Serebral Hemodinamiğin ve Işık Saçılımının Eşzamanlı Değerlendirilmesi In Vivo Sıçan Beyin

Summary

Serebral hemodinamik ve in vivo sıçan beyin dokusunun ışık saçılım özelliklerinin aynı anda değerlendirilmesi, geleneksel bir çok bantlı dağınık yansıtıcılık görüntüleme sistemi kullanılarak araştınlır.

Abstract

Serebral hemodinamiğin ve in vivo sıçan beyin dokusunun ışık saçılma özelliklerinin eşzamanlı değerlendirmesi, geleneksel bir multispektral yaygın yansıma görüntüleme sistemi kullanılarak gösterilmiştir. Bu sistem, geniş bantlı bir beyaz ışık kaynağı, bir dizi dar bant girişim filtresine sahip motorlu bir filtre çarkı, bir ışık kılavuzu, bir toplama merceği, bir video yakınlaştırma merceği ve bir tek renkli şarjlı bağlantılı cihaz (CCD) kamerasından yapılmıştır. Kortikal yüzeyin in vivo multispektral yaygın yansıma görüntülerini yakalamak için izofluran anestezisi altında bir sıçanın kafatası kemiğinde elipsoidal bir kraniyal pencere yapılır. Bir gaz karışım cihazı kullanılarak solunan oksijen fraksiyonunun düzenlenmesi, normoksi, hiperoksi ve anoksi gibi farklı solunum durumlarının indüksiyonunu sağlar. Dokuz dalga boyunda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 ve 760 nm) ölçülen multispektral dağınık yansıma görüntüleri için Monte Carlo simülasyonu tabanlı bir çoklu regresyon analizi daha sonra hemodinamiğin iki boyutlu haritalarını ve in vivo sıçan beyninin ışık saçılma özelliklerini görselleştirmek için gerçekleştirilir.

Introduction

Multispektral dağınık yansıtıcılık görüntüleme korteks dokusu içinde içsel ışık sinyalleri (Moss) içindeki bir sinyallere elde etmek için en yaygın tekniktir. Morfolojik değişiklikler ile indüklenen ışık saçılım özellikleri de ışık emiliminin varyasyonlar nedeniyle kortikal hemodinamikler saçılma özellikleri, azaltılması ya da mitokondri içinde sitokrom okside bağlı olarak emme varyasyon ve varyasyonları: Moss, başlıca üç fenomen ilişkilendirilir, in vivo beyin gözlenen ^1.

yakın kızılötesi (NIR) spektral aralığa (VIS), görünür ışık etkili bir şekilde emilir ve biyolojik doku ile serpilir. In vivo beyin dağınık yansıtıcılık spektrumu emme ve dağıtma spektrumları ile karakterize edilir. Düşük saçılma katsayıları monoton bir saçılma spektrumu sergi VIS-to-NIR dalga boyu aralığı sonuç olarak beyin dokusu _s '^ ıDaha uzun dalga boylarında daha küçük büyüklükler. İndirgenmiş saçılma katsayısı spektrumu _μs '(λ) , _μs ' (λ) = a × λ- ^b gibi güç yasası fonksiyonu ^{2 , 3} formunda olacak şekilde yaklaştırılabilir. Saçılma gücü b , canlı dokuda bulunan biyolojik saçılımcıların boyutu ile ilgilidir ^{2 , 3} . Dokunun morfolojik değişiklikleri ve canlı korteks dokusunun yaşayabilirliğinin azaltılması biyolojik saçılmaların ^{4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9} boyutlarını etkileyebilir.

Çokboyutlu diffüz yansıtma görüntüleme için optik bir sistem, akkor lityumdan kolayca oluşturulabilirGHT kaynağı, basit optik bileşenler ve bir monokromatik yüklü bağlanmış cihaz (CCD). Bu nedenle, çeşitli algoritmalar ve multispektral dağınık yansıtıcılık görüntüleme için optik sistemler kortikal hemodinamikleri ve / veya doku morfolojisi ^{10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18} değerlendirmek için kullanılmıştır.

Bu makalede tarif edilen yöntem hemodinamiği ve bilinen bir çok bantlı dağınık yansıtıcılık görüntüleme sistemi kullanılarak in vivo olarak sıçan serebral dokusunun ışık saçılım özelliklerinin her ikisi de göstermek için kullanılır. Alternatif teknikler üzerinden bu yöntemin avantajları serebral hemodinamik ve kortikal doku hem de uzaysal değişiklikleri değerlendirmek için yeteneğidirmorfolojisi, yanı sıra çeşitli beyin fonksiyon bozukluğu hayvan modellerinde uygulaması. Bu nedenle, yöntem, travmatik beyin hasarı, epilepsi nöbet, inme ve iskemi araştırmalar için uygun olacaktır.

Protocol

Hayvan bakımı, hazırlanması, ve deneysel protokolleri Tarım ve Tokyo Teknoloji Üniversitesi Hayvan Araştırmaları Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu metodoloji, sıçan yiyecek ve su ad libitum ile, kontrollü bir ortamda (24 ° C, 12 saat ışık / karanlık döngüsü) içinde yer alır.

Bir Konvansiyonel Çokspektrumlu yaygın reflektans Görüntüleme Sistemi 1. İnşaat

1. Montaj merkezi dalga boyları ile dokuz dar optik girişim filtreleri 500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730, ve motorlu filtre tekerleğin filtre deliklerine 760 nm.
2. geniş bant beyaz ışık kaynağı, dar girişim filtreleri yukarıdaki seti, bir ışık kılavuzu, bir toplama lensi, video yakınlaştırma lensi ve bir tek renkli CCD kamera ile motorlu bir filtre tekerleği kullanarak bir çok bantlı görüntüleme sistemini Construct. Şekil 2'de gösterilen optik bileşenlerin düzeni, th için de ifade edilebilirInşaat prosedürüdür.
   NOT: Aydınlatma açısı, numune yüzeyine göre yaklaşık 45 ° 'dir.
3. Bir girişim filtresi, ışık kılavuzu ve toplama merceği yoluyla numunenin yüzeyini aydınlatmak için halojen lamba ışığı kaynağını açın.
4. CCD kameranın işletim yazılımını açın.

2. Hayvan Hazırlama

NOT: Bu protokolde, sıçan gelecek deneyler için kullanılmamıştır ve multispektral görüntülerin ölçümünden hemen sonra feda edilmiştir.

1. Bir indüksiyon odasının giriş portunu bir tüp ile anestezi makinesinin çıkış portuna bağlayın. İndüksiyon odasının çıkış portunu anestezi makinesinin giriş portuna ikinci bir boruyla bağlayın.
2. Sıçanı indüksiyon odasına yerleştirin ve% 5.0 izofluran ile anestezi indükleyin. Anesteziyi, sıçanın ayak parmaklarına cevap vermemesi için derinlikte tutun. LAnestezi makinesinde bir döner düğme kullanarak% 2.0 izofluran'a cevap verin.
3. Sıçanın kafasını stereotaksik bir çerçeveye sabitleyin. Anestezik için bir ağızlığı stereotaksik çerçeveye takın.
4. Ağızlık parçasını bir tüp ile anestezi makinesinin çıkış portuna bağlayın. Ağızlık parçasını bir tüp ile anestezi makinesinin giriş portuna bağlayın.
5. Cilt yüzeyi görünene kadar baş bölgesini prospektif kesi alanının ötesine tıraş edin.
6. Başın orta hat boyunca yaklaşık 20 mm uzunluğunda bir kesi yapın ( Şekil 1 (a) ) ve subkutanöz bağ dokularını ( Şekil 1 (b) ) maruz bırakın.
7. Deri altı bağ dokularını keskin bir küret veya bir kıskaç kullanarak çıkarın ve kafatası kemiğini ortaya çıkarmak için başın iki yanına çekin ( Şekil 1 (c) ).
8. Kafatası dikişindeki kafatası kemiğinde elipsoidal bir hendeğe dikkat edin.bir yüksek devirli es (koronal dikiş, sagital dikiş ve lambdoidea'nın) (Şekil 1 (d)).
9. Yavaş ve homojen yüksek devirli hendek içine kafatası kemiği kazıp.
10. Hafif bir serebral kan damarı ortaya çıktıktan sonra, kemik kalınlığı ve kuvveti tahmin etmek için kıskaç ucu ile inceltilmiş kafatası yüzeyi üzerinde basın. inceltilmiş kafatası bölgeye kolaylıkla bastırır durumunda, yüksek-hızlı, elektrikli bir kafatası kemik azalma sonlandırabilir.
11. parça parça kıskaç veya küçük cerrahi makas ucunu kullanarak inceltilmiş kafatası elips sınır hattını kesin.
12. pense yardımıyla yavaş ve nazikçe beyin yüzeyinden inceltilmiş kafatası çıkarın.
13. Yavaşça fizyolojik tuzlu su ile kranyal pencere banyo ve yaklaşık olarak 0.1 mm kalınlıkta saydam bir cam plaka ile örtün.

3. alınan oksijenin Kesir düzenlenmesi

NOT: Solunum condition, alınan oksijenin kısmını (FiO ₂₎ regüle ederek değiştirilebilir.

1. bir tüp kullanılarak, bir Y-şeklindeki tüp bağlantısı (bağlayıcı 2) birinci bağlantı için bir Y-şeklindeki boru konektörü (bağlayıcı 1) birinci bağlantı noktasına bağlamak.
2. tüp bağlantısı 1 ikinci bağlantı noktasına ağızlığın giriş portu bağlayın.
3. bir tüp kullanılarak, bir oksijen konsantrasyonu izleme cihazına tüp bağlantısı 1 üçüncü bağlantı noktasına bağlamak.
4. bir tüp ile, anestezi makinesi çıkış portuna tüp konektör 2'nin ikinci bağlantı noktasına bağlamak.
5. bir tüp kullanılarak, bir gaz karışımı cihazının çıkış portuna tüp konektör 2'nin üçüncü bağlantı noktasına bağlamak.
6. % 5 bir tüp kullanarak _CO2 gaz silindiri - yüksek-basınçlı bir% 95 _O2 gaz karışımı, cihazın bir giriş portunu.
7. Bir tüp kullanarak% 5 _CO2 gaz silindiri - yüksek-basınçlı bir% 95 _N2 gaz karışımı, cihazın diğer giriş portunu.
8. o gaz akış oranlarını değiştirmeGaz karışımı cihazda döner düğme ile fO ₂ ve _N2.
9. Giriş ve oksijen konsantrasyonu, izleme cihazı kullanılarak FiO ₂ düzenler.

Çokspektrumlu yaygın reflektans Görüntüler 4. Toplama

1. Referans görüntülere kazanılması
   NOT: ışık kaynağı, optik fiber gibi bu deneyde kullanılan optik bileşenleri ve dedektörler kendi spektral özellikleri vardır. Bu nedenle, bu bileşenler geçen ışığın yoğunluğu, bir referans resim olarak kaydedilmelidir. referans görüntü ışık kaynağından gelen ışık ile aydınlatılan standart beyaz difüzör ile çekilen bir görüntüdür.
   1. yatay sahnede standart beyaz difüzör koyun.
   2. varil üzerinde yakınlaştırma halkasını çevirerek beyaz difüzör yüzeyinde kamera lensini odaklanın.
   3. uygun değeri seçerek kamera entegrasyonu zaman ayarlayınaçılan entegrasyon Listesi kez kamera işletim yazılımında ışık büyük miktarda maksimum sayıları yaklaşık% 75 olan bir sinyal üretir, böylece. piksel değerleri histogram izlerken sinyal yoğunluk seviyesi maksimum sayısı yaklaşık% 75 kadar, entegrasyon zaman ayarlayın.
   4. bir dosyaya bir görüntü kaydetmek için dosya menüsünden "save" komutunu seçin.
   5. Filtre tekerleği çevirerek filtre konumunu değiştirin.
   6. Yukarıda tarif edilen yönteme göre, diğer dalga boylarında bir görüntü kaydetme. Dosya adı örneği ve kullanılan dalga boyu (örneğin W500 W520, W540 ... W760) belirlemelidir.
2. Örnek görüntüler kazanılması
   Not: Dokuz dalga boylarında maruz sıçan beyninin diffusely-yansıyan ışık yoğunluğu görüntüleri yakalanır ve aynı etme koşulları kullanılarak kişisel bilgisayarın sabit diskinde saklanır.
   1. Yavaşça r yerleştirmekKamera sıçan beyninde yüzeyinde odaklanmak böylece sahnede de yavaş yavaş sahne seviyesini ayarlayın.
   2. bir dosyaya bir görüntü kaydetmek için dosya menüsünden "save" komutunu seçin.
   3. Filtre tekerleği çevirerek filtre konumunu değiştirin.
   4. Yukarıda tarif edilen yönteme göre, diğer dalga boylarında bir görüntü kaydetme. Dosya adı örneği ve dalga boyu (örneğin R500, R520, R540 ... R760) belirlemelidir.
3. Karanlık görüntülerin Edinme
   NOT: CCD kamera, bir elektrik sinyaline yanıt olarak, bir ışık yoğunluğu üretir. Ancak, ışık detektörü ile girmezse bile dolayı elektrik devreleri ve dedektörler gürültü bazı küçük çıkış vardır; bu karanlık akım gürültüsü denir. doğru ışığın spektral yoğunluğunu ölçmek için, karanlık akım bileşeni karanlık görüntü olarak kaydedilmiş ve daha sonra ölçme sinyalinden çıkarılmalıdır. Karanlık görüntü bir görüntü almaktırn, ışık yolu ile bloke edilmiştir.
   1. halojen lamba ışık kaynağı kapatın.
   2. Bir koruyucu plaka kullanılırsa CCD kamera sistemine ışık yolunu engelleme.
   3. bir dosyaya bir görüntü kaydetmek için dosya menüsünden "save" komutunu seçin. Dosya adı örneği (örneğin, Koyu) belirlemelidir.

5. Hemoglobin İçerik ve Işık Saçılma Parametre görselleştirme

NOT: multispektral dağılarak yansıma görüntüleri kümesi kişisel bilgisayarın sabit diskine kaydedilir ve çevrimdışı analiz edilir. Dokuz dalga boyunda (500, 520, 540, 560, 570, 580, 600, 730 ve 760 nm) olarak çok bantlı dağınık yansıtıcılık bir görüntü Monte Carlo simülasyonu ¹⁹ yardımıyla bir çoklu regresyon analizi, daha sonra, iki boyutlu görselleştirmek için gerçekleştirilir oksijenli hemoglobin konsantrasyonu, oksijenden arındırılmış hemoglobin konsantrasyonu, toplam hemoglobin konsantrasyonu, bölgesel serebral oksijen doygunluğu ve kovanının haritagüç vuruşlarını. Ayrıntılı algoritma Literatüre ^{17, 18} olarak yayınlanmıştır.

1. referans görüntü ve her dalga boyunda örnek resmi hem de karanlık görüntü çıkarılır.
2. Her dalga boyuna X referans görüntü ile örnek bir resim normalize. Dağılarak yansıma görüntü R gibi normalize görüntü davranın.
3. Her dalga boyuna X de dağınık yansıtıcılık görüntü R karşıtının logaritmalama absorbansı (ya da optik yoğunluğu) görüntü A hesaplayın:
   (1)
4. Y düzlemi beyin yüzeyi için elde edilen yapısal bilgi gösterir ve z, -Axis spektral bilgileri gösterir - X dalga boyuna sırasına, absorbans görüntü istifleme ile bir üç-boyutlu matrisi oluşturmak.
5. peHer bir xy koordinat absorbans spektrumu A (λ) için çoklu regresyon analizi rform.
6. Adım 5.5 bağımsız değişkenler olarak bağımlı değişken ve _HBO (λ) ε oksijenli hemoglobin molar tükenme katsayısı spektrumları ve deoksijene hemoglobin ε _HBr (λ) olarak absorbans spektrumu A (λ) kullanarak _(HBO ε değerleri yayınlanan (λ) ve ε _HBr (λ)), Tablo 1 'de verilmiştir.
7. Üç çoklu regresyon iki boyutlu haritalar (resimler) kontrol edin, bir _HBO, bir _HBR ve ₀ katsayıları.
8. Amacıyla _HBO, bir _HBr ve bir _0, çoklu regresyon katsayısı görüntü istifleme ile bir üç-boyutlu matrisi oluşturmak burada y düzleminde beyin yüzeyinden z -Axis için elde edilen yapısal bilgileri gösterir çoklu regresyon katsayılarını gösteriyor.
9. Oksijenli hemoglobin konsantrasyonu Cı _HbO, oksijenden arındırılmış hemoglobin konsantrasyonu Cı _HBr ve her xy bir _HBO, bir _{HBr ve 0} katsayıları o P'nın değerleri (aşağıdaki ampirik formüller kullanılarak koordinat çoklu regresyon kümesinden saçılma güç b hesaplayın _{HbO i,} β _{HBr, i} ve β _{0, i} (i = 0,1,2,3), Tablo 2'de verilmektedir):
   (2)
   (3)
   (4)
10. Oksijenli hemoglobin konsantrasyonu Cı _HbO, oksijenden arındırılmış hemoglobin konsantrasyonunun Cı _HBr ve saçılma güç b iki boyutlu haritalar (görüntü) kontrol edin.
11. Her x, _Cı-hbo ve C _HBr toplanmasıyla toplam hemoglobin konsantrasyonu Cı _HBT bir iki boyutlu ilk hesaplayın - y koordinatı.
12. Y koordinatı - her bir x, toplam hemoglobin konsantrasyonu Cı _HBT oksijenlenmesi hemoglobin konsantrasyonu Cı _HbO bölünmesi ile bölgesel serebral oksijen doygunluğu Rso ₂ bir iki-boyutlu bir harita hesaplayın.

Results

In vivo sıçan beyinlerinden alınan diffüz reflektans temsili spektral görüntüleri 500, 520, 540, 560, 570, şekil 3 ve görüntüler gösterilir ve 580 net bir şekilde serebral korteks kan damarlarının yoğun bir ağ görselleştirmek nm. kan damarlarının ve 600, 730 de resimlerde görülen çevreleyen doku ve 760 nm arasında kontrast bozulması daha uzun ve NIR dalga boyları hemoglobin tarafından ışığın daha düşük emilmesini yansıtır.

Discussion

Bu protokol olarak en kritik kademenin kafa pencere yapmak inceltilmiş kafatası bölgenin çıkarılmasıdır; Bu beklenmeyen bir kanama önlemek için dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. Bu adım, yüksek doğrulukta yansıma görüntüleri dağınık multispektral yüksek kaliteli elde etmek için önemlidir. Stereomikroskopta kullanılması cerrahi prosedür mümkünse için tavsiye edilir. jelatin sünger Küçük parçalar hemostaz için yararlıdır.

Bu makalede açıklanan optik sistemi ışık kaynağının önünde yer alan bir...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
150 W halojen lambalı ışık kaynağı	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japonya	LA-150SAE
Işık kılavuzu	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japonya	LGC1-5L1000
Toplama lensi	Hayashi Watch Works Co., Ltd, Tokyo, Japonya	SH-F16
500 nm l@	parazit filtreleri Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#65088
Girişim filtreleri l@ 520 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#65093
Girişim filtreleri l@ 540 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#65096
Girişim filtreleri l@ 560 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#67766
Parazit filtreleri l@ 570 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#67767
Girişim filtreleri l@ 580 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#65646
Girişim filtreleri l@ 600 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#65102
Girişim filtreleri l@ 730 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#65115
Girişim filtreleri l@ 760 nm	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	#67777
Motorlu filtre tekerleği ve nbsp;	Andover Corporation, NH, ABD	FW-MOT-12.5
8 bit monokromatik CCD kamera	THE IMAGINGSOURCE, Almanya	DMK21BU618. H
Video yakınlaştırma lensi	Edmund Optics Japan Ltd, Tokyo, Japonya	VZMTM300i
%99 dağınık yansımalı Spectralon beyaz standardı	Labsphere Incorporated, North Sutton, NH, ABD	SRS-99-020