Yöntem makalesi

İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

DOI:

10.3791/55397

⸱

3 Nisan 2017

 , 
1Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec, Department of Psychiatry and Neuroscience, Université Laval, 2Centre de recherche du CHU Sainte-Justine

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, kolay ve düşük maliyetli sağlar ve zaman tasarrufu sağlayan bir protokol kimyasal transmisyon elektron mikroskobu için immünohistokimya ön gömme uyumlu uzun süreli koruma sağlayan, akrolein sabitleyici ile primat beyin dokusunun düzeltmek için.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ışık mikroskobu düzeyinde tüm teknolojik gelişmelere rağmen, elektron mikroskobu böyle sinaptik kişiler gibi nöronların, ultrastrüktürel ve morfolojik ayrıntılarını incelemek ve karakterize edilmesi sinirbilimindeki tek uygulama. elektron mikroskobu için, beyin dokusunun iyi koruma titiz kriyo-sabitleme yöntemleri ile elde edilebilir, ancak bu teknikler oldukça maliyetlidir ve tanımlanan nöronal sistemler arasında bağlantı anlamak önemlidir immunolabeling kullanımını sınırlar. Dondurularak ikame yöntemleri immunolabeling ile kriyo-tespitin bileşimini sağlamak için geliştirilmiştir. Ancak bu metodolojik yaklaşımların tekrarlanabilirlik genellikle masraflı donma cihazlarda dayanır. Üstelik bu teknikle güvenilir sonuçlar elde çok zaman alıcı ve beceri zorlu olduğunu. Bu nedenle, özellikle akrolein sabitleyici geleneksel kimyasal sabit beyin, elektron birleştirmek için bir zaman etkili ve düşük maliyetli bir yöntem olmaya devam etmektedirimmünhistokimya ile mikroskopi. Burada, primat beyin dokusunun korunması yol açar ve immünohistokimya ve transmisyon elektron mikroskobik inceleme öncesi gömme uyumlu kimyasal akrolein fiksasyonu ile güvenilir bir deney protokolü sağlar.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Işık mikroskopisi, 2, diğer şeylerin 1 arasında vivo nöronal süreçlerde okuyan için etkin bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Işık Mikroskobik (LM) seviyesinde tipik uzamsal çözünürlük gibi aşırı ultraviyole ve yumuşak X-ışını mikroskopi için farklı ışık kaynaklarını kullanarak yaklaşık 200 nm, son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler olmasına rağmen, özellikle bir, yaklaşık 10 nm uzaysal çözünürlük 3, bu çözünürlük artmıştır , 4, 5. Görüntülemede Diğer teknolojik gelişmeler histoloji ile manyetik rezonans görüntüleme birleştirildi ve in vivo olarak miyelin kılıfının sadece Elektron Mikroskobik (EM) seviyesi 6, 7, geleneksel olarak ölçülebildiği bir parametre kalınlığının ölçülmesi için yeni bir yöntem sağlamaktır içerir. AlthouGH LM seviyesinde bu gelişmeler, örneğin, sinaptik temasların olarak yaşayan işlemleri, yapıları detaylı bir görünümünü ve karakterizasyon incelenmesi için mükemmel bir araç sağlar, 0.5 nm ulaşabilir çözünürlüğe sahip EM ile elde edilebilir. Bununla birlikte, EM seviyesinde gözlem hücre mimarisini korumak amacıyla, kimyasal tespit ve dehidrasyon işlemleri ile, bazı açılardan, ölü ve değiştirilmiş olduğu numuneler gerektirir. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte biyolojik örneklerinin incelenmesi bağlı radyasyon elektron ışını hasar, düşük kontrast, membranların yapısal sapma, ya da 8, 9, 10 gömme aşağıdaki dehidrasyon ve epoksi oluşabilir eserler da varlığına zor olabilir.

Yapısal analiz için kendi doğal biçiminde numuneler koruma "Vitrifiye Kısımların Krio-EM" kullanılarak veya CEMOVIS bir kesit bir yaklaşım ile elde edilebilirhızlı dondurma ve camsı buz numune yerleştirme ve bir kriyojenik sıcaklık 11, 12 EM bölümü altında incelenmesi ile. Onlar hala sağlam ve tam sulu iken Bu prosedür böylece dehidrasyon nedeniyle eserler ortadan kaldırarak 13 işlediğinde, numunelerin incelenmesi için izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli ek harcamalar, çok düşük sıcaklıklarda, bu gözlem olanak sağlamak amacıyla, kriyo-ultramikrotom için ilave cihazlar, hem de standart EM ek aygıtları kapsamaktadır. Buna ek olarak, CEMOVIS yaklaşım antikorlar genellikle oda sıcaklığında inkübe edilmesi gerekir, çünkü teknikleri ile immün kullanımını engeller. Seçenek olarak ise, kriyo-koruyucu kimyasal immerged ve inci ise cryo sabit Numuneler çözülür sırasında dondurularak ikame yaklaşım kullanılarak immünohistokimyasal prosedürlere ultrastrüktürel analiz birleştirmek mümkündürtr Böyle Lowicryls gibi özel reçineler, gömülü. Post-gömme immunolabeling sonra böyle materyal 12 üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, dondurularak ikamesi ve cryo-sabitleme teknikleri zaman alıcıdır. Bunlar, ilave donanım takılmasını gerektirir ve düşük bir sıcaklıkta 14, 15 kullanımına rağmen, bir organik çözücü ve hücre mimarisini değiştirebilir kimyasal sabitleyici maruz kalması örnekleri gerektirir. Bu nedenle, özellikle akrolein LM ve EM DÜZEYİ, beyin dokusunun kimyasal sabitleme, her ikisi de tüm teknolojik ilerlemelere rağmen, EM 16 immünohistokimya birleştirmek için bir düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlayan bir yöntem olmaya devam etmektedir.

Son birkaç on yılda, birçok girişimde iyi doku korunmasını sağlayan aldehitlerin karışımı bulmak için yapılmıştır. 1960'lardan önce, EM için kabul edilebilir sonuçlar vermiştir sadece kimyasal sabitleyici ozmiyum tetroksit oldu. Bununla birlikte, ozmiyum tetroksit beyin gibi organları düzeltmek için damar sistemi aracılığıyla kullanımını engelleyen, son derece zehirli ve pahalıdır. Akrolein hücresel yapıların 17 EM, gözlem için uygun hayvan doku koruması için güvenilir bir yöntem olarak 1950'lerin sonlarında tanıtıldı. Bu daha derin doku nüfuz eder ve daldırma ile fiksasyonu için ve doku 17 minimum çekme sitoplazmik bileşenlerin iyi bir koruma sağlar, diğer aldehitler daha hızlı bir şekilde tepki verir. Bu tür enzimler ve diğer proteinleri 18 gibi moleküler bileşiklerin, canlı daha doğru bir lokalizasyonu ile, taze doku kullanıldığında Böyle bir özellik akrolein fiksasyon başka aldehitlerle üzerinde açık bir avantaj sağlar. Gerçekten de, bu etkin bir stabilitesine sahip olarak, Kurbağa ve kemirgenler de dahil olmak üzere pek çok türde, EM seviyesinde görselleştirme için fiksasyon kolay, verimli ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yıl boyunca doğrulanmıştırzes peptidler ve proteinler, antijenitesini muhafaza eden ve 16, 18, 19, 20, 21 tespit maddesi bir aldehit ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman nispeten sağlam ultrastrüktürel sağlar. Kemirgenlerde akrolein tespit için protokoller o zamandan beri standardize edilmiş ve EM 16, 22 için çift immunolabeling uygulamak, özellikle Pickel grup tarafından, yoğun kullandık. Birkaç grupları insan olmayan primat beyin dokusunda 23 akrolein fiksasyonunu kullandık. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, verimli EM 24 immunolabeling uyumlu insan olmayan primatlarda akrolein ile kimyasal fiksasyonunu açıklayan tek yayınlanmış protokol vardır.

Bu makalede, verimli kimyasal olarak uğultu düzeltmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamaktırile immün ve iletim EM inceleme öncesi gömme birlikte, potansiyel olarak uzun süreli korunması için izin akrolein bir primat beyinler.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: hayvanların yer aldığı tüm protokoller Comité de Koruma des Animaux de l'Université Laval tarafından onaylandı ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı (Ed 2.) Hayvan Bakımı Kılavuzu Kanada Konseyi çerçevesinde yapılmıştır. Burada açıklanan protokol yaklaşık 800 g yetişkin hayvanlar için optimize edildi. sabitleştirici hacimleri hayvanın büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır.

Transkardiyak perfüzyon için Çözümler hazırlanması 1.

  1. aşağıdaki aşamalara göre bir 50 mM sodyum fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi 1 L'lik hazırlayın. perfüzyon önce en çok 24 saattir çözeltisi hazırlayın ve kullanılana kadar 4 ° C 'de devam edin.
    1. 1 L'lik bir şişeye damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 5.87 g ekleme (Na2 HPO 4), monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 1.20 g (NaH2 4 · H2O) ve 9 grsodyum klorür (NaCI). çözülmeye karıştırınız.
    2. 5 N NaOH eklenerek pH 7.4'e ayarlanmıştır. 1 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle
      DİKKAT: NaOH aşındırıcı kimyasal bileşiktir. Uygun Kişisel Koruyucu Ekipman Wear (PPE;. Laboratuvar mont, eldiven, koruyucu gözlük, vs).
  2. aşağıdaki adımlara uygun olarak% 4 paraformaldehit (PFA) 2 L hazırlayın. Bu çözelti, ameliyattan önce en fazla 24 saat hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C 'de tutulması gerekmektedir.
    1. 2 L'lik bir kap içerisinde damıtılmış su, 1.5 L ölçülür. Dibazik susuz sodyum fosfat 23.48 g (Na2 HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 4.80 g ekleme (NaH2 4 · H2O). çözülmeye karıştırınız. 2 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle
    2. 55 ° C - sıcaklık yaklaşık 45 ulaşıncaya kadar bir havalandırma başlık altında çözelti ısıtılır. 60 ° C'ye kadar ısıtın vermeyin.
    3. Yavaş yavaş çözeltiye PFA 80 g ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın (yaklaşık 30-60 dakika). 60 ° C'nin altında tutmaya sıcaklığının kontrolü tutun.
      DİKKAT: PFA olarak toz formunda çok uçucudur. Gözler veya deri ile teması halinde çok zehirlidir ve solunum veya sindirim durumunda tehlikelidir. PPE Aşınma ve bir havalandırma başlık altında dikkatli bir şekilde kullanın.
    4. 4 ° C ve filtreye çözeltiyi soğutun. 4 ° C'de saklayın.
  3. aşağıdaki adımlara uygun olarak 0.1 M fosfat tampon (PB) içinde% 3 akrolein 1 L hazırlayın. PB solüsyon, perfüzyon en fazla 24 saat hazırlanmalıdır.
    DİKKAT: Acrolein teneffüs ve acil hasar meydana getirebilmektedir son derece toksiktir. Eğer deri yoluyla absorbe Ayrıca aşındırıcı ve son derece toksiktir. Bu kanserojen ve mutajen olduğunu. Uygun PPE giyin ve bir havalandırma başlık altında kullanın.
    1. damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 8.66 g ekleme (Na2 HPO 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 5.38 g (NaH2 4 · H2O). Bütün tuzlar eriyene kadar karıştırın. 4 ° C'de çözüm tutun 1 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle.
    2. Ameliyat öncesi 1 L'lik bir cam kaba PB çözeltisinden 900 mL kadar transferi ve bir havalandırma başlık altında% 97 akrolein çözeltisi 30.94 ml. 1 L ilave edin ve karıştırın toplam hacme ulaşmak için PB solüsyonu ekleyin. çözüm Filtre ve 4 ° C'de saklayın.

2. transcardiac Perfüzyon ve Beyin Diseksiyon

  1. bütün cerrahi prosedür sırasında buz üzerinde çözüm tutun. (50 mM PBS) ve bir hava hortumu kalana kadar pompayı dönüm kullanılacak ilk çözelti içinde tüp yerleştirilmesi pompayı hazırlayın. bir makak maymunu transkardiyak perfüzyon için, bir 21 G iğne kullanımı ve çıkış yaklaşık 80 mL / dak ayarlayın.
  2. bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi hayvanketamin (20 mg / kg), ksilazin (4 mg / kg) ve asepromazin (/ kg, 0.5 mg) Ture. izofluran (% 3) sedasyon altında hayvan bakımı.
  3. Bir havalandırma masaya hayvanın uzuvları takın.
  4. bir neşter ile, koltukaltı cilt kadar kaldırın. Karın kasları kesin. dikkatle hayati organlara kaçınarak yanal kaburga kesmek için ağır cerrahi makas kullanın.
  5. Cerrahi makas ile diyafram kesip kalp açığa çıkarmak için göğüs kafesi yükseltmek. diyafram kesildiğinde kalp dakika içinde dayak durdurulmayacağından, hızla devam edin.
  6. Bir neşter bıçağı ile perikard çıkarın ve sol ventrikül içine iğne takın. bir neşter ile, dikkatlice sağ atriyuma küçük eksizyonu olun. Hızlı bir şekilde 72 ml / dakika pompayı çalıştırmak ve iğneyi yerinde tutun. Mümkünse, kalp daha düşük düzeyde başını sahip olmak için hayvan yatırın.
    NOT: İğneyi eklerken interventriküler septumu delmek için dikkatli olun.
    1. rinsakciğer kadar PBS yaklaşık 300 mL 'si ile, e Kan, beyaz ve kan sağ atriyum gelir.
  7. hızlı, pompa durdurma% 3 akrolein çözeltisine hortumu / tüp transferi ve tekrar pompayı çalıştırın. Kalp atışını durduktan sonra yavaş yavaş 80 ml / dk pompalama hızını artırmak. akrolein çözeltisi yaklaşık 500 ml serpmek.
  8. hızlı, pompayı durdurun% 4 PFA çözüm hortumu aktarmak ve tekrar pompayı başlatın. Bu adım, PFA, yaklaşık 1 L gerektirir.
    NOT: ön ayaklar bükülmezdir ve boyun sert olduğu zaman tespit tamamlanır.
  9. kafasını kesip dikkatlice kafatasının dışında beyin teşrih. cerrahi aletlerle beyin zarar vermemeye özen gösterin. Beyin, uçuk (kan eser) ve katı (Şekil 1A) olduğu zaman perfüzyon en uygunudur.
  10. 4 ° C'de 1 saat süresince% 4 PFA içinde sağlam beyin bırakın.
  11. Seri olarak bir soğutma vibratome (4 ° C) ile beyin kesilmişve 50 um kalınlıkta bölümler halinde istenilen düzlemde PBS (0.1 M) (Şekil 1B) bunları toplamak.
    NOT: Bu adım, istenen protokole göre birçok yönden yapılabilir. Yarıküreleri kesme, ya da muhafaza bütün vibratome önce ayrılabilir. Beyin vibratome platformu için çok büyükse, daha küçük bloklar halinde kesilebilir. Bu aşamadan sonra, bölümler% 40 PB (50 mM),% 30 gliserol ve% 30 etilen glikol yapılmış bir antifriz solüsyonu içinde -30 ° C de, uzun bir süre boyunca saklanabilir.

3. İmünohistokimya Ön gömme (Şekil 1C)

  1. aşağıdaki gibi Tris-tamponlu salin içinde bir 4 L'lik bir stok çözeltisi (TBS, 50 mM, pH 7.6) hazırlayın.
    1. , 4 L'lik bir beher içinde damıtılmış su 2L ölçün trihidroksimetil aminometan ve 24.23 g ekleyin (THAM C 4H 11 NO 3) ve bir karıştırma çözülmesi için.
    2. 1 N HCI, yaklaşık 148 mL 'si ile 7.6 arasında pH ayarlayın. asit cauti ile eklenmelidirile 7.6 altındaki bir pH değerine ulaşılana önlemek için. Toplam hacim olmalıdır 4 L
      DİKKAT: HCl aşındırıcı etkisi. Uygun PPE giyin.
  2. ilgi alanı ihtiva eden (aşama 2.11) bölümleri seçin EM imünohistokimya için işlenecek.
  3. antifriz solüsyonu durulama, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde serbest yüzen bölümler 3x (0.1 M, pH 7.4) yıkanır.
  4. PBS içinde seyreltilmiş NaBH4 bir% 0.5 çözelti hazırlayın.
    1. NaBH4 0.05 g tartın ve 10 ml PBS içinde seyreltin. Kapatma. Kullanımdan hemen önce bu çözelti hazırlayın.
  5. Oda sıcaklığında 30 dakika için taze hazırlanmış NaBH4 çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. Kapatma.
  6. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde yıkama 3x, reaksiyon gazının hiçbiri kadar kuvvetli bir şekilde sallanan kalır.
  7. % 2 göre normal serum ve PBS içinde sulandırılmış% 0.5 soğuk balık jelatininin EM için bloke edici bir çözelti hazırlayın.
    NOT: Miktar shouliçin hesaplanır d Aşağıdaki üç adım için yeterli olması. ikincil antikor barındıran aynı hayvan türlerinden oluşan bir serum kullanın. bu yöntemler, önemli ölçüde doku kalitesini tehlikeye antijen alma yöntemleri ya da Triton az miktarda ilave kullanımını önlemek, (antikorlar penetrasyonunu artırmak için).
  8. Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
  9. bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi hazırlayın.
    Not: Primer antikor konsantrasyonu, genel olarak LM immünohistokimya ile aynıdır, ancak bazı birincil antikorlar akrolein çalışmayabilir olarak, daha önce farklı bir antikor konsantrasyonları ile testler düşünün. (-% 2 0.1) ve transkardiyak perfüzyon için% 4 PFA ve benzer sonuçlar elde Eğer öyleyse, o glutaraldehit bir karışımını kullanmak da mümkündür. inkübasyon süresinin ve sıcaklığın yanı sıra duruma getirin.
  10. Primer antikor solüsyonu içinde bölümleri inkübegece boyunca hafifçe çalkalanarak ilave edilir. önceden test edilmiş inkübasyon süresi ve sıcaklığı kullanın.
  11. hafif sallama ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümleri 3 kez yıkanır.
  12. bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor 1000 çözeltisi: Bir 1 hazırlayın.
    NOT: ikincil antikor birincil bir antikor üretmek için kullanılan konakçı türlerine karşı yükseltilmelidir.
  13. Oda sıcaklığında 1.5 saat için ikincil antikor çözeltisinin bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
  14. en az 60 dakika önce ikincil antikor inkübasyonun sonunda bir avidin-biyotin-peroksidaz (ABC) çözeltisi hazırlayın.
    1. A ve B solüsyonlarının 8.80 uL / ​​mL ölçmek ve PBS içinde seyreltilmesi, kalibre edilmiş bir pipet kullanın.
    2. avidin ve biyotin molekülleri arasındaki bağlanma tamamlaması izin vermek için oda sıcaklığında en az 60 dakika boyunca hafif sallayın.
  15. İkincil antikor çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3 kez yıkanır.
  16. böylece ABC bölümleri inkübeOda sıcaklığında 1 saat boyunca Devriminin. hafifçe sallayın.
  17. hafif sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile TBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkanır.
  18. TBS içinde seyreltilmiş% 0.005 H2O 2% 0.05 3,3'-diaminobenzidin (DAB), taze bir çözelti hazırlayın.
    1. DAB 12.5 mg tartılır ve soğuk TBS 25 mL seyreltik. Işıktan koruyunuz.
      DİKKAT: Solunması DAB tozu çok uçucu ve zararlıdır. Bu karsinojenik ve teratojenik olduğunu. seyreltilmiş Dolayısıyla, hamile veya emziren kadınlar bile, bu ürünü manipüle olmamalıdır. işlenirken bir N95 maskesi kullanın ve PPE giyerler.
    2. Çözelti süzülür ve kullanımdan hemen önce,% 30 H2O 2 4.5 uL ekleyin.
  19. Oda sıcaklığında 3 dakika ila 7 DAB çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
    NOT: kahverengi çökelti arka plan boyama yüksek düzeyde önlemek için çok karanlık olmamalıdır. İnkübasyon süresi buna göre optimize edilmelidir.
  20. hızla iki kez yıkayarak reaksiyonu durdurunSoğuk TBS içinde, daha sonra iki kez oda sıcaklığında, soğuk TBS içinde 10 dakika kadar hafif bir sallama ile PB iki kez 10 dakika, ardından.
    Not: PB (olup PBS) kullanımı, osmiyum ve form kristalleri ile tepkimeye gibi, NaCI izlerini ortadan kaldırmak için kritiktir.

Elektron Mikroskobik Gözlem 4. Osmification ve katıştırma

  1. PB içerisinde seyreltilmiş,% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi (OsO 4) hazırlanması. Işıktan koruyunuz.
    DİKKAT: Osmiyum çok zehirlidir ve deri, gözler ve ağız ile temas etmemelidir ve teneffüs edilmemelidir. Şayet yutulursa ölüme neden olabilir. Sadece bir havalandırma başlık altında ve uygun KKD ile kullanılmalıdır.
  2. (Çalkalama olmaksızın) havalandırma başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca OsO 4 çözelti içinde bölümleri inkübe ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapak. Tamamen OsO 4 çözümü eklemeden önce bölümleri dümdüz.
    NOT: bölümler çok karanlık ve ri halinegid ve bu adımda aşağıdaki dikkatle manipüle edilmelidir.
  3. osmification sırasında su geçirmez bir epoksi reçinesi hazırlayın.
    1. büyük bir plastik bardağa epoksi reçine karışımı (epoksi reçinesi 20 g, sertleştirici 20 g, hızlandırıcı 0.6 g ve plastikleştirici 0.4 g) her bir bileşenin uygun miktarlarını ekleyin. homojen kahverengi bir renk elde edilene kadar ağaç dalını ya da plastik bir pipet ile karıştırılır.
      NOT: Her bileşenin kesin oranını kullanmak için kritik öneme sahiptir.
    2. Uygun boyutlarda alüminyum bardak eşit miktarlarda transfer, bölümlerin sayısına bağlı olarak işlenecek. o dinlenmeye bırakın.
  4. osmificated bölümler düşük hızlı sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PB 3 kez yıkanır.
  5. 2 dakika her biri için derecelendirilmiştir etanol aşağıdaki dizi bölümleri kurutmak:% 35 etanol içinde 2 kez; 1 saat 50 içinde, her biri 70, 80, 90, ve% 95 etanol; ve% 100 etanol içinde 3 kat.
  6. dehydrati tamamlamak için cam şişe için bölümleri aktarınpropilen oksit içinde 2 dakika boyunca bölümlerini 3 kez inkübe edilerek süreci.
    DİKKAT: Propilen oksit çok uçucu ve toksik organik çözücüdür. Bu temas etmesi halinde veya solunması veya yutulması gözlere veya deride ciddi hasara neden olabilir. Bu bir sınıf 2 kanserojen madde olarak sınıflandırılmıştır. Sadece bir havalandırma başlık altında ve KKD ile kullanılmalıdır. Ayrıca son derece yanıcı ve uzak herhangi bir ısı kaynağından tutulmalıdır.
    Not: propilen oksit, organik bir çözücü madde ve plastik ile uyumlu olduğu Bu aşamadan önce, bölümler dikkatle cam şişelere transfer edilmelidir. Bu noktada, bölümler çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. Bölümler, alternatif olarak 4.5 aşamasından önce cam şişelere transfer edilebilir.
  7. dikkatle Transferi bölümleri, alüminyum bardak birer birer ve mümkün olduğunca hava ile temasını engellemek. Düz gömmek önceden karıştırılmış olan su itici, epoksi reçinesi bölümleri ve VENTIN altında gece boyunca inkübeOda sıcaklığında g başlık.
    NOT: Bu adımda, bölümler tamamen susuz ve çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir.
  8. mineral yağ kullanılarak, yağlanmış plastik lamelleri ile birlikte yağ kaplı cam slaytlar hazırlar.
  9. en 12-15 dakika boyunca 60 ° C de, alüminyum bardak inkübe edilerek reçine yumuşatın. Dikkatle cam slayt yağlanmış tarafında bölümleri düzleştirmek. yağlanmış lamel yerleştirin ve dikkatlice kalan havayı dışarı itmek.
  10. 48 saat boyunca 60 ° C 'de slaytlar inkübe edin.
    NOT: Reçine çok zor olacağından, 48 saat inkübasyon süresi aşmayacak şekilde Bu kritik öneme sahiptir.
  11. plastik lamel çıkarın.

Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanılarak Ultra ince Kesit ve Gözlem 5. Numune Hazırlama

  1. Ilgi bölgeyi bulmak için dürbün kullanın ve bir neşter ile yaklaşık 1 mm 2 küçük dörtgen bir parça kesti.
  2. bir reçine bloğun uç dosya ve qu tutkaladrangular bir parçanın üzerine (Şekil 1C). Tutkal, en azından 1 saat ya da kesit önce gece boyunca kurumaya bırakın.
  3. Bir ultramikrotom kullanılarak, 80 um-kalınlıkta bölümler (Şekil 1D) içine dörtgen parça kesin.
    1. kademeli düz kenarlara sahip bir yamuk oluşturmak için reçine bloğun her tarafı kesilmiş, keskin bir tıraş bıçağı kullanılarak, dikey konumda bir ultramikrotom güverte reçine blok yerleştirin ve.
    2. yatay konumda üst koyun ve trapezoidin uzun kenarı aşağı doğru bakan kadar blok döndürmek.
    3. dörtgen parçanın yüzeyini kesmek için bir elmas kırpma aracı veya bir cam bıçak kullanın. ultramikrotom / s, 1 mm, 300 mikron kalınlığında kesitler kesilmiş olarak ayarlayın. dikey olarak dört köşeli bir parça olarak paralel ve yaklaşık olarak 1 ° 'lik bir çok küçük bir yatay açı göstermek için bıçak ayarlayın.
      NOT: Bu açı hemen hemen b yüzeyine paralel kullanıcı doku yaklaşım sağlayacakimmunolabeled elemanlar bulunabilir olasılığı daha yüksek olduğu, kilitleyin. Elmas kırparak aracıyla bu parametreleri kullanırken, reçine parlak beyaz rengi görüntüler. Doku kesiliyor olduğunda, mor ya da yeşilimsi bir renge dönüşür.
    4. ksilen içinde uçlu emici kağıt bir parça ile üzerinden geçen bölümler arasında pürüzsüz, 80 um kalınlığında kesitler kesmek için damıtılmış su ile dolu bir tekne ile donatılmış bir Ultra 45 ° elmas bıçak kullanarak ve formvar kaplı nikel yuvası ızgaralar ya da seri bölümlerini toplamak çıplak 150 örgü bakır ızgaralar (Şekil 1 E).
  4. bir ızgara, muhafaza kutusu ızgaraları yerleştirin.
  5. kurşun sitrat ile ızgaralar leke.
    1. 1 filtre kurşun sitrat stok çözeltisi çözeltisi ve filtre edilmiş, damıtılmış su: 5 ml şırınga ve bir 1 hazırlanması için bir 0.2 um şırınga filtresi kullanın. Işıktan koruyun.
      NOT: kurşun sitrat stok çözeltisi katı DEPOS oluşumunu önlemek için her ay taze yapılmalıdıronun. Stok tarifi için malzeme bir fiş bakınız. ızgaraları birçok dizi lekeli gerekiyorsa o sütlü hale Buna ek olarak, seyreltilmiş çözelti değiştirin.
    2. çözelti ile temas halinde bölümü ile seyreltilmiş bir çözelti damla üzerine her bir ızgara yerleştirin. 3 dakika süreyle inkübe edin.
    3. ızgara tutmak için küçük cımbız kullanarak ve damıtık su içeren iki kap içinde durulayın.
    4. hafifçe emici kağıt kullanarak fazla su çıkarın. bir ızgara kutusuna ızgaraları saklayın. (Şekil 1F TEM) Transmisyon Elektron Mikroskobu ile bölümleri incelenerek 30 dakika önce bekleyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu bölümde, kimyasal olarak% 3 akrolein karışımı% 4 PFA ile sabitlenmiş immüno primat beyin dokusu, iletim EM seviyesinde, gözlem yapıldıktan sonra elde edildi temsili sonuçları sunulmaktadır. Nispeten sağlam miyelin kılıfının ve çift zarlar (Şekil 2A) düzgün görselleştirme ile gösterildiği gibi, yapısı ile ilgili iyi bir koruma elde etti. Mikro nöronal maddelerle birlikte, sinaptik iletişim bilgileri, kolayca (Şekil 2B) tespit edilebilir. diaminobenzidi...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makalede, insan-olmayan primatlar ve EM örnek incelenmesi için uygun ön gömme immünohistokimya ile transkardiyak perfüzyon için güvenilir bir protokol mevcut. Örneğin CEMOVIS gibi tipik cryo-EM, beyin yapısı ile ilgili iyi bir koruma sağlar, ancak, aynı zamanda, immünohistokimya 12 kullanımını sınırlar. Kriyo-değiştirme ve Tokuyaso tekniği de dahil olmak üzere başka teknikler, immünohistokimya gömme sonrası sağlar, ancak bu teknikler, işlem sırasında gerekli olan ek cihazlara pahalıdır ve zama...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Doğa Bilimleri ve (MP NSERC, 401848-2011) Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. MP Fonds de recherche du Québec-Santé (FRQ-S) bir kariyer ödülünü aldı. LE FRQ-S (FRQ-S 14D 29441) bir doktora burs alıcı oldu. Biz teknik yardım için Marie-Josée Wallman teşekkür ederim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Dibazik susuz sodyum fosfat (Na2HPO<>sub4)Fisher scientificS374-500
Monobazik monohidrat sodyum fosfat (NaH2PO4· H2O)EM ScienceSX0710-1
Sodyum klorür (NaCl)Fisher scientificS271-3
Hidroksimetil aminometan (THAM)Fisher scientificT370-500
HCl EMDHX0603-31 N seyreltme. Ürün aşındırıcıdır. Uygun koruma ile kullanın.
NaOHEMDSX0590-15 N seyreltme. Ürün aşındırıcıdır. Uygun koruma ile kullanın.
Paraformaldehit (PFA)SigmaP6148%4 seyreltme. Ürün toz halinde oldukça uçucudur ve oldukça toksiktir. Uygun korumaya sahip bir havalandırma başlığı altında dikkatli kullanın.
Akrolein (% 90)Sigma110221% 3 seyreltme. Ürün oldukça zehirlidir. Uygun korumaya sahip bir havalandırma başlığının altında kullanın.
Otopsi havalandırma masasıMopecCE400
Elektronik perfüzyon pompasıcole parmermasterflex L/S 7523-90
İğne (perfüzyon)terumo NN-1838R18 G 11/2
İğneterumo NN-2713R21 G 1/2
Ketamin20 mg / kg
Ksilazin4 mg / kg
Asepromazin0.5 mg / kg
Neşter Neşter
bıçaklarıTüy                    mızrak201011                    J9913Ameliyat için No.22 ve EM için No. 11
Cerrahi makas
Rongeurs
VibratomeLeicaVT 1200SCihaz izin verdiğinde bıçağı her kullanımdan önce kalibre edin
Vibratomlu tıraş bıçağıGilletteGIN 642107
GliserolFisher scientificG33-4%30 seyreltme
Etilen glikolFisher scientificE178-4%30 seyreltme
Sodyum borohidrür (NaBH4)SigmaS-9125
Normal at serumu (NHS)Jackson immünoResearch Laboratories008-000-121%2 seyreltme
Soğuk balık jelatiniAurion900.033%0.5 seyreltme. Orijinal ürün %40 konsantrasyonludur
Birincil antikor, SERTSanta Cruz biyoteknolojiSC-14581/500 seyreltme
Birincil antikor, ChATChemicon (Millipore)AB144P1/25 seyreltme
Birincil antikor, THImmunoStar229411/1.000 seyreltme
Biyotinile edilmiş ikincil antikor, keçiVektör laboratuvarlarıBA-95001/1.000 seyreltme
Biyotinile edilmiş ikincil antikor, fareVektör laboratuvarlarıBA-20001/1.000 seyreltme
Vectastain elite ABC kitiVektör laboratuvarlarıPK61008.8 & mikro; A ve B'nin L / mL'sinin her
biri 3,3'-diaminobenzidin (DAB)SigmaD5637% 0.05 seyreltme. Ürün toz halinde oldukça uçucu ve toksiktir. Lavaboya atık atmayın.
Peroksit (H2< / sub>O2< / sub>) %30Fisher scientificH-323%0.005 seyreltme
Osmiyum tetroksit (OsO4)Elektron mikroskobik bilimi% 2 19152
4% 19150
Orijinal çözelti% 2 veya% 4 olabilir. Son %1'lik seyreltmeyi hesaplamak için hangisinin kullanıldığına dikkat edin. Ürün ışığa karşı çok hassastır. Osmiyum oldukça zehirlidir. Yalnızca uygun korumaya sahip bir havalandırma başlığı altında kullanın.
Durcupan su itici epoksi reçineSigmaA: M epoksi reçine (44611)
B: sertleştirici 964 (44612)
C: hızlandırıcı 960 (DY 060) (44613)
D: plastikleştirici (44614) 		58 ° C'de 48 saat polimerize edin; Atıkları atmadan önce C.
Alüminyum bardaklarElektron mikroskobik bilim70048-01
Etanolticari alkoller1019CUygun konsantrasyonda damıtılmış suda seyreltin
Propilen oksitElektron mikroskobik bilim20401Organik çözücü. Son derece uçucu ve toksik. Havalandırma davlumbazının altında kullanın.
Kaplamasız orta cam slaytlarbeyin araştırma laboratuvarları3875-FRMineral yağ ile gres yüzeyi
Plastik film (Aclar gömme filmi)Elektronmikroskobik bilim50425-25Mineral yağ ile gres yüzeyi
UltramikrotomLeica UC7EM UC7
Elmas düzeltme aleti (ultratrim)Diyatom ve nbsp;UT 1081Alternatif olarak cam bıçak kullanabilir Ultra
45&derece; Diatom Elmas bıçakDiatom MC13437bir tekne ile donatılmıştır
XylenesFisher scientificX5SK-4
150 gözenekli bakır ızgaralarElektron mikroskobik bilimG150-cu
ızgara kutusuElektron mikroskobik bilim71138100 ızgaraya kadar saklayabilir
Sodyum sitratAnachemia81983
Kurşun nitratSigmaL-62581.33 'den yapılmış bir kurşun sitrat stok çözeltisi yapın; g kurşun nitrat ve 1.76  42 'de seyreltilmiş g sodyum sitrat; mL önceden kaynatılmış ve soğutulmuş damıtılmış su, buna 8  mL / 1  N NaOH, kurşun nitrattan kurşun sitrata dönüşüm tamamlandıktan sonra eklenir. pH yaklaşık 12 olmalıdır. Solüsyonu hermetik plastik bir şişede saklayın ve ışıktan koruyun.
Şırıngaterumo SS-05L5 mL
Şırınga filtresiCorning4312220.2 ve mikro; m
Emici kağıt (bibulous kağıt)Elektron mikroskobik bilim70086-1
ParafilmLaboratuvar filmiPM-999
Mineral yağSigmaM5904

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Pozzi, P., Gandolfi, D., et al. High-throughput spatial light modulation two-photon microscopy for fast functional imaging. Neurophotonics. 2 (1), 015005(2015).
  2. Zhou, Y., et al. A comparison study of detecting gold nanorods in living cells with confocal reflectance microscopy and two-photon fluorescence microscopy. J. Microsc. 237 (2), 200-207 (2010).
  3. Chao, W., Kim, J., Rekawa, S., Fischer, P., Anderson, E. H. Demonstration of 12 nm resolution Fresnel zone plate lens based soft X-ray microscopy. Opt. Express. 17 (20), 17669-17677 (2009).
  4. Wachulak, P., Bartnik, A., Fiedorowicz, H. A 50 nm spatial resolution EUV imaging-resolution dependence on object thickness and illumination bandwidth. Opt Express. , (2011).
  5. Wachulak, P., et al. A compact "water window" microscope with 60 nm spatial resolution for applications in biology and nanotechnology. Microsc. Microanal. , 1-10 (2015).
  6. Stikov, N., et al. In vivo histology of the myelin g-ratio with magnetic resonance imaging. Neuroimage. 118, 397-405 (2015).
  7. Stikov, N., et al. Quantitative analysis of the myelin g-ratio from electron microscopy images of the macaque corpus callosum. Data Brief. 4, 368-373 (2015).
  8. Mollenhauer, H. H. Artifacts caused by dehydration and epoxy embedding in transmission electron microscopy. Microsc. Res. Tech. 26 (6), 496-512 (1993).
  9. Henderson, R. Realizing the potential of electron cryo-microscopy. Q. Rev. Biophys. 37 (1), 3-13 (2004).
  10. Sander, B., Golas, M. M. Visualization of bionanostructures using transmission electron microscopical techniques. Microsc. Res. Tech. 74 (7), 642-663 (2011).
  11. Ren, G., Rudenko, G., Ludtke, S. J., Deisenhofer, J., Chiu, W., Pownall, H. J. Model of human low-density lipoprotein and bound receptor based on cryoEM. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (3), 1059-1064 (2010).
  12. Webster, P., Schwarz, H., Griffiths, G. Preparation of cells and tissues for immuno EM. Methods Cell Biol. 88, 45-58 (2008).
  13. Kürner, J., Medalia, O., Linaroudis, A. A., Baumeister, W. New insights into the structural organization of eukaryotic and prokaryotic cytoskeletons using cryo-electron tomography. Exp. Cell Res. 301 (1), 38-42 (2004).
  14. Humbel, B. M. Freeze-substitution. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 13, 319-341 (2009).
  15. Stierhof, Y., Humbel, B. M., van Donselaar, E., Schwarz, H. Cryo-fixation, freeze-substitution rehydration and Tokuyaso cryo-sectioning. Handbook of cryo-preparation methods for electron microscopy. 14, 344-365 (2009).
  16. Leranth, C., Pickel, M. V. Electron microscopic pre-embedding double-immunohistochemical methods. Neuroanatomical tract-tracing methods 2. , 129-172 (1989).
  17. Luft, J. H. The use of acrolein as a fixative for light and electron microscopy. Anat. Rec. 133, 305-305 (1959).
  18. Saito, T., Keino, H. Acrolein as a fixative for enzyme cytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 24 (12), 1258-1269 (1976).
  19. King, J. C., Lechan, R. M., Kugel, G., Anthony, E. L. Acrolein: a fixative for immunocytochemical localization of peptides in the central nervous system. J. Histochem. Cytochem. 31 (1), 62-68 (1983).
  20. Sabatini, D. D., Bensch, K., Barrnett, R. J. Cytochemistry and electron microscopy. The preservation of cellular ultrastructure and enzymatic activity by aldehyde fixation. J. Cell Biol. 17, 19-58 (1963).
  21. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: I. Preservation with aldehyde perfusates versus direct perfusion with osmium tetroxide with special reference to membranes and the extracellular space. J. Ultrastruct. Res. 12, 160-186 (1965).
  22. Sesack, S. R., Pickel, V. M. Dual ultrastructural localization of enkephalin and tyrosine hydroxylase immunoreactivity in the rat ventral tegmental area: multiple substrates for opiate-dopamine interactions. J. Neurosci. 12 (4), 1335-1350 (1992).
  23. Mathai, A., Ma, Y., Paré, J., Villalba, R. M., Wichmann, T., Smith, Y. Reduced cortical innervation of the subthalamic nucleus in MPTP-treated parkinsonian monkeys. Brain. 138 (4), 946-962 (2015).
  24. Villalba, R. M., Paré, J., Smith, Y. Three-dimensional electron microscopy imaging of spines in non-human primates. Transmission electron microscopy methods for understanding the brain. 115, 81-103 (2016).
  25. Eid, L., Champigny, M., Parent, A., Parent, M. Quantitative and ultrastructural study of serotonin innervation of the globus pallidus in squirrel monkeys. Eur. J. Neurosci. 37 (10), 1659-1668 (2013).
  26. Eid, L., Parent, A., Parent, M. Asynaptic feature and heterogeneous distribution of the cholinergic innervation of the globus pallidus in primates. Brain Struct. Funct. 221, 1139-1155 (2016).
  27. Eid, L., Parent, M. Morphological evidence for dopamine interactions with pallidal neurons in primates. Front. Neuroanat. 9, 111-114 (2015).
  28. McDonald, K. High-pressure freezing for preservation of high resolution fine structure and antigenicity for immunolabeling. Methods Mol. Biol. 117, 77-97 (1999).
  29. Gilkey, J., Staehelin, L. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. J. Electron Microsc. Tech. 3, 177-210 (1986).
  30. Korogod, N., Petersen, C. C. H., Knott, G. W. Ultrastructural analysis of adult mouse neocortex comparing aldehyde perfusion with cryo fixation. eLife. 4, (2015).
  31. Karlsson, U., Schultz, R. Fixation of the central nervous system for electron microscopy by aldehyde perfusion: III. Structural changes after exsanguination and delayed perfusion. J. Ultrastruct. Res. 14, 47-63 (1966).
  32. Schultz, R. L., Maynard, E. A., Pease, D. C. Electron microscopy of neurons and neuroglia of cerebral cortex and corpus callosum. Am. J. Anat. 100 (3), 369-407 (1957).
  33. Gocht, A. Use of LR white resin for post-embedding immunolabelling of brain tissue. Acta Anat. (Basel). 145 (4), 327-339 (1992).
  34. Eldred, W. D., Zucker, C., Karten, H. J., Yazulla, S. Comparison of fixation and penetration enhancement techniques for use in ultrastructural immunocytochemistry. J. Histochem. Cytochem. 31 (2), 285-292 (1983).
  35. Manocha, S. L. Effect of glutaraldehyde fixation on the localization of various oxidative and hydrolytic enzymes in the brain of rhesus monkey, Macaca mulatta. Histochem. J. 2 (3), 249-260 (1970).
  36. Mrini, A., Moukhles, H., Jacomy, H., Bosler, O., Doucet, G. Efficient immunodetection of various protein antigens in glutaraldehyde-fixed brain tissue. J. Histochem. Cytochem. 43 (12), 1285-1291 (1995).
  37. Storm-Mathisen, J., Ottersen, O. P. Immunocytochemistry of glutamate at the synaptic level. J. Histochem. Cytochem. 38 (12), 1733-1743 (1990).
  38. Hwang, S. J., Rustioni, A., Valtschanoff, J. G. Kainate receptors in primary afferents to the rat gracile nucleus. Neurosci. Lett. 312 (3), 137-140 (2001).
  39. Palay, S. L., McGee-Russeel, S. M., Gordon, S. Jr, Grillo, M. A. Fixation of neural tissues for electron microscopy by perfusion with solutions of osmium tetroxide. J. Cell Biol. 12, 385-410 (1962).
  40. Corthell, J. Chapter 9, Perfusion and Immersion Fixation. Basic Molecular Protocols in Neuroscience: Tips, Tricks, and Pitfalls. , 1st ed, Academic Press. 83-90 (2014).
  41. Helander, K. G. Formaldehyde prepared from paraformaldehyde is stable. Biotech. Histochem. 75 (1), 19-22 (2000).
  42. van Harreveld, A., Khattab, F. I. Perfusion fixation with glutaraldehyde and post-fixation with osmium tetroxide for electron microscopy. J. Cell. Sci. 3 (4), 579-594 (1968).
  43. Renno, W. M. Post-embedding double-gold labeling immunoelectron microscopic co-localization of neurotransmitters in the rat brain. Med. Sci. Monit. 7 (2), 188-200 (2001).
  44. Ellisman, M. H., Deerinck, T. J., Shu, X., Sosinsky, G. E. Picking Faces out of a Crowd: Genetic Labels for Identification of Proteins in Correlated Light and Electron Microscopy Imaging. Methods Cell Biol. 111, 139-155 (2012).
  45. Labrecque, S., et al. Hyperspectral multiplex single-particle tracking of different receptor subtypes labeled with quantum dots in live neurons. J. Biomed. Opt. 21 (4), 046008(2016).
  46. Bailey, R., Smith, A., Nie, S. Quantum dots in biology and medicine. Physica E Low Dimens. Syst. Nanostruct. 25 (1), 1-12 (2004).
  47. Perkovic, M., et al. Correlative light- and electron microscopy with chemical tags. J. Struct. Biol. 186 (2), 205-213 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Acrolein FixationTissue SectioningAntibody IncubationDAB StainingOsmium TetroxideEpoxy Resin EmbeddingUltramicrotomy

İlgili makaleler