Burada, sitokin ile transdüksiyona sokulmuş bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonu yoluyla, hastadan türetilen ksenograft (PDX) farelerde eksojen sitokinin üretilmesi için bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, PDX'in kullanımını genişletir ve bir çok PDX modelinde geçici veya sürekli dış kaynaklı sitokin verme seçeneği sunar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Hastadan türeyen Xenograftlarda Exogenous Cytokine'in Sitokinle Transmurgated Stromal Hücre Hattı İle Enjeksiyon Vasıtasıyla İfade Edilmesi
Bu makalede
Özet
Özet
Hastadan türeyen ksenograft (PDX) fareler, insan hücrelerini immün yetersiz farelere naklederek üretilir. Bu modeller, normal ve malign hematopoez mekanizmalarını incelemek için önemli bir araçtır ve bir çok malignite için etkili kemoterapileri belirlemek için altın standarttır. PDX modelleri mümkündür, çünkü birçok fare sitokinleri aynı zamanda insan hücreleri üzerinde de etkindir. Bununla birlikte, insan hücrelerinde normal ve malign hematopoez incelemek için kritik olan birçoğu da dahil olmak üzere, tüm sitokinler için durum böyle değildir. İnsan sitokinleri (transjenik ve knock-in modelleri) üretmek üzere mühendislik farelerinin modelin kullanışlılığı gösterilmeden önce önemli harcamalar gerektiren teknikler. Diğer teknikler emek yoğun (rekombinant sitokin veya lentivirüs enjeksiyonu) ve bazı durumlarda yüksek düzeyde teknik uzmanlık gerektirir (DNA'nın hidrodinamik enjeksiyonu). Bu raporda, eksojen insan cy içeren PDX farelerinin üretilmesi için basit bir yöntem açıklanmaktadırTokine (TSLP, timik stromal lenfopoietin) , bu sitokini aşırı ifade etmek için transdude edilen haftalık intraperitoneal stroma enjeksiyonu yoluyla . Bu yöntemin kullanılması, fare içinde dolaşan insan sitokininin fizyolojik seviyelerine erişen in vivo bir sürekli sitokin kaynağı sağlar. İnsan sitokininin plazma seviyeleri, enjekte edilen stromal hücrelerin sayısına göre değişebilir ve sitokin üretimi, deneydeki herhangi bir noktada başlatılabilir. Bu yöntem, aynı şekilde üretilen sitokin-negatif kontrol farelerini de içerir, fakat bir kontrol vektörü ile transdüze edilen intraperitoneal stroma enjeksiyonu yoluyla. Kontrol PDX'si ile karşılaştırıldığında, TSLP'yi eksprese eden PDX'den hasat edilen lösemi hücrelerinin orijinal hasta örneğine benzeyen bir gen ekspresyonu sergilediğini daha önce göstermiştik. Bu yöntemle üretilen sitokin üreten ve sitokin negatif PDX fareleri, birlikte çalıştıklarımızı incelemek için başarılı bir şekilde kullandığımız bir model sistemi sağlar.TSLP'nin normal ve malign hematopoezdeki rolü.
Giriş
Hastadan türeyen ksenograftlar (PDX) 'yerli' bir memeli ortamında normal ve malign hematopoietik hücrelerin üretiminin incelenmesi için güçlü bir in vivo modeldir. Çoğu zaman, PDX bağışıklık yetersiz farelere insan hücrelerini enjekte ederek ya da naklederek üretilir. Normal insan hematopoietik kök hücrelerini kullanarak PDX üretilmesi, normal insan kanında ve immün hücre gelişiminde in vivo çalışmalara izin verir. Lösemi veya diğer kanser hücrelerinden üretilen PDX, insan popülasyonunda mevcut olan genetik peyzajlar ve mutasyonlar bağlamında, onkojenik mekanizmaların incelenmesini ve etkili terapileri tanımlamayı mümkün kılar. Sonuç olarak PDX, etkili terapileri tanımlamak için translasyonel biyomedikal araştırmalar için mevcut olan altın standart ve kanser ilerlemesinin mekanizmalarını anlamak için önemli bir araçtır. PDX modelleri, sağlık ayrımlarından arındırılmış hastalıkların araştırılmasına yardımcı olmak için özel bir araçtır. Genetik lezyonlar veya bir hastanın genetik görünümündeki varyasyonların onkogenezise ve tedavi sonucuna önemli ölçüde katkıda bulunduğu herhangi bir hastalık.
Fare-insan PDX modelleri mümkündür, çünkü birçok fare sitokinleri, fare içerisindeyken insan hücrelerinin sitokin reseptörlerini harekete geçirirken insan analoglarını yeterince taklit eder. Örneğin, interlökin-7 (IL-7) insan B hücresi gelişimi için kritik bir sinyal sağlar. 2 Bu durumda, fare IL-7, insan IL-7 ile yeterli homologluğa sahiptir ve fare sitokini, insan B hücresi öncüllerinde sinyal yollarını uyarır. Bununla birlikte, diğer sitokinlerin (IL-3, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), kök hücre faktörü (SCF) arasında timik stromal lenfopoietin (TSLP) 5 , 6 için geçerli değildir, ,Ref "> 7 normal ve habis insan hematopoietik hücrelerinin üretilmesi için önemlidir Fare ve insan sitokinleri düşük homologluk gösterdiğinde fare sitokinleri insan hücreleri üzerinde kendi reseptörlerini aktive etmez Bu engeli aşmak için birtakım stratejiler kullanılmıştır PDX farelerinde insan sitokinlerinin ekspresyonunu mühendislere yapıştırmak için rekombinant insan sitokinlerinin enjeksiyonu, DNA'nın hidrodinamik enjeksiyonu, lentiviral ekspresyon, transjenik ekspresyon ve knockin geni değiştirme 7 Bu rapor, PDX'nin stromal aracılı yollarla insan sitokini üretmesi için bir metodu açıklamaktadır Sitokin verimi ( Şekil 1 ).
Burada gösterilen yöntemde, PDX fareleri, insan sitokini, TSLP'yi veya sitokin negatif kontroller olarak görev yapacak şekilde tasarlanmıştır. TSLP'yi ifade eden PDX, yüksek düzeylerde insan TSLP'sini ifade etmek üzere transduced edilen stromal hücrelerin haftalık intraperitoneal enjeksiyonları ile elde edilir.Sitokin-negatif PDX "kontrol" fareleri benzer şekilde tasarlanmıştır; Ancak kontrol stroması bir kontrol vektörüyle dönüştürülür. Bu yöntem, TSLP + stroma enjekte edilen PDX farelerinde insan TSLP'sinin normal fizyolojik seviyelerine ulaşmaktadır. Sitokin negatif stroma alan PDX farelerinde saptanabilir TSLP gözlenmemiştir. Çalışmalarımız için insan stromal hücre hattı HS-27A'yı seçtik çünkü kültürde sağlam bir şekilde büyür ve kokültürlerde izole progenitör hücrelerin çoğalmasını desteklemeyen çok düşük sitokin üretimi gösterir. 8 İnsan TSLP ekspresyonu için, stroma, daha önce tarif edilen omurgadan türetilmiş ileri nesil kendinden inaktif bir lentiviral vektör ile transduced edildi ve transgen ekspresyonunu arttırmak için cPPT / cts elemanı ve post-transkripsiyonel düzenleyici unsuru (WPRE) ağaç talebi hepatitini içerdi. İnsan TSLP geni, bu vektöre, uzatma faktörü -1(EF-1) alfa hızlandırıcıyı sağlam, kurucu ve uzun vadeli ifadeye erişir.
Bu insan sitokini ile güçlendirilmiş PDX modelinin mühendisliği 4 ana aşamadan oluşur. Önce transduced stroma, in vitro genişletilir ve kararlı, yüksek seviyeli sitokin üretimi için enzim bağlantılı immunosorbent assay (ELISA) ile değerlendirilir. İkincisi, dönüştürülen stromal hücreler tarafından üretilen insan sitokininin (ve kontrol stromasından sitokin aktivitesinin eksikliği) etkinliği, fosfo-akış sitometrisi kullanılarak doğrulanır. İlgi konusu sitokine duyarlı olduğu bilinen hücre hatları (bu örnekte TSLP), stromal hücre süpernatanı ile inkübe edilir ve sitokine bağlı fosforilasyon için denenir. Üçüncü olarak, farelere dönüştürülen insan stroması enjekte edilir ve daha sonra fare plazması, haftalık bazda insan sitokin seviyeleri için ELISA ile değerlendirilir. Dördüncü olarak insan hematopoietik hücreleri nakledilir ve insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkileri bilinen bir hedef üzerinde değerlendirilir (
Şekil 1: Farelerde Eksojen İnsan Sitokini Üretmek üzere Üretilen PDX Modeli. ( 1A ) Tasarım deneyi ve transduced insan stromal hücreleri ( 1B ) elde PDX (hasta türevli ksenograft) fareler üretmek için insan hücreleri (hematopoietik kök hücreler, lösemi hücreleri, vb .) Edinin. ( 2A ) Deneysel çizelgeye göre immün yetersiz farelere insan hücrelerini mühendislik stromasını enjekte edin ve ( 2B ) nakledin. ( 3A-B ) ELISA ile stroma süpernatanı ve fare plazmasında sitokin konsantrasyonlarını izleyin. ( 4 ) İnsan hücrelerini toplayın ve PDX'de bulunan insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkilerini değerlendirin. Lütfen buraya tıklayınızBu rakamın daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için.
Stromal hücreler yoluyla insan sitokinin verilmesi, PDX farelerinde insan sitokinleri verme / üretme yöntemlerine kıyasla avantaj ve dezavantajlar sunar. 7 Rekombinant insan sitokinin enjeksiyonu ile karşılaştırıldığında, stroma aracılı doğum genellikle daha ucuzdur (stromal hücre kültürü maliyeti rekombinant sitokin maliyetinden daha düşüktür) ve emek yoğunluğu daha düşüktür (haftada bir kez enjeksiyona karşı haftada birden fazla enjeksiyon). Kısa sitokin yarı ömrü sorunu da hafifletilir çünkü stroma sürekli olarak eksojen sitokin üretir. DNA'nın hidrodinamik enjeksiyonu yoluyla sitokin verilmesi, stroma yoluyla verilmeden daha ucuz olabilir. Bununla birlikte, benzer şekilde geçicidir ve stroma bağlı teslimat için gerekli basit haftalık intraperitoneal enjeksiyona göre daha fazla teknik beceri gerektirebilir. Fare içerisinde Lentiviral gen ekspresyonu daha az travma sağlayabilirSitokin verme yöntemleri; Ancak, elimizde fizyolojik TSLP seviyelerine ulaşılamadı. Ayrıca, bu yöntem emek gerektirir ve sürekli lentiviral vektör üretilmesini gerektirir. Transgenik veya knock-in fareler, sitokinin stabil uzun süreli ekspresyonunu sunar ve bir avantaj sağlayabilecek doku spesifik ekspresyonu için tasarlanabilir. Öte yandan, PDX fareleri için gerekli olan immün yetersiz fare arka planı üzerindeki insan sitokin geninin transgenik ifadesi, modelin değeri belirlenmeden önce büyük bir kaynak yatırımı yapılmasını gerektirir. Dahası, transgenik modeller genellikle sitokin başlatma zamanlamasını veya in vivo sitokin üretim seviyesini değiştirme seçeneği sunmamaktadır. Bunlar, stromal hücre enjeksiyonunun başlatılması için zaman noktasını veya enjekte edilen stromal hücrelerin dozunu değiştirerek stroma bağlı teslimat ile başarılabilir.
Stromal-hücre aracılı sitokin verilme metoduBurada detaylı açıklanan normal insan B hücre gelişimi 4 , 6 ve yüksek riskli B hücreli akut lenfoblastik lösemi TSLP rolünü değerlendirmek için PDX geliştirmek için kullanılmıştır. Bu yöntem, TSLP dışındaki insan sitokinleri ile benzer modellerin üretilmesinde kullanılmak üzere alternatif bir sitokin verme yöntemi sağlar. Bu model, bir sitokin transjenik veya sitokine giren PDX modelinin değerinin önemli miktarda zaman ve para yatırımı yapmaya değip değmeyeceğini belirlemenize yardımcı olabilecek ön verileri üretmek için de yararlı olabilir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Çalışmalar Loma Linda Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) ve Kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) tarafından onaylanan protokollere ve tüm federal kurallara uygun olarak yürütülmüştür.
DİKKAT: PDX ve insan dokuları, kan yoluyla bulaşan patojenlerin bulaşmasını önlemek için güvenlik prosedürlerine uygun olarak ele alınmalıdır.
1. Sitokinle Transmurgasyon Yapılan Stromal Hücrelerin Kültürü ve Genişletilmesi
NOT: Her seferinde pasaj alınır, kültür süpernatantını (1 mL alikot) hasat edin ve gelecekte ELISA tahliliyle sitokin seviyesinin nicelleştirilmesi için -80 ° C'de saklayın.
- R10 kültür ortamını ve donma ortamını Malzemelerin Tablosunda açıklandığı gibi hazırlayın.
- 10 , 11 üreterek veya kontrol stromasını (boş vektör ile transduced) ve sitokin üreten (TSLP +) stromayı elde edin.Kullanıma kadar sıvı azot (LN 2 ) içerisinde saklayın.Dokromatik hücrelerin çözünmesini tarif edin 12 ve ayrı T-25 hücre kültürü şişelerinde 5 mL R10 ortamında plaklayın 37 ° C'de inkübe edicide% 5 CO 2. Bu, post-thaw "pasaj # 1" dir.
- Bir kez stroma birleşince (24-48 saat), hücreleri, 1x tripsin EDTA (% 0.25) kullanarak tripsinlemeye tabi tutun ve bir T-150 kültür şişesi içinde yeniden kaplama yapın. Bu, post-thaw "pasaj # 2" dir.
- Stroma T-150 şişelerde (3-4 gün sonra) konfluance ulaşıldığında, trypken ile hücreleri geçirin. Deneysel ihtiyaçlar için bu hücre süspansiyonunu kullanın.
- Birden fazla şişeye hücre genişletilmesi
- Hasat edilen hücreleri, üç T-150 şişesi ve kültürü arasında birleşinceye kadar bölün. Stroma genişlemesi gerekiyorsa bu adımı tekrarlayın. Bir T-150 şişesindeki konfluansa ait tipik insan stromal (HS-27A) hücre sayısı ~ 5x106'dır.
- Hücre sUZUN SÜRELİ MUHAFAZA
- Toplanan hücre süspansiyonunu konik bir tüp içine aktarın ve 500 xg'de 5 dakika boyunca santrifüj edin, süpernatanı boşaltın ve dondurucu ortamda hücreleri tekrar süspanse edin. Donma ve şişe başına LN 2 ~ 1.5 x 10 6 hücre saklayın.
- Farelere intra-periotoneal stroma enjeksiyonu için adım 4.1'e geçin.
- Birden fazla şişeye hücre genişletilmesi
2. Transdüksiyonlu Stromadan İn Vitro Sitokin Üretimini İzlemek İçin ELISA Testleri
- İlgilenen sitokini algılamak için piyasada bulunan ELISA test kiti satın alın.
- Erken, orta ve geç pasajlarda hasat edilen kontrol ve sitokin üreten (TSLP +) stromadan stromal hücre süpernatantını çözünürler ( Şekil 2 ).
- Üreticinin talimatlarına göre bir ELISA kiti kullanarak süpernatan numunelerindeki TSLP konsantrasyonunu belirleyin. 13 Hücre kültürü sırasında sitokin üretiminin stabilitesini izlemek için bu seri veriyi derleyin E ( Şekil 2A-B ).
- İndirgenmiş veya optimal olmayan sitokin ekspresyonu ile sitokin üreten stromayı tanımlayın ve depolamada karşılık gelen tüm şişelerle atın ( Şekil 2A-B ).
- Stabil, yüksek seviyeli sitokin konsantrasyonlarını gösteren sitokin üreten stromayı tanımlayın ve muhafaza edin. Denemelerde bu çözülmeleri kullanın.
- Sitokin üretiminin stabil olmasını sağlamak için ya da kontrol stroması durumunda sitokin üretiminin olmamasını sağlamak için hücre kültürü boyunca stromayı rutin olarak izlemek için ELISA kitini kullanın (en az bir kez erken, orta ve geç post-thaw pasajları boyunca) .
3. Stroma ile Üretilen Sitokinin Aktivitesini Değerlendirmek İçin Fosfo-Akış Sitometri Tahlilleri
NOT: Tek deney için stroma ile oluşturulan sitokinin ilgili biyo-aktivitesini doğrulamak için ilk deneyden önce tasarlanmış stromadan süpernatanı değerlendirin.Ef "> 6 İşlenmiş stroma onaylandıktan sonra, yeni bir vektör ile üretilen stroma girilmedikçe ileri tetkikler gerekmez.
- MUTZ5 ve / veya MHH-CALL4 lösemi hücre çizgileri (TSLP yanıt veren), 14 rekombinant insan sitokini ve uygun fıstıflı fosforilasyon hedeflerini tespit etmek için fosfo-akış sitometri deneylerinde kullanım için onaylanmış antikorları satın alın.
- Kontrol ve sitokin ifade eden stromadan hasat edilmiş süpernatanı çözün.
- Lösemi hücre çizgilerini 96 oyuklu bir doku kültürü plakasında kuyucuk başına 0,2 x 106 hücre hasıl eden konsantrasyonda R20 ortamında (bkz . Malzeme Tablosu ) plaklayın. Üçlü deneyler için izin vermek için koşul başına plaka 3 oyuk. 37 ° C'de 2 saat inkübe edin. Bu zaman, önceki kültür koşulları sırasında oluşan herhangi bir fosforilasyon kaybına izin verir.
Not: hücre hattı başına 12 kuyucuk adım 3.4'te gösterilen her deneysel durum için üçlü testler sağlar. - Kültürde 2 saat sonra, hücreleri her bir kuyudan 4 mL'lik ayrı tüplere aktarın ve 5 dakika boyunca 500 xg'de 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı boşaltın.
- Aşağıdaki deneysel koşulların her biri için 200 uL'de hücreleri yeniden askıya alın (doymuş konsantrasyonda rekombinant sitokin ile 1) negatif kontrol-ortamı, 2) pozitif kontrol-ortamı (TSLP 15 ng'de / ML, vb .), 3) kontrol stromasından kontrol stroma süpernatantı ve 4) sitokin üreten stromadan sitokin-stroma süpernatantı.
- Hücreleri, spesifik ticari fosfo-tahliliyle belirtilen süre boyunca inkübe edin ( örn. , TSLP'ye yanıt olarak MUTZ5 veya MHH-CALL4'deki fosfo-STAT5 için 30 dakika).
- 4 dakika ° C'de 5 dakika süreyle 500 xg'de santrifüjleyin ve süpernatanı boşaltın.
- Üreticinin protokolüne göre fosfo-akış sitometrisi lekesi uygulayın ve akış sitometrisi verileri toplayın. 15
- Akış sitometrisi verisini analiz edin. 15
- Sağlam hücreler üzerinde ileriye dayanan kapı (FSC, hücre boyutunu gösterir) ve yan (SSC, hücre parçacıklığını gösterir) ışık dağılımı.
- Her numunedeki bozulmamış hücrelerin medyan floresan yoğunluğunu (MFI) belirleyin. Stromal hücre süpernatantının üçlü değerlerinden elde edilen ortalama MFI'yi, pozitif ve negatif medya kontrollerine kıyasla karşılaştırın.
4. Sitokine Dönüştürülmüş Stromun Fare içine Enjekte Edilmesi
NOT: HS-27A stromasını, sağlıklı hücreleri ve yeterli sitokin üretimini sağlamak için farelere enjekte etmeden önce en az 3 çözülme sonrası pasaj kültürleyin.
- Stroma hazırlanması
- Hasat edilmiş stromal hücre süspansiyonunu konik bir tüpe aktarın ve hemositometre sayımı için 10 uL'lik kısım; Trypan mavisi kullanarak canlı hücre sayısını elde edin. 16 Kalan hücreleri santrifüjleyin5 dakika için 500 xg'de süspansiyon alın.
- Peletlenmiş hücrelerden süpernatantı aspire edin ve fare enjeksiyonu için (fare sayısına bağlı olarak) enjekte edilecek farelerin steril fosfat tamponlu salin (PBS) hacmine yavaşça tekrar süspanse edin.
Not Fare enjeksiyonu için tipik stromal hücre konsantrasyonu: 200 uL PBS içinde fare başına 0.5 x 10 6 -5 x 106 hücre. - Enjeksiyondan hemen önceye kadar stromal hücre süspansiyonunu 4 ° C'de (veya buz üzerinde) tutun. Farelerin enjeksiyonu için hücre süspansiyonunun oda sıcaklığında (~ 25 ° C) en az olduğundan emin olun.
- Stromal hücre enjeksiyonu
- Biyogüvenliğin başlığını dezenfekte edin, enjeksiyon materyalleri toplayın ve sonra içine farenin kafesini yerleştirin.
- Tüberkülin şırınga içine 200 mcL çizmeden önce yavaşça inversiyon ile hücre süspansiyonu karıştırın.
- Standart intra-peritoneal enjeksiyon tekniklerini kullanarak, 17Fare tutun ve 200 μL hücre süspansiyonu peritoneal boşluğa uygulayın. Ayrıntılar Machholz ve ark. Tarafından daha önce gösterilmiştir . 18
5. Farelerde Eksojen İnsan Sitokini İçin Seri Kan Toplama ve Plazma İzleme
- Kuyruk kesimi yoluyla kan alınması
- Biyogüvenlik başlığını dezenfekte edin ve prosedür için fare tutucu, makas ve diğer aletleri / malzemeleri monte edin.
- Fare tutucuya yerleştirin ve fare hareketi en aza indirgemek için tüpü sabitleyin.
- Kuyruk ve ameliyat makaslarını izopropil alkolle dezenfekte edin. Kuyruğa topikal anestetik krem uygulayın.
- Çok keskin cerrahi makas kullanarak, fare kuyruğunun ucunun yaklaşık 0,5-1 mm kadar keskin bir şekilde kesilir. Heparinize kılcal tüpler kullanarak yaklaşık 80 μL periferik kan toplar.
NOT: Bu yöntemle altı ti'den fazla kan toplanacaksaMes, kuyruk çıkarma kuyruk kaldırılan miktara saygı ile muhafazakâr olmalıdır. Çataklar kuyruk boyunca ilerledikçe çap artar, kanamalar hızlanır ve iyileşme daha uzun sürer.
- Plazma ayrımı
- Bir ampul şırınga (kılcal tüplerden atmak için) etiketli bir K 2 EDTA mikro torbasına tüp aktarın; Pıhtılaşmayı önlemek için 20 kez ters çevirin.
NOT: Tipik olarak kuyruk sıkışma kan pıhtısı hızlıdır. Bununla birlikte, eğer kanama yaklaşık 2 dakika daha uzun süre devam ederse, koagülasyona yardımcı olmak için stipit kalem / toz kullanın. - Kan alma tüplerini imalatçının talimatlarına göre santrifüjleyin ve ELISA testine hazır oluncaya kadar depolamaya yönelik plazma miktarını (-20 ° C) kullanın.
- Fare kanından fare-insan hücre benzeri veri gerekliyse, kalan pelleti 6.3.1. Adımda tarif edildiği gibi tedavi edin. Aksi halde, kan hücresi pelletini atın.
- Bir ampul şırınga (kılcal tüplerden atmak için) etiketli bir K 2 EDTA mikro torbasına tüp aktarın; Pıhtılaşmayı önlemek için 20 kez ters çevirin.
- Mikro hacimli modifiye edilmiş ELISAFare plazması umaları
NOT: Üreticinin ELISA prosedürü farelerden toplanan mikro hacimleri karşılamak için önerilen 100 μL numune hacminden 40 μL hacmine değiştirilmiştir. İn vivo fare plazma örneklerini bu sınırlı hacimlerle üçlü olarak çalıştırmak mümkün değildir. Deneyin sonunda, 500 μL ölüm sonrası kan, kardiyak ponksiyon yoluyla toplanır. 100 μL ötanazi plazması içinde değerlendirilen sitokin konsantrasyonları, her fare için 40 uL in vivo verileri doğrulamak için kullanılır.- Dondurulmuş fare plazma örneklerini çözdüm.
- Ciddi olarak ELISA standartlarını inceltin ve çukur başına 40 mcL'de üç kez plakaya koyun.
- Her fare plazma örneğinden 40 μL, ELISA plakasına ekleyin.
NOT: Bir fare numunesi 40 μL'den düşükse, hacmi ELISA tamponu ile 40 μL'ye getirin. Bu seyreltici hacmi kaydedin ve her seyreltilmiş numune için bir seyreltme faktörü hesaplamak için kullanın. Ne zamanELISA verilerini analiz etmek, orijinal numunedeki fiili sitokin konsantrasyonunu belirlemek için seyreltilmiş numune konsantrasyonunu numunenin seyreltme faktörü ile çarpar. - Üreticinin talimatlarına göre komple ELISA testi.
6. Hematopoietik Hücrelerin Fare Transplantasyonu
- Kemik iliğini nakil için duruma getirmek için kısır ışınlama
NOT: Loma Linda Üniversitesi (LLU), bir Cobalt-60 radyasyon kaynağı kullanmaktadır. Hayvanlar, 20 x 20 cm'lik bir alanda radyasyon kaynağından 80 cm uzaklıkta ve tutucu üstünde 0.5 cm'lik bir Lexan tabakasıyla konumlandırılmış bir turta sınırlandırıcıya yerleştirilir. Maruz kalma süresi, kaynağın son kalibrasyonunu temel alarak 225 cGy doz elde etmek üzere hesaplanmaktadır (şu an bu kaynak için 2-3 dakika).- Alt ölümcül ışınlama fareleri (bağışıklık yetersiz fareler için maksimum vücut ışınlama dozu 225 cGy).
- Transplant hematopoietik hücreler ~ 24 saat sonra </ Em> intravenöz kuyruk damarı enjeksiyonu.
- İntra venöz hematopoetik hücre nakli
- Fare başına 200 μL steril PBS hacmi içinde nakiller için insan hücre süspansiyonları hazırlayın: CD34 + hematopoietik kök hücreler (HSC): 1 x 10 5 ila 5 x 10 5 fare ve lösemi hücre hatları / hasta numuneleri için hücre: 1 x 10 6 ila Fare başına 5 x 106 hücre.
- Transplantasyondan hemen önceye kadar hücreleri 4 ° C'de tutun (buz üzerinde nakliye). Transplantasyondan önce hücrelerin en az RT'de olduğundan emin olun.
- Biyolojik güvenlik kapağını dezenfekte edin ve nakil enjeksiyonları için kaput alanını hazırlayın.
- Kuyruk damarlarının genişlemesine izin vermek için fareyi ısıtma kafesine en az 5 dakika bekletin.
- Hücre süspansiyonunu yavaşça karıştırın ve bir tüberkülin enjektörüne 200 mcL kadar kazın. İğneyi steril kalacağı yerden güvenli bir yere koyun.
- Fareyi bir tutma yerine yerleştirin ve kuyruk izopropil alkol ile dezenfekte edin.
- Standart intravenöz enjeksiyon tekniklerini kullanarak, insan hücre süspansiyonunu fare kuyruk damarına enjekte edin.
NOT: Kuyruk damarı enjeksiyonları, özellikle acemi bir hayvan işleyicisi için birkaç girişim alabilir. Kovacscics ve Raper'ın JoVE videosu 19 , bu hayvan tekniklerinin detaylı tanıtımını sağlar. - Yaklaşık 5 dakika boyunca farenin kurtarma işlemini izleyin. Enjeksiyondaki olumsuz olayları kaydedin ( örn. Dökülen hücreler, majör kanama, aşırı kuyruk travması).
- Fare periferik kandaki insan hücre kimerizmasının analizi
- Plazma ayrılmasından sonra mikrotever tüp içinde kalan kan hücresi peletini elde edin (adım 5.2.3).
- Kırmızı kan hücresi (RBC) lizisi için kalan plazma plazma hacmine eşit plazma PBS hacminde kalan kan peletini tekrar süspanse edin ve iyice karıştırın (vorteks / pipet).
- Her bir yeniden süspanse edilmiş kan örneğini etiketli bir 4 mL tüp içine aktarınVe sonra her tüpe 1: 9 oranında (100 uL yeniden askıya alınan kan için 900 μL RBC lizis tamponu) RBC liziz tamponu ekleyin. Oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Santrifüj (5 dak, 500 xg) ve döküntü.
- İkinci RBC liziz tamponu inkübasyonunu gerçekleştirin (oda sıcaklığında 5 dakika). Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve dökün.
- ~ 1 mL PBS'de kalan hücreleri yıkayın. Daha önce olduğu gibi santrifüjleyin ve dökün.
- Pelleti, standart akış sitometrisi lekelenmesi için uygun bir PBS hacminde tekrar süspanse edin (bu üretici ve bireysel laboratuvar protokollerine göre değişir). 20 Fare hücrelerini (fare CD45 +) ve insan hücrelerini (insan CD45 +) tanımlamak için akış-cyotmetery için onaylanmış immünofenotiplendirme antikorlarını kullanın 6 , 21 Ayrıca ilgi konusu hücre soyına spesifik ek insan lökosit işaretleyicileri.
NOT: "toplanmış numuneler" oluşturmak için her fare örneğinden küçük bir hacim (5 μL-20 μL) alınması önerilir.; Renklendirilmemiş, yaşayabilirlik ve izotip kontrol örnekleri için kullanılmıştır. Her deneysel koşul için renksiz ve izotip kontrollerinin yapılması en iyi yöntemdir.
7. İn vivo Sitokin Aktivitesinin Fonksiyonel Değerlendirilmesi
- Fare ötenazi ve doku hasatı
- Atanan deneysel zaman noktasında CO 2 asfiksasyonu yoluyla fareleri euthanize edin.
- Kan kardiyak ponksiyondan topar ve adım 5.2.1-5.2.2'deki gibi plazma toplar.
NOT: Diğer dokulara kıyasla kan toplayın çünkü ölüm sonrası hemen pıhtılaşmaya başlar. - Adım 5.2.2'de olduğu gibi fare kanını, alikuotu ve plazmayı işleyin.
- Daha sonra, imalatçının protokolüne göre Ötanazi'de elde edilen plazmada ELISA yoluyla eksojen sitokin konsantrasyonunu değerlendirin. Fare plazmasındaki exogenous sitokin konsantrasyonlarını seri olarak in vivo değerlendirin ve karşılaştırınKan toplama ve ötanazi plazma örnekleri (bölüm 5.3'de açıklanmıştır).
- 6.3.1 ve 6.3.2 adımlarında anlatıldığı gibi plazma hacmini ve prosesi değiştirmek için kalan kan numunesine PBS ekleyin. Akış sitometri testlerini derhal yapın ya da hücreleri dondurucu ortamda LN 2 depolaması için tekrar süspanse edin.
- PDX farelerinden kemik iliği (BM) ve dalak hasat edin ve daha önce anlatıldığı gibi tekli hücre süspansiyonları hazırlayın. 22
- Bir hemositometre kullanarak 1: 1 seyreltme ve sayım hücrelerinde metilen mavisi (lizleri hücre zarları ve canlı hücrelerin bozulmamış çekirdeğini bırakan RBC'ler) içeren% 3 asetik asit kullanarak her bir PDX fare doku örneği için hücre sayıları elde edin. Her bir hayvan için kemik iliği ve dalak örnekleri için toplam hücre sayılarını tablolaştırın.
- Santrifüj (500 xg, 15 dakika) hücre süspansiyonları ve süpernatanı boşaltın. Kemik iliği ve / veya dalak hücrelerinin akış-sitometri analizlerini derhal yapın veya LN 2 depolama alanı.
NOT: Fare başına 10 BM alikotları (gelecek biyokimyasal analizler için) ve ~ 5 dalak alikosu (gelecek PDX nakilleri için) dondurun. - In vivo fonksiyonel etkileri tanımlamak için immünofotasyon
- İlgi sitokinine yanıt veren immünofenotip hematopoietik popülasyon (lar) a bir akış sitometri antikorlarının bir master-mix (MM) hazırlayın ve ikinci bir izotip kontrol antikoru MM'si hazırlayın ( Şekil 5 ve Malzeme Tablosu).
- Adım 7.4'te hazırlanan PDX doku alikoları (37 ° C boncuk banyosu) çözülür.
- Çözülmüş hücreleri konik bir tüpe aktararak ve en az 3x hacim PBS ilave ederek yıkayın. Santrifüj (500 xg, 5 dakika) ve süpernatanı boşaltın.
- Yıkama adımını tekrarlayın (Madde 7.5.3).
- Renklendirilmemiş kontrol, canlılık kontrolü ve izotip kontrolleri için her bir PDX örneğinden ~ 10 μL-20 μL hücre alarak havuzlanmış alikotlar oluşturun (bkz. Adım 6.4.6 not). Tüm örnekleri boyayın, ancak siz hariçSabit bir yaşayabilirlik boyası (ölü hücre işaretleyicisi) ile kontrol edin, inkübe edin ve üreticinin protokolüne göre yıkayın.
- Her PDX hücre örneğini, standart akış sitometrisi boyama protokolüne göre fenotipleme-MM ile boyayın; Benzer şekilde, izole edilmiş izotip kontrol örneğini izotip-MM ile boyayın. Tüm numuneleri kuluçkaya yatırın, PBS ile yıkayın ve% 1 paraformaldehitle tekrar süspanse ederek örnekleri düzeltin.
- Akış sitometrisi verilerini toplayın ve ilgilenen hücre popülasyonu için uygun bir geçiş stratejisi kullanarak verileri analiz edin ( Şekil 5 ). Tipik bir geçiş aşağıdaki gibidir:
- Hasarsız hücreleri, enkazı dışlayan bir FSC ve SSC geçidi çizerek tanımlayın.
- Ölü hücre işaretleyicisi için negatif olan hücreler üzerinde kapıları tutarak canlı hücrelerin popülasyonunu belirleyin (bu "toplam canlı hücreler" dir).
- İstenen imünofenotip ile hücre popülasyonlarını tanımlamak için "toplam canlı hücreler" içinde alt kapılar kullanın (bkz. Şekil 5).
- Elde etAkım sitometrisi analizinden toplam canlı hücre sayısı içindeki alt grup hücre popülasyonlarının sıklığı. 6 , 21
- Toplam canlı hücrelerde (adım 7.5.6.4'te elde edilen) B hücresi alt kümesinin frekansıyla, adım 7.3'te elde edilen doku başına toplam canlı hücre sayısı ile çarpılarak her dokuda hedef hücre sayısını hesaplayın (% B hücre alt kümesi x " Hemositometre hücre sayısı ", bakınız Tablo 1 )
- Kontrol dışı PDX fareleri ile sitokin eksprese eden (TSLP +) PDX fareler arasındaki hedef hücre popülasyonlarının hücre sayılarını, eksojen insan sitokininin in vivo fonksiyonel etkilerini belirlemek için karşılaştırın ( Tablo 1 ).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Modele genel bir bakış Şekil 1'de gösterilmektedir . Sitokin üreten (TSLP + stroma) ve kontrol stroması elde edildiğinde kültürde genleşirler. Farelere stroma enjeksiyonundan önce, stromal hücre yüzer maddesi, sitokin üretimini doğrulamak için ELISA ile değerlendirilir ( Şekil 2 ) ve stroma tarafından üretilen sitokinin aktivitesini doğrulamak için fosfo-akış sitometresi (Protokol 3) kullanılır. Hücreler pasajlandığında, konfluent stromal hücre kültü...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu el yazması, eksojen insan sitokini sentezlemek için PDX'in mühendisliği için basit, hızlı ve nispeten düşük maliyetli bir yöntemi anlatmaktadır. Burada tarif edilen strateji, insan sitokini, TSLP'yi eksprese etmek için transduze edilen bir stromal hücre hattının haftalık intraperitoneal enjeksiyonuna dayanır. Burada açıklanan yöntemleri uygulamadan önce, yüksek sitokin düzeyini (TSLP) ifade etmek üzere tasarlanmış stroma ve benzer şekilde tasarlanmış kontrol stroması üretildi. Burada sunulan protokollerde, st...
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, NIH R21CA162259, NIH R01CA209829, NIH P20 MD006988, NIH 2R25 GM060507, Hyundai Hope on Wheels Scholar Hope Grant, Patoloji ve İnsan Anatomisi Bölümü, Temel Bilimler Bölümü ve Loma Linda Üniversitesi Tıp Fakültesi Sağlık Eşitsizlikleri ve Moleküler Tıp Merkezi tarafından ve Loma Linda Üniversitesi'nden (KJP) İşbirliğine Dayalı ve Translasyonel Araştırmaları Teşvik Etme Hibesi ile desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve NIH'nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Islak laboratuvar reaktifleri | |||
| T-25 Nunc Hücre Kültürü İşlem Görmüş EasYFlasks, 7 mL kapasite, 25cm² kültür alanı | Thermo Scientific / Fisher | 156367 | |
| T-75 Falcon Doku Kültürü İşlem Görmüş Şişe, 250 mL kapasiteli, 75 cm& sup2; kültür alanı ve bacalı kapak | Corning Inc. / Fisher | 353136 | |
| T-150 Falcon Doku Kültürü İşlem Görmüş Şişe, 600 mL kapasiteli, 150 cm² Kültür Alanı & bacalı kapak | Corning Inc. / Fisher | 355001 | |
| 10 mL serolojik pipetler | Falcon | 357551 | |
| 15 mL polipropilen konik borular | Fisher | 05-539-12 | |
| 5 mL yuvarlak tabanlı polistiren tüpler | Falcon | 352054 | |
| 50 mL polipropilen konik borular | Falcon | 352098 | |
| 2.0 mL kriyojenik şişeler, dıştan dişli | Corning Inc. / Fisher | 4230659 | |
| 1 mL pipet uçları | Fisher | 2707509 | |
| 200 & mu; L pipet uçları | Denville Bilimsel | P3020-CPS | |
| 10 & mu; L pipet uçları | Denville Scientific | P-1096-CP | |
| SFCA Membranlı Steril Tek Kullanımlık Filtre Üniteleri, Nalgene Hızlı Akışlı | Fisher | 09-740-28D | |
| 2 NH2SO4 | BioLegend | 423001 | |
| Dulbecco' Kalikyum ve magnezyum içermeyen fosfat tamponlu salin (PBS), 1 kez; | Corning cellgro/ Mediatech | 21-031-CV | |
| İnsan TSLP ELISA Max Deluxe Set | BioLegend | 434204 | |
| Metilen Mavisi Kök Hücre Teknolojileri ile %3 Asetik Asit | 7060 | ||
| Tripan Mavisi | Corning | 25-900-Cl | |
| "Tripsin" 1x% 0.25 Tripsin 2.21 mM EDTA HBSS | ThermoFisher | 25-053 | |
| TWEEN 20 BioXtra | Sigma-Aldrich | P-7949 | |
| R10 inç hücre kültürü ortamı, toplam hacmin% 'si (565 mL yapar) | - | - | Lab Tarifi |
| RPMI, %88.5 (500 mL) | Mediatech | 10-040-CV | |
| FBS, %9.9 (56 mL) | Mediatech | 35-011-CV | |
| L-Glutamin, %0.99 (5.6 mL) | Mediatech | 25-005-Cl | |
| Penisilin-Streptomisin, %0.50 (2.8 mL) | Mediatech | 30-002-Cl | |
| 2-Merkaptoetanol, %0.10 (560 & mikro; L) | Milletvekili | 190242 | |
| " R20 inç hücre kültürü ortamı, toplam hacmin% 'si (195 mL yapar) < / güçlü > | - | Lab Tarifi< / güçlü > | |
| & nbsp; RPMI, %76.84 (150 mL) | yukarıya bakın | ||
| FBS, %20.49 (40 mL) | yukarıya bakın | yukarıya | |
| 2mM L-glutamin, %1.02 (2 mL) | yukarıya bakın | ||
| 1 mM Na piruvat,% 1.02 (2 mL) | yukarıya bakın | yukarıya | |
| Penisilin-Streptomisin, %0.51 (1 mL) | yukarıya bakın | yukarıya | |
| 2-Merkaptoetanol, %0,10 (0,1 M), % 0.10 (200 & mikro; L) | yukarıya bakın | yukarıya | |
| " Donma ortamı", toplam hacmin% | - | - | Lab Tarifi |
| >" R10 inç orta, %45 | "R10" tarifine | bakın-FBS | |
| , %20 | yukarıya bakın | 35-011-CV | |
| DMSO, %10 | Corning | 25-950-CQC | |
| D (-) (+) - Trehaloz dihidrat, %5 | Fisher Scientific | BP2687-100 | |
| < güçlü > | < güçlü > Şirket< / güçlü > | < güçlü > Katolog Numarası< / güçlü> | Comments |
| Biologics | |||
| "HS-27" HS-27A insan stroma hattı | ATCC | CRL-2496 | |
| "ÇAĞRI-4" MHH-ÇAĞRI-4 hücre hattı, insan B hücresi öncüsü lösemi | DSMZ | ACC 337 | |
| " NSG fareleri" NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ, erkek veya kadın, 6 yaş ve dışı; 8 hafta | JAX Fareler | # 005557 | |
| MUTZ-5 hücre hattı, insan B hücresi öncüsü lösemi | DSMZ | ACC 490 | |
| Rekombinant İnsan TSLP proteini | R& D Systems | 1398-TS-010 | |
| Name | Company | Catolog Numarası | Comments |
| Flow sitomery antikorları (klon)* | |||
| Anti-fare CD45 FITC (30F11) | Miltenyi Biotec | 130-102-778 | |
| CD127 PE (MB15-18C9) (alternatif adı IL-7Rα) | Miltenyi Biotec | 130-098-094 | |
| CD34 APC (8G12) | BD Biosciences | 340667 | |
| CD45 PE-Cy7 (HI30) | eBioscience | 25-0459 | |
| "FVD" Sabitlenebilir canlılık boyası eFluor 780 | eBioscience | 65-0865 | |
| Ig & kappa; hafif zincir FITC (G20-193) | BD Pharmingen | 555791 | |
| Ig &da; hafif zincir FITC (JDC-12) | BD Pharmingen | 561379 | |
| IgD PE (IA6-2) | BioLegend | 348203 | |
| IgM PE-CY5 (G20-127) | BD Biosciences | 551079 | |
| pSTAT5 PE, fare anti-STAT5 (pY694) | BD PhosphoFlow | 612567 | |
| Name | Company | Catolog Number | Comments |
| Diğer malzemeler ve ekipmanlar | |||
| Canula Trovan ile Hayvan İmplante Edilebilir Nano Transponder | ID-100B (1.25) | ||
| EMLA lidokain anestezik krem (hayvan bakım tesisi aracılığıyla öngörü ile elde edilir) | reçete | yazma BD | |
| & frac12; cc LO-DOSE U-100 İnsülin Şırınga 28G & frac12; | BD | # 329461 | |
| K < sub > 2 < / sub > EDTA BD ile Mikrotainer Tüpler | BD & nbsp; | #365974 | |
| Santrifüj | Beckman Coulter | Alegra X-15R | |
| FisherBrand Kılcal Tüpler (Heparinize Edilmiş) | Fisher Scientific | 22-260-950 | |
| Hemositometre | Fisher | 02-671-6 | |
| MACSQuant Analiz Cihazı 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| Fare Pastası | Kafesi Braintree Scientific, Inc. | MPC-1 | |
| Fare Kuyruğu Aydınlatıcı Süzgeç | Braintree Scientific, Inc. | MTI STD | |
| Tabanca Kabzalı İmplanter Trovan | IM-300 (1.25) | ||
| ve mikro; Nicelik | Bio-Tek Enstrüman A.Ş. | MQX200 | |
| FlowJo akış sitometrisi analiz yazılımı | FlowJo, LLC | Sürüm 10 | |
| *Aksi belirtilmedikçe tüm antikorlar insan karşıtıdır. |
Kaynaklar
- Francis, O. L., Milford, T. A., Beldiman, C., Payne, K. J. Fine-tuning patient-derived xenograft models for precision medicine approaches in leukemia. J Investig Med. 64 (3), 740-744 (2016).
- Parrish, Y. K., et al. IL-7 Dependence in human B lymphopoiesis increases during progression of ontogeny from cord blood to bone marrow. J Immunol. 182 (7), 4255-4266 (2009).
- Johnson, S. E., Shah, N., Panoskaltsis-Mortari, A., LeBien, T. W. Murine and human IL-7 activate STAT5 and induce proliferation of normal human pro-B cells. J Immunol. 175 (11), 7325-7331 (2005).
- Milford, T. A., et al. TSLP or IL-7 provide an IL-7Ralpha signal that is critical for human B lymphopoiesis. Eur J Immunol. 46 (9), 2155-2161 (2016).
- Reche, P. A., et al. Human thymic stromal lymphopoietin preferentially stimulates myeloid cells. J Immunol. 167 (1), 336-343 (2001).
- Francis, O. L., et al. A novel xenograft model to study the role of TSLP-induced CRLF2 signals in normal and malignant human B lymphopoiesis. Haematologica. 101 (4), 417-426 (2016).
- Willinger, T., Rongvaux, A., Strowig, T., Manz, M. G., Flavell, R. A. Improving human hemato-lymphoid-system mice by cytokine knock-in gene replacement. Trends Immunol. 32 (7), 321-327 (2011).
- Graf, L., Iwata, M., Torok-Storb, B. Gene expression profiling of the functionally distinct human bone marrow stromal cell lines HS-5 and HS-27a. Blood. 100 (4), 1509-1511 (2002).
- Follenzi, A., Ailles, L. E., Bakovic, S., Geuna, M., Naldini, L. Gene transfer by lentiviral vectors is limited by nuclear translocation and rescued by HIV-1 pol sequences. Nat Genet. 25 (2), 217-222 (2000).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. (63), e4031(2012).
- Cockrell, A. S., Kafri, T. Gene delivery by lentivirus vectors. Mol Biotechnol. 36 (3), 184-204 (2007).
- Ricardo, R., Phelan, K. Freezing, thawing, and packaging cells for transport. J Vis Exp. (17), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The ELISA Method. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5061 (2016).
- Tasian, S. K., et al. Aberrant STAT5 and PI3K/mTOR pathway signaling occurs in human CRLF2-rearranged B-precursor acute lymphoblastic leukemia. Blood. 120 (4), 833-842 (2012).
- Kalaitzidis, D., Neel, B. G. Flow-cytometric phosphoprotein analysis reveals agonist and temporal differences in responses of murine hematopoietic stem/progenitor cells. PLoS One. 3 (11), (2008).
- JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Using a Hemacytometer to Count Cells. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5048 (2016).
- JoVE Science Education Database. Essentials of Biology 2: Mouse, Zebrafish, and Chick. Introducing Experimental Agents into the Mouse. JoVE. , Cambridge, MA. http://www.jove.com/science-education/5161 (2016).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. J Vis Exp. (67), (2012).
- Kovacsics, D., Raper, J. Transient expression of proteins by hydrodynamic gene delivery in mice. J Vis Exp. (87), (2014).
- Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
- Pearson, T., Greiner, D. L., Shultz, L. D. Chapter 15, Creation of "humanized" mice to study human immunity. Curr Protoc Immunol. , (2008).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. J Vis Exp. (17), (2008).
- Scheeren, F. A., et al. Thymic stromal lymphopoietin induces early human B-cell proliferation and differentiation. Eur J Immunol. 40 (4), 955-965 (2010).
- Lee, E. B., et al. Increased serum thymic stromal lymphopoietin in children with atopic dermatitis. Pediatr Allergy Immunol. 21 (2 Pt 2), e457-e460 (2010).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
