar kirletici hücreleri içeren yukarıda tarif edildiği gibi zenginleştirilmiş popülasyonları. Bu yabancı maddeler FACS sıralama tarafından zenginleştirilmiş nüfus kaldırılabilir. zenginleştirilmiş nüfus saflığını tahmin etmek için, canlı hücreler üzerinde kapı...

Tartışma

Burada yalıtım ve insan periferal kanından antijen bağlayıcı B hücrelerinin çoğalmasını, gerçekleştirmek için yeni bir metot açıklamaktadır. yöntem, farelere ve dalak ve lenf düğümleri gibi diğer dokuların, kolaylıkla uygulanabilir ve hücre fenotipi ve fonksiyonu (hazırlama yazısı) sonrası zenginleştirme analizi ile uyumludur.

Kullanıcı, bu işlemin başarılı olmasını etkileyebilecek değişkenlerin bir dizi vakıf olmalıdır. deneyim ölü hücreler non-spesifik artan arka plana lider, manyetik bonc...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
İlgilenilen değişken değişkenin antijeni			En az 100 μ g kolayca biyotinilat yapmak için; protein kullanıyorsanız, ELISA tarafından onaylanmış proteini kullanmaya çalışın. Taşıyıcı olmalı  protein içermez.
Etiketleme için biyotin; örn.< / em> EZ link Sulfo-NHS-LC-Biotin	Thermo Scientific	21335	Biotin, çeşitli uzunluklarda ara parçalar içerenler gibi farklı formülasyonlarda mevcuttur, bu nedenle kullanılan tip araştırmacı
Streptavidin-Alexa Fluor 647	Invitrogen	S21374	tarafından belirlenmelidir
Anti-Cy5 / Anti-Alexa Fluor 647 Mikro Boncuklar	Miltenyi Biotech	130-091-395
LS Sütunları	Miltenyi Biotech	130-042-401
MACS manuel ayırıcılar	Miltenyi Biotech	değişken
Formaldehit			PBS ile% 2'ye seyreltin; Aşağı akış tahlili canlı hücreler gerektiriyorsa isteğe bağlı
Kalsiyum ve magnezyum		içermeyen PBS
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02
Heparinize toplama tüplerinde
FACS tamponu (PBS + %1 BSA + %0.01 sodyum azid)
Ayırma tamponu (PBS + %0.5 BSA + 2 mM EDTA)
50 ml konik tüpler
15 ml konik tüpler
1.5 ml Eppendorf tüpleri
, Fc Blok, canlı/ölü ayırıcı leke, gerekirse
ELISPOT malzemeleri,