Method Article

Morfolojik Değişiklikleri Karakterize Eden Bir Protokol Clostridium difficile Antibiyotik Tedavisine Yanıt Vermek

DOI:

10.3791/55383

⸱

May 25th, 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacy Practice and Translational Research, University of Houston College of Pharmacy, 2Department of Electrical and Computer Engineering, University of Houston

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antibiyotik etkinliği en yaygın olarak öldürme kinetik çalışmaları yapılarak ve koloni oluşturma birimleri (CFU'lar) ölçülerek belirlenir. Taramalı elektron mikroskobunu (SEM) bu standart yöntemlerle entegre ederek, tedavinin farmakolojik etkilerini farklı antibiyotikler arasında ayırt edebiliriz.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anaerobik bakterilere yönelik yeni ilaç geliştirme ile antibiyotik eyleminin değerlendirilmesi zor ve teknik olarak zorunludur. Olası MOA'yı anlamak için antibiyotik maruziyeti ile ilişkili morfolojik değişiklikler taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanılarak görüntülenebilir. SEM görüntülemeyi geleneksel öldürme eğrileri ile bütünleştirmek ilaç eylemi konusundaki görüşümüzü geliştirebilir ve ilaç geliştirme sürecini ilerletebilir. Bu önceliği test etmek için, eğrileri öldürün ve SEM çalışmaları, bilinen fakat farklı MOA'lı (vankomisin ve metronidazol) ilaçlarla gerçekleştirildi. C. difficile hücreleri (R20291) 48 saate kadar antibiyotik varlığında veya yokluğunda yetiştirildi. 48 saatlik aralık boyunca, antibiyotik etkinliğini belirlemek ve SEM'de görüntüleme yapmak için hücreler çoklu zaman noktalarında toplandı. Önceki raporlarla uyumlu olarak, vankomisin ve metronidazolün, koloni oluşturan birim (CFU) konseyleri ile ölçülen 24 saatlik tedaviyi takiben önemli miktarda bakterisid aktivitesi vardıting. SEM görüntüleme yöntemini kullanarak, metronidazolün, kontroller ve vankomisin ile karşılaştırıldığında hücre uzunluğu (her bir antibiyotik için hücre uzunluğunda>% 50 azalma; P <0.05) üzerine önemli etkileri olduğunu saptadık. İlaç tedavisine fenotipik tepki daha önce bu şekilde belgelenmemesine karşın, ilacın MOA'sıyla tutarlıdır ve görüntüleme ve ölçümlerin çok yönlülüğü ve güvenilirliği ile bu tekniğin diğer deneysel bileşikler için uygulanmasını göstermektedir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile , gram pozitif, spor oluşturan bir bakteridir ve ABD'de yılda yaklaşık 500.000 enfeksiyona neden olur ve en yüksek risk seviyesi olan Hastalık Kontrol ve Önleme Merkezleri (CDC) tarafından bir tehdit seviyesi acil patojen olarak değerlendirilir. Son on yılda, C. difficile'ye karşı aktivite gösteren antimikrobiyallerde önemli ilaç geliştirme görüldü . 2 , 3 İn vitro çalışmalar ilaç geliştirme sürecinin gerekli bir bileşenidir. Geleneksel olarak, in vitro duyarlılık ve zaman öldürme çalışmaları gelecek hayvan ve diğer in vivo ça....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Farklı çevre veya klinik kaynaklardan C. difficile'nin izolasyonu

  1. Çevresel izolatlar: Önceden sterilize edilmiş bir pamuk göstergesi (hafifçe 0,85% NaCl ile ıslatılmış) kullanarak herhangi bir alanın yüzeyini (zemin, kapı, kol, raf vb. ) Sürünüz. 8 Steril eldiven giydiğinizden ve svabın tamamlandıktan sonra sterilize edilmiş bir tüpe konulduğundan emin olun.
  2. Klinik izolatlar (dışkı): Bir aşılama döngüsünü kullanarak 10 ila 100 mg klinik dışkı örnekleri plakositit sikloserin-fruktoz agar (CCFA) üzerine plakaya alın ve 48 - 72 saat katı anaerobik koşullar altında inkübe edin. C. difficile st....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Clostridium difficile , spor oluşturan bir bakteridir ve bu nedenle herhangi bir fonksiyonel analizden önce vejetatif ve spor hücreleri arasındaki morfoloji farklılıklarını belirlemek esastır. Şekil 1 , büyüme eğrisinin üstel fazında ve spor hücrelerinde yakalanan vejetatif hücrelerin temsili görüntülerini göstermektedir. Resimde görüldüğü gibi vejetatif hücreler uzun, pürüzsüz, çubuk şeklinde yapılarken, sporlar kaba bir dış görünümü olan küçük oval yapılardır........

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmanın amacı, C. difficile'yi izole etmek için yüksek verimli bir yöntem oluşturmak ve antibiyotik farmakolojik etkisinin daha kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesi için bir araç olarak taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak antibiyotik duyarlılığını test etmektir. Burada özetlenen protokolleri kullanarak, hücrenin antibiyotik tedavisine fenotipik tepki görüntülemenin ilacın farmakolojik etkisine dair bilgiler sağlayabileceğini gösterdik. Toplamda, bu protokolün görüntüleme kısmı,.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

KWG, Merck & Co. ve Summit, PLC'den geçmiş ve mevcut araştırma desteği almıştır.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu deneyler Merck and Co. ve Summit, PLC'den araştırma hibeleri ile desteklenmiştir.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
pamuklu gazlı bez ve nbsp;PRM21408CNaCl
Macron7532
50 mL tüplerFalcon352098
Beyin Kalp İnfüzyonu (BHI) KriterC5141
L-sisteinAlfa AesarA10389
maya özüKriterC741
sodyum taurokolatAlfa AesarA18346
anaerobik odaCoyvinil anaerobik oda
sicloserinecfoxitin fruktoz agar (CCFA) plakalarıAnaerob sistemleriAS-213
kan agar plakalarıHardy teşhisA-10
lateks aglütinasyon reaktifiOxoidDR1107AC. diferansiyel test kiti
mikrosantrifüj tüpleriEppendorf222363204
PBSGibco10010-031
%4 paraformaldehitFisher Scientific50-259-98
mikroskop slaytlarıJ. Melvin freed marka7525M75 x 25mm
akış davlumbazLabconcoSınıf II tip A2 Biyogüvenlik Kabini
masa püskürtme makinesiDenton Vakum MasasıII
bantPlastik Çekirdek05072-ABSPI Çift Taraflı Yapışkanlı Karbon Bant
altınDenton VakumTAR001-01582.375 " Çap x .002 " Kalın Altın folyo
taramalı elektron mikroskobuFEIXL-30

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lessa, F. C., et al. Burden of Clostridium difficile infection in the United States. N Engl J Med. 372 (9), 825-834 (2015).
  2. Vickers, R. J., et al. Ridinilazole: a novel therapy for Clostridium difficile infection. Int J Antimicrob Agents.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Clostridium difficileScanning Electron MicroscopyAntibiotic TreatmentMorphological ChangesKill CurvesCell Length AnalysisCFU CountingAnaerobic CultureGold CoatingFiji Software

Related Articles