İmmünohistokimya ve elektron mikroskobu Ön gömme için İnsan Olmayan Primat Beyin Dokusu Hazırlanması

Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Işık mikroskopisi, ^2, diğer şeylerin ¹ arasında vivo nöronal süreçlerde okuyan için etkin bir araç olduğunu kanıtlamıştır. Işık Mikroskobik (LM) seviyesinde tipik uzamsal çözünürlük gibi aşırı ultraviyole ve yumuşak X-ışını mikroskopi için farklı ışık kaynaklarını kullanarak yaklaşık 200 nm, son zamanlardaki teknolojik ilerlemeler olmasına rağmen, özellikle bir, yaklaşık 10 nm uzaysal çözünürlük ^3, bu çözünürlük artmıştır ^{, 4, 5.} Görüntülemede Diğer teknolojik gelişmeler histoloji ile manyetik rezonans görüntüleme birleştirildi ve in vivo olarak miyelin kılıfının sadece Elektron Mikroskobik (EM) seviyesi ^{6, 7,} geleneksel olarak ölçülebildiği bir parametre kalınlığının ölçülmesi için yeni bir yöntem sağlamaktır içerir. AlthouGH LM seviyesinde bu gelişmeler, örneğin, sinaptik temasların olarak yaşayan işlemleri, yapıları detaylı bir görünümünü ve karakterizasyon incelenmesi için mükemmel bir araç sağlar, 0.5 nm ulaşabilir çözünürlüğe sahip EM ile elde edilebilir. Bununla birlikte, EM seviyesinde gözlem hücre mimarisini korumak amacıyla, kimyasal tespit ve dehidrasyon işlemleri ile, bazı açılardan, ölü ve değiştirilmiş olduğu numuneler gerektirir. Bu nedenle, yüksek çözünürlükte biyolojik örneklerinin incelenmesi bağlı radyasyon elektron ışını hasar, düşük kontrast, membranların yapısal sapma, ya da ^{8, 9, 10} gömme aşağıdaki dehidrasyon ve epoksi oluşabilir eserler da varlığına zor olabilir.

Yapısal analiz için kendi doğal biçiminde numuneler koruma "Vitrifiye Kısımların Krio-EM" kullanılarak veya CEMOVIS bir kesit bir yaklaşım ile elde edilebilirhızlı dondurma ve camsı buz numune yerleştirme ve bir kriyojenik sıcaklık ^{11, 12} EM bölümü altında incelenmesi ile. Onlar hala sağlam ve tam sulu iken Bu prosedür böylece dehidrasyon nedeniyle eserler ortadan kaldırarak ¹³ işlediğinde, numunelerin incelenmesi için izin verir. Bununla birlikte, bu yöntem, önemli ek harcamalar, çok düşük sıcaklıklarda, bu gözlem olanak sağlamak amacıyla, kriyo-ultramikrotom için ilave cihazlar, hem de standart EM ek aygıtları kapsamaktadır. Buna ek olarak, CEMOVIS yaklaşım antikorlar genellikle oda sıcaklığında inkübe edilmesi gerekir, çünkü teknikleri ile immün kullanımını engeller. Seçenek olarak ise, kriyo-koruyucu kimyasal immerged ve inci ise cryo sabit Numuneler çözülür sırasında dondurularak ikame yaklaşım kullanılarak immünohistokimyasal prosedürlere ultrastrüktürel analiz birleştirmek mümkündürtr Böyle Lowicryls gibi özel reçineler, gömülü. Post-gömme immunolabeling sonra böyle materyal ¹² üzerinde gerçekleştirilebilir. Ancak, dondurularak ikamesi ve cryo-sabitleme teknikleri zaman alıcıdır. Bunlar, ilave donanım takılmasını gerektirir ve düşük bir sıcaklıkta ^{14, 15} kullanımına rağmen, bir organik çözücü ve hücre mimarisini değiştirebilir kimyasal sabitleyici maruz kalması örnekleri gerektirir. Bu nedenle, özellikle akrolein LM ve EM DÜZEYİ, beyin dokusunun kimyasal sabitleme, her ikisi de tüm teknolojik ilerlemelere rağmen, EM ¹⁶ immünohistokimya birleştirmek için bir düşük maliyetli ve zaman tasarrufu sağlayan bir yöntem olmaya devam etmektedir.

Son birkaç on yılda, birçok girişimde iyi doku korunmasını sağlayan aldehitlerin karışımı bulmak için yapılmıştır. 1960'lardan önce, EM için kabul edilebilir sonuçlar vermiştir sadece kimyasal sabitleyici ozmiyum tetroksit oldu. Bununla birlikte, ozmiyum tetroksit beyin gibi organları düzeltmek için damar sistemi aracılığıyla kullanımını engelleyen, son derece zehirli ve pahalıdır. Akrolein hücresel yapıların ¹⁷ EM, gözlem için uygun hayvan doku koruması için güvenilir bir yöntem olarak 1950'lerin sonlarında tanıtıldı. Bu daha derin doku nüfuz eder ve daldırma ile fiksasyonu için ve doku ¹⁷ minimum çekme sitoplazmik bileşenlerin iyi bir koruma sağlar, diğer aldehitler daha hızlı bir şekilde tepki verir. Bu tür enzimler ve diğer proteinleri ¹⁸ gibi moleküler bileşiklerin, canlı daha doğru bir lokalizasyonu ile, taze doku kullanıldığında Böyle bir özellik akrolein fiksasyon başka aldehitlerle üzerinde açık bir avantaj sağlar. Gerçekten de, bu etkin bir stabilitesine sahip olarak, Kurbağa ve kemirgenler de dahil olmak üzere pek çok türde, EM seviyesinde görselleştirme için fiksasyon kolay, verimli ve düşük maliyetli bir yöntem olarak yıl boyunca doğrulanmıştırzes peptidler ve proteinler, antijenitesini muhafaza eden ve ^{16, 18, 19, 20, 21} tespit maddesi bir aldehit ile kombinasyon halinde kullanıldığı zaman nispeten sağlam ultrastrüktürel sağlar. Kemirgenlerde akrolein tespit için protokoller o zamandan beri standardize edilmiş ve EM ^{16, 22} için çift immunolabeling uygulamak, özellikle Pickel grup tarafından, yoğun kullandık. Birkaç grupları insan olmayan primat beyin dokusunda ²³ akrolein fiksasyonunu kullandık. Ancak, bildiğimiz kadarıyla, verimli EM ²⁴ immunolabeling uyumlu insan olmayan primatlarda akrolein ile kimyasal fiksasyonunu açıklayan tek yayınlanmış protokol vardır.

Bu makalede, verimli kimyasal olarak uğultu düzeltmek için kolay ve güvenilir bir yöntem sağlamaktırile immün ve iletim EM inceleme öncesi gömme birlikte, potansiyel olarak uzun süreli korunması için izin akrolein bir primat beyinler.

Etik Beyanı: hayvanların yer aldığı tüm protokoller Comité de Koruma des Animaux de l'Université Laval tarafından onaylandı ve Deney Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı (Ed 2.) Hayvan Bakımı Kılavuzu Kanada Konseyi çerçevesinde yapılmıştır. Burada açıklanan protokol yaklaşık 800 g yetişkin hayvanlar için optimize edildi. sabitleştirici hacimleri hayvanın büyüklüğüne göre ayarlanmalıdır.

Transkardiyak perfüzyon için Çözümler hazırlanması 1.

1. aşağıdaki aşamalara göre bir 50 mM sodyum fosfat-tamponlu salin (PBS) çözeltisi 1 L'lik hazırlayın. perfüzyon önce en çok 24 saattir çözeltisi hazırlayın ve kullanılana kadar 4 ° C 'de devam edin.
   1. 1 L'lik bir şişeye damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 5.87 g ekleme _(Na2 HPO _4), monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 1.20 g _{(NaH2 4} · _H2O) ve 9 grsodyum klorür (NaCI). çözülmeye karıştırınız.
   2. 5 N NaOH eklenerek pH 7.4'e ayarlanmıştır. 1 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle
      DİKKAT: NaOH aşındırıcı kimyasal bileşiktir. Uygun Kişisel Koruyucu Ekipman Wear (PPE;. Laboratuvar mont, eldiven, koruyucu gözlük, vs).
2. aşağıdaki adımlara uygun olarak% 4 paraformaldehit (PFA) 2 L hazırlayın. Bu çözelti, ameliyattan önce en fazla 24 saat hazırlandı ve kullanılana kadar 4 ° C 'de tutulması gerekmektedir.
   1. 2 L'lik bir kap içerisinde damıtılmış su, 1.5 L ölçülür. Dibazik susuz sodyum fosfat 23.48 g _(Na2 HPO ₄₎ ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 4.80 g ekleme _{(NaH2 4} · _H2O). çözülmeye karıştırınız. 2 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle
   2. 55 ° C - sıcaklık yaklaşık 45 ulaşıncaya kadar bir havalandırma başlık altında çözelti ısıtılır. 60 ° C'ye kadar ısıtın vermeyin.
   3. Yavaş yavaş çözeltiye PFA 80 g ekleyin ve tümüyle çözülene kadar karıştırın (yaklaşık 30-60 dakika). 60 ° C'nin altında tutmaya sıcaklığının kontrolü tutun.
      DİKKAT: PFA olarak toz formunda çok uçucudur. Gözler veya deri ile teması halinde çok zehirlidir ve solunum veya sindirim durumunda tehlikelidir. PPE Aşınma ve bir havalandırma başlık altında dikkatli bir şekilde kullanın.
   4. 4 ° C ve filtreye çözeltiyi soğutun. 4 ° C'de saklayın.
3. aşağıdaki adımlara uygun olarak 0.1 M fosfat tampon (PB) içinde% 3 akrolein 1 L hazırlayın. PB solüsyon, perfüzyon en fazla 24 saat hazırlanmalıdır.
   DİKKAT: Acrolein teneffüs ve acil hasar meydana getirebilmektedir son derece toksiktir. Eğer deri yoluyla absorbe Ayrıca aşındırıcı ve son derece toksiktir. Bu kanserojen ve mutajen olduğunu. Uygun PPE giyin ve bir havalandırma başlık altında kullanın.
   1. damıtılmış suyun 800 mL ölçün. Dibazik susuz sodyum fosfat 8.66 g ekleme _(Na2 4) ve monobazik sodyum fosfat monohidrat ve 5.38 g _{(NaH2 4} · _H2O). Bütün tuzlar eriyene kadar karıştırın. 4 ° C'de çözüm tutun 1 L'lik bir toplam hacme ulaşmak için saf su ekle.
   2. Ameliyat öncesi 1 L'lik bir cam kaba PB çözeltisinden 900 mL kadar transferi ve bir havalandırma başlık altında% 97 akrolein çözeltisi 30.94 ml. 1 L ilave edin ve karıştırın toplam hacme ulaşmak için PB solüsyonu ekleyin. çözüm Filtre ve 4 ° C'de saklayın.

2. transcardiac Perfüzyon ve Beyin Diseksiyon

1. bütün cerrahi prosedür sırasında buz üzerinde çözüm tutun. (50 mM PBS) ve bir hava hortumu kalana kadar pompayı dönüm kullanılacak ilk çözelti içinde tüp yerleştirilmesi pompayı hazırlayın. bir makak maymunu transkardiyak perfüzyon için, bir 21 G iğne kullanımı ve çıkış yaklaşık 80 mL / dak ayarlayın.
2. bir karışımı içeren bir intramüsküler enjeksiyon ile anestezi hayvanketamin (20 mg / kg), ksilazin (4 mg / kg) ve asepromazin (/ kg, 0.5 mg) Ture. izofluran (% 3) sedasyon altında hayvan bakımı.
3. Bir havalandırma masaya hayvanın uzuvları takın.
4. bir neşter ile, koltukaltı cilt kadar kaldırın. Karın kasları kesin. dikkatle hayati organlara kaçınarak yanal kaburga kesmek için ağır cerrahi makas kullanın.
5. Cerrahi makas ile diyafram kesip kalp açığa çıkarmak için göğüs kafesi yükseltmek. diyafram kesildiğinde kalp dakika içinde dayak durdurulmayacağından, hızla devam edin.
6. Bir neşter bıçağı ile perikard çıkarın ve sol ventrikül içine iğne takın. bir neşter ile, dikkatlice sağ atriyuma küçük eksizyonu olun. Hızlı bir şekilde 72 ml / dakika pompayı çalıştırmak ve iğneyi yerinde tutun. Mümkünse, kalp daha düşük düzeyde başını sahip olmak için hayvan yatırın.
   NOT: İğneyi eklerken interventriküler septumu delmek için dikkatli olun.
   1. rinsakciğer kadar PBS yaklaşık 300 mL 'si ile, e Kan, beyaz ve kan sağ atriyum gelir.
7. hızlı, pompa durdurma% 3 akrolein çözeltisine hortumu / tüp transferi ve tekrar pompayı çalıştırın. Kalp atışını durduktan sonra yavaş yavaş 80 ml / dk pompalama hızını artırmak. akrolein çözeltisi yaklaşık 500 ml serpmek.
8. hızlı, pompayı durdurun% 4 PFA çözüm hortumu aktarmak ve tekrar pompayı başlatın. Bu adım, PFA, yaklaşık 1 L gerektirir.
   NOT: ön ayaklar bükülmezdir ve boyun sert olduğu zaman tespit tamamlanır.
9. kafasını kesip dikkatlice kafatasının dışında beyin teşrih. cerrahi aletlerle beyin zarar vermemeye özen gösterin. Beyin, uçuk (kan eser) ve katı (Şekil 1A) olduğu zaman perfüzyon en uygunudur.
10. 4 ° C'de 1 saat süresince% 4 PFA içinde sağlam beyin bırakın.
11. Seri olarak bir soğutma vibratome (4 ° C) ile beyin kesilmişve 50 um kalınlıkta bölümler halinde istenilen düzlemde PBS (0.1 M) (Şekil 1B) bunları toplamak.
    NOT: Bu adım, istenen protokole göre birçok yönden yapılabilir. Yarıküreleri kesme, ya da muhafaza bütün vibratome önce ayrılabilir. Beyin vibratome platformu için çok büyükse, daha küçük bloklar halinde kesilebilir. Bu aşamadan sonra, bölümler% 40 PB (50 mM),% 30 gliserol ve% 30 etilen glikol yapılmış bir antifriz solüsyonu içinde -30 ° C de, uzun bir süre boyunca saklanabilir.

3. İmünohistokimya Ön gömme (Şekil 1C)

1. aşağıdaki gibi Tris-tamponlu salin içinde bir 4 L'lik bir stok çözeltisi (TBS, 50 mM, pH 7.6) hazırlayın.
   1. , 4 L'lik bir beher içinde damıtılmış su 2L ölçün trihidroksimetil aminometan ve 24.23 g ekleyin (THAM C _{4H 11} NO ₃₎ ve bir karıştırma çözülmesi için.
   2. 1 N HCI, yaklaşık 148 mL 'si ile 7.6 arasında pH ayarlayın. asit cauti ile eklenmelidirile 7.6 altındaki bir pH değerine ulaşılana önlemek için. Toplam hacim olmalıdır 4 L
      DİKKAT: HCl aşındırıcı etkisi. Uygun PPE giyin.
2. ilgi alanı ihtiva eden (aşama 2.11) bölümleri seçin EM imünohistokimya için işlenecek.
3. antifriz solüsyonu durulama, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde serbest yüzen bölümler 3x (0.1 M, pH 7.4) yıkanır.
4. PBS içinde seyreltilmiş _NaBH4 bir% 0.5 çözelti hazırlayın.
   1. _NaBH4 0.05 g tartın ve 10 ml PBS içinde seyreltin. Kapatma. Kullanımdan hemen önce bu çözelti hazırlayın.
5. Oda sıcaklığında 30 dakika için taze hazırlanmış _NaBH4 çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın. Kapatma.
6. Oda sıcaklığında 10 dakika süreyle PBS içinde yıkama 3x, reaksiyon gazının hiçbiri kadar kuvvetli bir şekilde sallanan kalır.
7. % 2 göre normal serum ve PBS içinde sulandırılmış% 0.5 soğuk balık jelatininin EM için bloke edici bir çözelti hazırlayın.
   NOT: Miktar shouliçin hesaplanır d Aşağıdaki üç adım için yeterli olması. ikincil antikor barındıran aynı hayvan türlerinden oluşan bir serum kullanın. bu yöntemler, önemli ölçüde doku kalitesini tehlikeye antijen alma yöntemleri ya da Triton az miktarda ilave kullanımını önlemek, (antikorlar penetrasyonunu artırmak için).
8. Oda sıcaklığında 1 st için bloke edici çözelti içinde bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
9. bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş primer antikor çözeltisi hazırlayın.
   Not: Primer antikor konsantrasyonu, genel olarak LM immünohistokimya ile aynıdır, ancak bazı birincil antikorlar akrolein çalışmayabilir olarak, daha önce farklı bir antikor konsantrasyonları ile testler düşünün. (-% 2 0.1) ve transkardiyak perfüzyon için% 4 PFA ve benzer sonuçlar elde Eğer öyleyse, o glutaraldehit bir karışımını kullanmak da mümkündür. inkübasyon süresinin ve sıcaklığın yanı sıra duruma getirin.
10. Primer antikor solüsyonu içinde bölümleri inkübegece boyunca hafifçe çalkalanarak ilave edilir. önceden test edilmiş inkübasyon süresi ve sıcaklığı kullanın.
11. hafif sallama ile oda sıcaklığında 5 dakika boyunca PBS içinde bölümleri 3 kez yıkanır.
12. bloke edici çözelti içinde seyreltilmiş biyotinlenmiş sekonder antikor 1000 çözeltisi: Bir 1 hazırlayın.
    NOT: ikincil antikor birincil bir antikor üretmek için kullanılan konakçı türlerine karşı yükseltilmelidir.
13. Oda sıcaklığında 1.5 saat için ikincil antikor çözeltisinin bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
14. en az 60 dakika önce ikincil antikor inkübasyonun sonunda bir avidin-biyotin-peroksidaz (ABC) çözeltisi hazırlayın.
    1. A ve B solüsyonlarının 8.80 uL / ​​mL ölçmek ve PBS içinde seyreltilmesi, kalibre edilmiş bir pipet kullanın.
    2. avidin ve biyotin molekülleri arasındaki bağlanma tamamlaması izin vermek için oda sıcaklığında en az 60 dakika boyunca hafif sallayın.
15. İkincil antikor çözeltisi içinde inkübe edildikten sonra, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PBS içinde 3 kez yıkanır.
16. böylece ABC bölümleri inkübeOda sıcaklığında 1 saat boyunca Devriminin. hafifçe sallayın.
17. hafif sallama ile oda sıcaklığında 10 dakika süre ile TBS içinde bir kez PBS ile iki kez yıkanır.
18. TBS içinde seyreltilmiş% 0.005 _{H2O 2%} 0.05 3,3'-diaminobenzidin (DAB), taze bir çözelti hazırlayın.
    1. DAB 12.5 mg tartılır ve soğuk TBS 25 mL seyreltik. Işıktan koruyunuz.
       DİKKAT: Solunması DAB tozu çok uçucu ve zararlıdır. Bu karsinojenik ve teratojenik olduğunu. seyreltilmiş Dolayısıyla, hamile veya emziren kadınlar bile, bu ürünü manipüle olmamalıdır. işlenirken bir N95 maskesi kullanın ve PPE giyerler.
    2. Çözelti süzülür ve kullanımdan hemen önce,% 30 _{H2O 2} 4.5 uL ekleyin.
19. Oda sıcaklığında 3 dakika ila 7 DAB çözeltisi bölümleri inkübe edin. hafifçe sallayın.
    NOT: kahverengi çökelti arka plan boyama yüksek düzeyde önlemek için çok karanlık olmamalıdır. İnkübasyon süresi buna göre optimize edilmelidir.
20. hızla iki kez yıkayarak reaksiyonu durdurunSoğuk TBS içinde, daha sonra iki kez oda sıcaklığında, soğuk TBS içinde 10 dakika kadar hafif bir sallama ile PB iki kez 10 dakika, ardından.
    Not: PB (olup PBS) kullanımı, osmiyum ve form kristalleri ile tepkimeye gibi, NaCI izlerini ortadan kaldırmak için kritiktir.

Elektron Mikroskobik Gözlem 4. Osmification ve katıştırma

1. PB içerisinde seyreltilmiş,% 1 ozmiyum tetroksit çözeltisi (OsO ₄₎ hazırlanması. Işıktan koruyunuz.
   DİKKAT: Osmiyum çok zehirlidir ve deri, gözler ve ağız ile temas etmemelidir ve teneffüs edilmemelidir. Şayet yutulursa ölüme neden olabilir. Sadece bir havalandırma başlık altında ve uygun KKD ile kullanılmalıdır.
2. (Çalkalama olmaksızın) havalandırma başlık altında oda sıcaklığında 30 dakika boyunca OsO ₄ çözelti içinde bölümleri inkübe ve ışıktan korumak için alüminyum folyo ile kapak. Tamamen OsO ₄ çözümü eklemeden önce bölümleri dümdüz.
   NOT: bölümler çok karanlık ve ri halinegid ve bu adımda aşağıdaki dikkatle manipüle edilmelidir.
3. osmification sırasında su geçirmez bir epoksi reçinesi hazırlayın.
   1. büyük bir plastik bardağa epoksi reçine karışımı (epoksi reçinesi 20 g, sertleştirici 20 g, hızlandırıcı 0.6 g ve plastikleştirici 0.4 g) her bir bileşenin uygun miktarlarını ekleyin. homojen kahverengi bir renk elde edilene kadar ağaç dalını ya da plastik bir pipet ile karıştırılır.
      NOT: Her bileşenin kesin oranını kullanmak için kritik öneme sahiptir.
   2. Uygun boyutlarda alüminyum bardak eşit miktarlarda transfer, bölümlerin sayısına bağlı olarak işlenecek. o dinlenmeye bırakın.
4. osmificated bölümler düşük hızlı sallanarak, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca PB 3 kez yıkanır.
5. 2 dakika her biri için derecelendirilmiştir etanol aşağıdaki dizi bölümleri kurutmak:% 35 etanol içinde 2 kez; 1 saat 50 içinde, her biri 70, 80, 90, ve% 95 etanol; ve% 100 etanol içinde 3 kat.
6. dehydrati tamamlamak için cam şişe için bölümleri aktarınpropilen oksit içinde 2 dakika boyunca bölümlerini 3 kez inkübe edilerek süreci.
   DİKKAT: Propilen oksit çok uçucu ve toksik organik çözücüdür. Bu temas etmesi halinde veya solunması veya yutulması gözlere veya deride ciddi hasara neden olabilir. Bu bir sınıf 2 kanserojen madde olarak sınıflandırılmıştır. Sadece bir havalandırma başlık altında ve KKD ile kullanılmalıdır. Ayrıca son derece yanıcı ve uzak herhangi bir ısı kaynağından tutulmalıdır.
   Not: propilen oksit, organik bir çözücü madde ve plastik ile uyumlu olduğu Bu aşamadan önce, bölümler dikkatle cam şişelere transfer edilmelidir. Bu noktada, bölümler çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir. Bölümler, alternatif olarak 4.5 aşamasından önce cam şişelere transfer edilebilir.
7. dikkatle Transferi bölümleri, alüminyum bardak birer birer ve mümkün olduğunca hava ile temasını engellemek. Düz gömmek önceden karıştırılmış olan su itici, epoksi reçinesi bölümleri ve VENTIN altında gece boyunca inkübeOda sıcaklığında g başlık.
   NOT: Bu adımda, bölümler tamamen susuz ve çok kırılgandır ve özenle manipüle edilmelidir.
8. mineral yağ kullanılarak, yağlanmış plastik lamelleri ile birlikte yağ kaplı cam slaytlar hazırlar.
9. en 12-15 dakika boyunca 60 ° C de, alüminyum bardak inkübe edilerek reçine yumuşatın. Dikkatle cam slayt yağlanmış tarafında bölümleri düzleştirmek. yağlanmış lamel yerleştirin ve dikkatlice kalan havayı dışarı itmek.
10. 48 saat boyunca 60 ° C 'de slaytlar inkübe edin.
    NOT: Reçine çok zor olacağından, 48 saat inkübasyon süresi aşmayacak şekilde Bu kritik öneme sahiptir.
11. plastik lamel çıkarın.

Geçirimli Elektron Mikroskobu kullanılarak Ultra ince Kesit ve Gözlem 5. Numune Hazırlama

1. Ilgi bölgeyi bulmak için dürbün kullanın ve bir neşter ile yaklaşık 1 mm ² küçük dörtgen bir parça kesti.
2. bir reçine bloğun uç dosya ve qu tutkaladrangular bir parçanın üzerine (Şekil 1C). Tutkal, en azından 1 saat ya da kesit önce gece boyunca kurumaya bırakın.
3. Bir ultramikrotom kullanılarak, 80 um-kalınlıkta bölümler (Şekil 1D) içine dörtgen parça kesin.
   1. kademeli düz kenarlara sahip bir yamuk oluşturmak için reçine bloğun her tarafı kesilmiş, keskin bir tıraş bıçağı kullanılarak, dikey konumda bir ultramikrotom güverte reçine blok yerleştirin ve.
   2. yatay konumda üst koyun ve trapezoidin uzun kenarı aşağı doğru bakan kadar blok döndürmek.
   3. dörtgen parçanın yüzeyini kesmek için bir elmas kırpma aracı veya bir cam bıçak kullanın. ultramikrotom / s, 1 mm, 300 mikron kalınlığında kesitler kesilmiş olarak ayarlayın. dikey olarak dört köşeli bir parça olarak paralel ve yaklaşık olarak 1 ° 'lik bir çok küçük bir yatay açı göstermek için bıçak ayarlayın.
      NOT: Bu açı hemen hemen b yüzeyine paralel kullanıcı doku yaklaşım sağlayacakimmunolabeled elemanlar bulunabilir olasılığı daha yüksek olduğu, kilitleyin. Elmas kırparak aracıyla bu parametreleri kullanırken, reçine parlak beyaz rengi görüntüler. Doku kesiliyor olduğunda, mor ya da yeşilimsi bir renge dönüşür.
   4. ksilen içinde uçlu emici kağıt bir parça ile üzerinden geçen bölümler arasında pürüzsüz, 80 um kalınlığında kesitler kesmek için damıtılmış su ile dolu bir tekne ile donatılmış bir Ultra 45 ° elmas bıçak kullanarak ve formvar kaplı nikel yuvası ızgaralar ya da seri bölümlerini toplamak çıplak 150 örgü bakır ızgaralar (Şekil 1 E).
4. bir ızgara, muhafaza kutusu ızgaraları yerleştirin.
5. kurşun sitrat ile ızgaralar leke.
   1. 1 filtre kurşun sitrat stok çözeltisi çözeltisi ve filtre edilmiş, damıtılmış su: 5 ml şırınga ve bir 1 hazırlanması için bir 0.2 um şırınga filtresi kullanın. Işıktan koruyun.
      NOT: kurşun sitrat stok çözeltisi katı DEPOS oluşumunu önlemek için her ay taze yapılmalıdıronun. Stok tarifi için malzeme bir fiş bakınız. ızgaraları birçok dizi lekeli gerekiyorsa o sütlü hale Buna ek olarak, seyreltilmiş çözelti değiştirin.
   2. çözelti ile temas halinde bölümü ile seyreltilmiş bir çözelti damla üzerine her bir ızgara yerleştirin. 3 dakika süreyle inkübe edin.
   3. ızgara tutmak için küçük cımbız kullanarak ve damıtık su içeren iki kap içinde durulayın.
   4. hafifçe emici kağıt kullanarak fazla su çıkarın. bir ızgara kutusuna ızgaraları saklayın. (Şekil 1F TEM) Transmisyon Elektron Mikroskobu ile bölümleri incelenerek 30 dakika önce bekleyin.

Bu bölümde, kimyasal olarak% 3 akrolein karışımı% 4 PFA ile sabitlenmiş immüno primat beyin dokusu, iletim EM seviyesinde, gözlem yapıldıktan sonra elde edildi temsili sonuçları sunulmaktadır. Nispeten sağlam miyelin kılıfının ve çift zarlar (Şekil 2A) düzgün görselleştirme ile gösterildiği gibi, yapısı ile ilgili iyi bir koruma elde etti. Mikro nöronal maddelerle birlikte, sinaptik iletişim bilgileri, kolayca (Şekil 2B) tespit edilebilir. diaminobenzidin (DAB) ile etiketlenmiş immünoçökeltme Nöronal elemanları, dolgulu sitoplazma veya axoplasm ile EM seviyede tanınır. Plazma membranı ve organellerin dış yüzeyi ayrıca, tipik olarak elektron-yoğun bir çökelti (Şekil 3) ile kaplanmıştır.

Bu özel deneyde, antikorlar aga kullanılanDış (GPe) veya sincap maymunu Globus pallidus (Şekil 3) iç (GPI) segmentinde imüno nöronal elemanları görselleştirmek için serotonin taşıyıcısını (SERT), kolin asetiltransferazı (ChAT) ya da tirosin hidroksilaz (TH) inst. Bunu yapmak için, biz detaylı morfolojik soruşturma izin ultrastrüktürdeki yanı sıra antijeniteyi korumak fiksatif kimyasalların bir arada kullanılmıştır. Birçok antikorlar yukarıda açıklanan transcardiac perfüzyon protokolü ile kullanılabilse de, bazı primer antikorlar akrolein tespitle optimum immunolabeling vermemeyi bilinmektedir beri kullanıcılar, önceden optimizasyon konsantrasyon testleri önerilir. antikorlar, akrolein tespit optimal ile immün sağlamayan Alternatif olarak, 0.1 bir seyreltme -% 4,% 2 gluteraldehit PFA ile transkardiyak perfüzyon şeklinde kullanılabilir. Birçok için korunmuş antıjenıkliğı akrolein tespit edilmiş olan beyin doku nispeten eşdeğer dokusu kalitesi sağlarantikorları (Şekil 4).

Son olarak, uygunsuz manipülasyonlar takip edilerek elde edilen EM fotomikrografların tipik örneklerini temin etmektedir. Güvenilir bir kimlik ve etiketlenmiş ve etiketlenmemiş nöronal elementlerin analiz önlenmesi nörit çift zarlar (Şekil 5C, D), bir görselleştirme zayıf bir sabitleme değiştirilmiş miyelin kılıfı ile sonuçlanır (Şekil 5A, B) ve zorluklar. DAB çözelti içinde aşırı bir inkübasyon süresi fazla arka plan ve potansiyel olarak yanlış pozitif sonuçlar üretebilir spesifik olmayan lekeler oluşturur. Arka plan veya non-spesifik boyama bazen (Şekil 6A, B), nöronal elementlerin eksik olarak boyama görünür, ancak daha sık olarak çok yakından lekeli nöronal elemanları (Şekil 6C, D) yer. bloke edici çözelti içinde deterjan kullanımı önemli ölçüde doku kalitesini değiştirir. Kayıp yol açabilirzor mikro herhangi akut yorumlanması oluşturma etiketli elemanlar (Şekil 7A) veya miyelin kılıfı (Şekil 7B) ve hücre membranları (Şekil 7C) bozulması, içinde organeller. Son olarak, sodyum klorid içeren yıkama solüsyonu kullanılarak osmification işleminde bir yanlış adım, hücresel yapılar (Şekil 7D) ayırt etmek zordur güvenilir sonuçlar verir.

Şekil 1: Protokol temel adımlar Şemalar. Maymun beyin (A), bir soğutma vibratome (B) seri bölümler halinde kesilir. Daha sonra, için işlenir ön gömme ilgi bölgesi 80 nm kalınlığında bir SECTI bir reçine blok (C) ucu üzerine yerleştirilmiş ve kesilir ve bundan sonra immünohistokimya ve elektron mikroskobubir ultramikrotom (D) ons. Ultra ince kesitler daha sonra kurşun sitrat ve transmisyon elektron mikroskobu (F) altında takip edilmesi için hazır ile boyanmış, çıplak 150 örgü bakır ızgaralar ya da formvar kaplı nikel ızgaraları (E) üzerinde toplanır. Ölçek çubukları: 1 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 2: Acrolein-PFA transkardiyak perfüzyon sonrasında İyi korunmuş Primat Beyin Dokusu. Sincap maymunu (Saimiri sciureus) GPI (A) ve GPe (B) gösteren temsilcisinin beyin dokusu elektron mikrografları, akrolein-PFA transkardiyak perfüzyon ve immunoperoksidaz-diaminobenzidin tekniği uygulandıktan sonra malzeme iyi korunmuş. makson (a) Yelin kılıf (A ok ucu bakınız) nispeten sağlam, ve genel ultra yapısı, A ve B Dendritik profillere (d) 'de korunur, küçük myelinsiz aksonlar, (a) ve akson varisler (av) kolayca can tanımlanabilir. Bir dendritik profil (d) (oklar arasında) bir simetrik sinaptik temas kurarak bir akson varisler bir örneği B gösterilmiştir. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 3: mmunoperoksidaz-diaminobenzidin Tekniği kullanılarak sincap maymunu GPe ve Kolin asetiltransferaz GPi imüno-asetiltransferazı (ChAT), serotonin (SERT) ve tirosin hidroksilaz (TH) gelen Bölümler. Immunoetiketli elemanlar kolaylıkla elektron-yoğun bir DAB çökelti ile doldurulacaktır sitoplazma veya axoplasm tarafından tespit edilebilir. GPI bir ChAT immüno dendrit etiketlenmemiş bir akson varisler (av) den (oklar arasında) bir sinaptik temasa alır A 'da görüldüğü gibi etiketlenmiş dendritik profiller, dolu mikrofilamanlardan tarafından kabul edilmektedir. B elektron mikrografıdır axoplasm TH için immunolabeled bir nispeten sağlam miyelin kılıfı ile GPe bir miyelinli akson gösterir. C Örnek GPI'nm bir akson varis SERT için immunolabeled gösterir ve dendrit (d) (oklar arasında) bir simetrik sinaptik iletişim kurmak için görülmektedir. Bu örnekte, DAB çizgileri membranı ve organel (mitokondri ve sinaptik veziküllerin) dış yüzeyini hızlandırabilir. D'de gösterilen akson varis GPe gözlenmiştir ve TH için immunolabeled ve DAB bir örneğini temsil eder, tamamen axop doldurma çökelti oldusinaptik kesecikler ile lasm görülebilir fakat tanımlamak için daha zor olan. etiketli akson varicosity çevreleyen miyelinli ve myelinasyona akson (a) ve zaman zaman dendritler (d) ile gösterildiği üzere mikro elemanları kolayca tespit edilebilir. Elektron mikroskobu 25, 26, 27 ila değiştirilir. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 4: glutaraldehit-PFA transkardiyak perfüzyon sonrasında Primat Beyin Dokusunun örnekler. Performi sonra da makak maymunu (Maçaca fascicularis) GPe (A) ve gpl (BD) ve beyin dokusu temsili elektron mikrografları% 0.2 glutaraldehid ile Ng transkardiyak perfüzyon serotonin transporteri (SERT) karşı bir antikor ile% 4 PFA ve immunperoksidaz-diaminobenzidin tekniği ile karıştırılır. Şekil 2'de olduğu gibi, elemanlar elektron yoğun DAB çökelti ile dolu sitoplazmalarının ve axoplasm ile tespit edilebilir imüno. Genel ince yapısı nispeten sağlam ve etiketli akson varikoziteler çevreleyen miyelinli ve myelinasyona akson (a) ve zaman zaman dendritler (d) ve akson varikozitelerle (av) ile gösterildiği gibi, Şekil 2'de tarif edildiği gibi mikro-unsurları kolayca tespit edilebilir. Bununla birlikte, iyi tanımlanmış plazma membranları (ok başları) ile gösterilen ince yapısı kalitesinin tutarsızlık, ama nispeten zarar miyelin kılıfını (ok). Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 6: sincap maymunu GPe olarak spesifik olmayan ChAT immuno örnekler. B (ok uçları) - A 'de gösterildiği gibi arka plan boyaması veya spesifik olmayan immuno bazen büyük hücre elemanlarının EM kısmi boyama altında görünür. Bu tür spesifik olmayan boyama immunohistokimyasal bölümlerin yüzeyinde daha sık görülmektedir. spesifik olmayan immunolabeling diğer örnekleri, kısmen veya tamamen DAB ile doldurulur ve bir a çok yakın bulunan küçük, myelinsiz aksonlar çağrıştıran çok küçük elemanların sık gözlem içerirnother olarak C ve D'de ok uçlarıyla gösterdi. Ölçek çizgisi: 1 um. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Şekil 7: Elektron Mikroskopi Örnek Hazırlama yanlış bir adım sonrasında Hasarlı Sincap Maymun GPe Doku. Triton X-100 gibi bir deterjan kullanımı, daha da% 0.02 gibi düşük bir konsantrasyonda bloke çözeltisi içinde, esas olarak (dendritler sitoplazmasına (A) ya da akson miyelin kılıfını zarar vererek B yapısı ile ilgili bütünlüğünü değiştirir ). Plazma membranları hasar ve tanımlamak için zor olduğundan farklı nöronal elemanları, aynı zamanda bir başka (C) ayırt etmek zordur. osmification işlemi alsNumune hazırlanması o önemli bir adım. Çözeltiler (D), yıkama içinde sodyum klorür kullanılması zordur, müteakip analiz işleme, doku fiksasyon değiştirir. Ölçek çubuğu: 800 nm. Bu rakamın büyük halini görmek için buraya tıklayın.

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.