Method Article

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

May 1st, 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastalık anlayış ve biyomarker keşfi için birçok biyolojik numunelerin analiz etmek giderek artan bir talep vardır. Birden numunelerin eş zamanlı ölçümü yaygın hale gelir ve büyük ölçüde deneysel maliyetleri ve sürelerini azaltmak gelmiş izin kantitatif proteomik stratejileri. Laboratuvarımız geleneksel izotopik etiketleme veya İzobarik etiketleme yaklaşımların örneği çoklama artırır izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) kombine habercisi olarak adlandırılan bir teknik geliştirdi. Küresel cPILOT hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardan gelen örnekleri uygulanmış ve farklı örnek koşullar arasında görece protein bolluk hakkında bilgi verir edilebilir. cPILOT düşük pH'li bir tampon koşulları kullanılarak: 1) ile çalışır seçici dimethylate peptit, N-terminali ve 2)) Malzemeler / Reaktifler bakınız Tablo (ticari olarak temin edilebilen izobarik reaktifler ile lizin kalıntılarının birincil aminler etiket için yüksek pH tampon koşulları kullanılmasına ilişkindir. derecesiMevcut örnek çoğullama kullanılan ön-madde etiket sayısı ve izobarik etiketleme reaktifi bağlıdır. Burada, tek bir analizde fare dokularından 12 örnekleri analiz etmek için, altı-karmaşık izobarik reaktifler ile birleştirilmiş hafif ve ağır dimetilasyon kullanarak 12-karmaşık analizini. Geliştirilmiş çoğullama az deneysel önyargı yanılma ile, daha da önemlisi, deneysel zaman ve maliyet ve azaltarak birçok örnek koşullarına (biyolojik çoğaltır, hastalık evresi, ilaç tedavileri, genotipi veya boyuna zaman noktalarında) arasında karşılaştırma izin verdiği için yararlıdır. Bu çalışmada, küresel cPILOT yaklaşım Alzheimer hastalığı fare modeli ve sokak türü kontrollerden beyin, kalp, ve biyolojik çoğaltır genelinde karaciğer dokuları analiz etmek için kullanılır. Küresel cPILOT diğer biyolojik süreçleri incelemek için uygulanan ve 20'den daha fazla numune numune çoğullama artırmak için adapte edilebilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomiks genellikle daha iyi hastalık süreçlerini anlamak için kullanılan pek çok numune, enzim kinetiği, post-translasyonel modifikasyonlar, çevresel uyarılara yanıt ve terapötik tedaviler, belirleyici keşif ya da ilaç mekanizmalarına müdahale analizini içerir. Nicel yöntemler örnekleri üzerinden protein seviyelerinde göreli farklarını ölçmek için ve etiketsiz olabilir ya da izotopik etiketleme (metabolik, kimyasal ya da enzimatik) içeren kullanılabilecektir. pek çok örnekler eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin verir ve farklı hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardaki örnekler için uygundur, çünkü kararlı izotop etiketleme yöntemleri popül....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Fareler bağımsız, kar amacı gütmeyen biyomedikal araştırma kurumundan alınan ve Pittsburgh Üniversitesi Hayvan Kaynakları Laboratuarı Bölümü yerleştirildiler. Tüm hayvan protokolleri Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

Kimyasal etiketleme için 1. Protein Ekstraksiyonu ve Peptidlerin üretimi

  1. Doku hücreleri veya vücut sıvılarından protein ekstrakte edilir.
    1. Mekanik bir homojenleştirici kullanılarak 8 M üre (500 uL) ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde doku (örneğin, beyin, kalp, karaciğer) (1 x PBS) 60-90 mg homojenleştirin. Gerekir....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT N-terminus lisin kalıntılarında etiket peptidleri kimyasal olarak amin bazlı kimyası kullanır ve örnek çoğullama kabiliyetini artırır. Şekil 2, bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden beyin, kalp, karaciğer ve bir doku 12-karmaşık cPILOT analizinden elde edilen temsili MS verilerini gösterir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, Alzheimer hastalığı ve vahşi tip fareler için iki biyolojik çoğaltır Bu 12 plex analize dahil edilmişt.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT fazla 12 farklı numune eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. peptidlerin N-terminali ve hem de lizin kalıntılarının başarılı etiketleme sağlamak amacıyla, reaksiyonların her set için doğru pH değerine sahip olması ve peptit etiketleme için ilk dimetilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek için zorunludur. N-ucunda seçici dimetilasyon (± 0.2) ~ 2.5 bir pH değerine sahip olması ile gerçekleştirilir. Bu lisin üzerindeki amino gruplarının pKa farklılıklarını ve N-terminali kullanılmasıyla elde edilir. pH değeri 2.5 'de.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar var.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar RASR için Pittsburgh Başlangıç ​​Fon Üniversitesi ve NIH, NIGMS R01 hibe (GM 117191-01) kabul eder.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Su - MS SınıfıFisher ScientificW6-44 L miktar gerekli değildir
Asetonitril - MS SınıfıFisher ScientificA955-44 L miktar gerekli değildir
Asetik AsitJ.T. Baker9508-01
Amonyum hidroksit çözeltisi (%28 - 30)Sigma Aldrich320145-500ML
Amonyum formatAcros Organics208-753-9
Formik AsitFluka Analitik94318-250ML-F
BCA protein tahlil kitiPierce Thermo Fisher Scientific23227
ÜreBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
İyodoasetamid (IAMAcros Organics144-48-9
L-SisteinSigma Aldrich, Kimya168149-25G
L-1-tosylamido-2 feniletil kolormetil keton (TPCK) ile tedavi edilen sığır pankreasından TripsinSigma Aldrich, Yaşam BilimleriT1426-100MG
Formaldehit (CH2< / sub>O) çözeltisi; H2O içinde %36,5 - 38Sigma Aldrich, Yaşam BilimleriF8775-25ML
Formaldehit (13< / sup>CD2< / sub>O) çözeltisi; ağırlıkça %20 D 2< / sub>O, 98 atom% D, 99 atom% 13< / sup>CSigma Aldrich, Kimya596388-1G
Sodyum Siyanoborohidrit; reaktif sınıfı, %95Sigma Aldrich156159-10G
Sodyum Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, %98 CPSigma Aldrich, Kimya190020-1G
Güçlü Katyon Değişimi (SCX) spin uçları numune hazırlama kitiProtea BioSciencesSP-155-24kit
Trietil amonyum bikarbonat (TEAB) tamponuSigma Aldrich, Yaşam BilimleriT7408-100ML
İzobarik Etiketleme Kiti (TMT 6 plex) - 6 reaksiyon (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hidroksilamin hidroklorürSigma Aldrich, Kimya255580-100G
Standart girdap karıştırıcıFisher Scientific2215365herhangi bir karıştırıcı kullanılabilir
Oasis HLB 1 cc (10 mg) ekstraksiyon kartuşlarıSular186000383Bunlar C18 kartuşlardır
Visiprep SPE vakum manifoldu, DL (tek kullanımlık astar), 24 portlu modelSigma Aldrich5726512 portlu bir model de yeterlidir
Speed-vacThermo ScientificSPD1010herhangi bir marka speed vac yeterlidir
Su banyosu odasıThermo Scientific2825/2826Herhangi bir marka  kontrollü sıcaklıklara sahip bir su banyosu odası yeterlidir.
Mekanik Homojenizatör (yani FastPrep-24 5G)MP Biyomedikal116005500
Eksigent Nano LC - Nano LC AS-2 otomatik numune alma cihazı ile Ultra 2DSciex-Bumodel artık mevcut değil. Otomatik örnekleyiciye sahip herhangi bir nano LC yeterlidir.
LTQ Orbitrap Velos Kütle SpektrometresiThermoScientific-Bumodel artık mevcut değil. Diğer yüksek çözünürlüklü cihazlar (örn. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion veya Orbitrap Fusion Lumos) kullanılabilir.
Protein yazılımı (örn. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analitik teraziMettler ToledoAL54
Karıştırma plakasıVWR12365-382Her marka karıştırma plakası yeterlidir
pH metre (Tris uyumlu)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Herhangi bir marka pH metre yeterlidir
pH 10 tamponuFisher Scientific06-664-261Herhangi bir marka pH tamponu 10 yeterlidir
pH 7 tamponFisher Scientific06-664-260Herhangi bir marka pH tamponu 7 yeterlidir
1.5 mL eppendorf tüpleri, 500 pkFisher Scientific05-408-129Herhangi bir marka 1.5 mL eppendorf tüpleri yeterlidir
0.6 mL eppendorf tüpleri, 500 pkFisher Scientific04-408-120Herhangi bir marka 0.6 mL eppendorf tüpleri yeterlidir
0.65 &mikro; m Ultrafree MC DV santrifüj filtre üniteleriEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL mikrosantrifüj tüpler, 72 adetThermo Scientific69720
C18 ambalaj malzemesi (5  &mikro; m, 100 å)BrukerPM5/61100/000Bu ürün artık Bruker'de mevcut değil. Listelenen özelliklere sahip alternatif ambalaj malzemesi yeterli olacaktır
C < alt > 18 < / alt> ambalaj malzemesi (5 / nbsp; &mikro; m, 200 å)BrukerPM5/61200/000Bu ürün artık Bruker'de mevcut değil. Listelenen özelliklere sahip alternatif ambalaj malzemesi yeterli olacaktır

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

cPILOTIsobaric TaggingDimethylation LabelingSample MultiplexingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

Related Articles