Yöntem makalesi

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

DOI:

10.3791/55406

⸱

1 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry, University of Pittsburgh, 2SGS North America Inc., 3Large Molecule Analytical Development, Pharmaceutical Development & Manufacturing Science, Janssen Research and Development

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hastalık anlayış ve biyomarker keşfi için birçok biyolojik numunelerin analiz etmek giderek artan bir talep vardır. Birden numunelerin eş zamanlı ölçümü yaygın hale gelir ve büyük ölçüde deneysel maliyetleri ve sürelerini azaltmak gelmiş izin kantitatif proteomik stratejileri. Laboratuvarımız geleneksel izotopik etiketleme veya İzobarik etiketleme yaklaşımların örneği çoklama artırır izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) kombine habercisi olarak adlandırılan bir teknik geliştirdi. Küresel cPILOT hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardan gelen örnekleri uygulanmış ve farklı örnek koşullar arasında görece protein bolluk hakkında bilgi verir edilebilir. cPILOT düşük pH'li bir tampon koşulları kullanılarak: 1) ile çalışır seçici dimethylate peptit, N-terminali ve 2)) Malzemeler / Reaktifler bakınız Tablo (ticari olarak temin edilebilen izobarik reaktifler ile lizin kalıntılarının birincil aminler etiket için yüksek pH tampon koşulları kullanılmasına ilişkindir. derecesiMevcut örnek çoğullama kullanılan ön-madde etiket sayısı ve izobarik etiketleme reaktifi bağlıdır. Burada, tek bir analizde fare dokularından 12 örnekleri analiz etmek için, altı-karmaşık izobarik reaktifler ile birleştirilmiş hafif ve ağır dimetilasyon kullanarak 12-karmaşık analizini. Geliştirilmiş çoğullama az deneysel önyargı yanılma ile, daha da önemlisi, deneysel zaman ve maliyet ve azaltarak birçok örnek koşullarına (biyolojik çoğaltır, hastalık evresi, ilaç tedavileri, genotipi veya boyuna zaman noktalarında) arasında karşılaştırma izin verdiği için yararlıdır. Bu çalışmada, küresel cPILOT yaklaşım Alzheimer hastalığı fare modeli ve sokak türü kontrollerden beyin, kalp, ve biyolojik çoğaltır genelinde karaciğer dokuları analiz etmek için kullanılır. Küresel cPILOT diğer biyolojik süreçleri incelemek için uygulanan ve 20'den daha fazla numune numune çoğullama artırmak için adapte edilebilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Proteomiks genellikle daha iyi hastalık süreçlerini anlamak için kullanılan pek çok numune, enzim kinetiği, post-translasyonel modifikasyonlar, çevresel uyarılara yanıt ve terapötik tedaviler, belirleyici keşif ya da ilaç mekanizmalarına müdahale analizini içerir. Nicel yöntemler örnekleri üzerinden protein seviyelerinde göreli farklarını ölçmek için ve etiketsiz olabilir ya da izotopik etiketleme (metabolik, kimyasal ya da enzimatik) içeren kullanılabilecektir. pek çok örnekler eş zamanlı olarak analiz edilmesine izin verir ve farklı hücreler, dokular, vücut sıvıları veya bütün organizmalardaki örnekler için uygundur, çünkü kararlı izotop etiketleme yöntemleri popülaritesi büyüdü. İzotop etiketleme yöntemleri, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 artış deneysel verim,edinme zamanı, maliyetleri ve deneysel hatayı azaltırken. Bu yöntemler, peptid tepelerinden proteinlerin nispi bolluklarını ölçmek için ön-madde kütle spektrumları kullanın. Bunun aksine, izobarik etiketleme ayıraçları 8, 9, 10 ya da MS / MS veya MS tespit edilir raportör iyonları üreten 3 11 spektrumları ve bu tepe proteinlerin nispi bolluk rapor etmek için kullanılır.

Proteomik çoklama mevcut state-of-the-art 12 10-karmaşık veya 12-karmaşık izobarik etiket analizi 13 ya da bir. Geliştirilmiş örnek çoklayıcı (yani> 10 numune) yöntemleri hücrelerde 18 analizi için başkaları tarafından dokular 14, 15, 16, 17 için laboratuarda geliştirilmiş ve edilmiştir sup>, 19, 20, 21, ya da hedef peptidleri 22 dokular. Biz İsobarik etiketleme (cPILOT) ile kombine öncü izotopik etiketleme denilen gelişmiş bir çoğullama teknik geliştirdi. Küresel cPILOT farklı örnek koşullarında (≥12) 14 üzerindeki tüm proteinlerin nispi konsantrasyonları hakkında bilgi almak için kullanılır. Şekil 1, genel bir cPILOT akışını gösterir. Triptik veya Lys-C peptidler seçici düşük pH 2 ile dimetilasyon N-terminalinde ve yüksek pH değeri 6-karmaşık reaktifler ile lizin kalıntılarında etiketlenir. Bu strateji, deney maliyetleri ve ek azaltmaya yardımcı olur izobarik reaktifler ile analiz edilebilir numune sayısını iki katına, deneysel adımlar ve zamanı azaltır.

oksidatif post-translasyonel modi incelemek için başka yöntemler geliştirdik olarak cPILOT esnektir3-nitrotirosin modifiye edilmiş proteinler 14 ve S-nitrozilasyonuyla (oxcyscPILOT) 23 sistein içeren peptidlerin dahil fications. Ayrıca, bir amino asit, seçici bir yaklaşım, sistein cPILOT (cyscPILOT) 17 geliştirdik. Bir üst iyon 11 veya seçici-y 1 -iyon yöntemi 15 MS 3 alıcı raportör iyon girişimi azaltmak ve cPILOT kantitatif hassaslığını arttırabilir. Düşük çözünürlüklü iyon kapanı araçları da 24 ile de çalışabilir elde etme yönteminde MS 3'ün kullanımı, Orbitrap kütle analizörü ile bir yüksek çözünürlüklü bir cihaz gerektirir.

Daha önce, cPILOT bir Alzheimer hastalığı fare modelinde karaciğer proteinleri 16 çalışma için kullanılmıştır. Burada, periphe rolünü incelemek için beyin, kalp ve karaciğer homojenatlan kullanılarak küresel cPILOT analizi gerçekleştirmek için nasıl tarifAlzheimer hastalığında ry. Bu deney biyolojik çoğaltma içermektedir. Çünkü cPILOT çok yönlülüğü, ilgilenen kullanıcılar biyolojik sorunlar ve sistemlerin bir dizi diğer dokuları incelemek için tekniği kullanabilirsiniz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Etik Beyanı: Fareler bağımsız, kar amacı gütmeyen biyomedikal araştırma kurumundan alınan ve Pittsburgh Üniversitesi Hayvan Kaynakları Laboratuarı Bölümü yerleştirildiler. Tüm hayvan protokolleri Pittsburgh Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

Kimyasal etiketleme için 1. Protein Ekstraksiyonu ve Peptidlerin üretimi

  1. Doku hücreleri veya vücut sıvılarından protein ekstrakte edilir.
    1. Mekanik bir homojenleştirici kullanılarak 8 M üre (500 uL) ile fosfat tamponlu tuzlu su içinde doku (örneğin, beyin, kalp, karaciğer) (1 x PBS) 60-90 mg homojenleştirin. Gerekirse Proteaz veya fosfataz inhibitörleri tampona ilave edilebilir. Bu projede, onlar kullanılmamıştır. homojenleştirici için aşağıdaki parametreler kullanın: matrisi boncuklar, 4 m / s, 20 s lize. Kalp doku homojenizasyon kadar 9 döngüleri gerektirebilir.
      Not: Proteaz veya fosfataz inhibitörü gerekli olduğu takdirde tampon ilave edilebilir. Onlar bu çalışmada kullanılmamıştır.
      1. yokedici tüpten, doku homojenatının çıkarın ve bir mikro-santrifüj tüpüne aktarılır. 8 M üre ile PBS 100-500 uL tüpler lize durulayın ve doku homojenatı ile durulama çözeltisi birleştirir.
    2. Homojenize doku santrifüj (9447 x g, 4 ° C, 15 dakika) ve süpernatan toplamak.
  2. Üreticinin talimatlarına uygun olarak bir bisinkoninik asit (BCA) deneyi kullanarak protein konsantrasyonunu belirleyin.
    Not: protein konsantrasyonu çok yüksek ise, tamponla daha fazla seyreltmek gerekli olabilir. bu dokulardan numuneler için elde edilen konsantrasyonları 6-13 ug / ml arasında idi.
    1. İsteğe bağlı: oran 1 ug standart bir iç kalite kontrol standart (örneğin sığır alfa kazein veya diğer dışsal protein) ekleyin: 100 ug protein örneği.
jove_title "> 2. Örnek Sindirim

  1. Her bir numunenin protein 100 ug (100 x 10 -6 g) ekleyin bireysel mikro santrifüj tüplerini etiketli. hacim, protein konsantrasyonuna bağlı olan (adım 1.2).
  2. Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 reaktifi 40) ditiyotreitol (DTT) ilave edilir. 2 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilir. Mol oranının hesaplanması 66.5 x 10 3 g / mol, sığır serum albümin protein kütlesinin (BSA), kapalı dayanır.
  3. Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 ayıracı 80) iodoasetamid (IAM) ekleyin. 2 saat boyunca karanlıkta buz üzerinde inkübe edin. Bu reaksiyon, yan reaksiyonları önlemek için 2 saat buz üzerinde gerçekleştirilir.
  4. Her bir örnek için (mol oranı örnek 1 reaktifi 40), L-sistein ekleyin. 30 dakika için oda sıcaklığında inkübe edilir.
  5. 2 M bir son konsantrasyona kadar üre seyreltmek için 10 mM CaCl2 (pH 8.2) ile 20 mM Tris tamponu ekleyin
  6. Ekle L-1-tosilamido-2-feniletil klorometil keton (TPCK) tripsin ile tedavi edilen (50: 1 alt-tabaka her bir numuneye) mol oranı, enzim ve 24 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edilmiştir.
  7. Flaş dondurma daha sonra işlenene kadar -80 ° C'de sıvı azot ve mağaza örnek tarafından protein sindirimini sönümlenir.

3. Örnek tuz giderme

  1. formik asit (FA) eklenerek örnekleri yeniden asitleştirin. % 0.1 bir son konsantrasyon elde etmek için yeterli FA ekleyin. Numuneler -80 ° C'de ilk olarak ise, yeniden asitleştirildi numunelerin buz üzerine çözülme.
  2. De-tuzu olarak daha önce dengeli C18 hidrofilik lipofilik (HLB) 10 mg kartuşları kullanılarak peptidler 16 tarif.
  3. ~ 10 uL hacme kadar vakum santrifüj (5 Torr, 45 ° C, 77 x g) örnekleri kurutun.

4. dimetilasyon Etiketleme (N-uçlarında)

  1. yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) ya da nano saf derece su içinde çözülmüş% 1 asetik asit içinde peptidleri (0.25 ug / ml) ile sulandırın. 50 ^ ı kaldırınG yeni bir mikro santrifüj tüpüne (1.5 mL) bölümü ve -80 ° C 'de kalan saklayın.
  2. 8 60 mM (% 4) CH uL 2 O (% 37 ağırlık / hacim) ya da 60 mM (% 4) 13 CD 2 O (% 20 ağırlık / hacim) hafif ya da ağır dimetilasyon ile etiketlenmesi için numunelere sırasıyla ekleme . Tipik olarak, reaktif 4 uL peptidlerin 25 ug (Adım 4.2, 4.3, 4.6) ilave edilir.
  3. Sırasıyla hafif ve ağır dimetilasyon, etiketli örnekler, 24 mM NaBH3 CN ya da 24 mM NaBD 3 CN 8 uL ekleyin.
  4. Vorteks ve oda sıcaklığında ~ 10 dakika boyunca bir tüp çalkalayıcıda sallayın.
  5. 5 dakika için,% 1 amonyak (~% 28-30 h / h), 16 uL ilave reaksiyonları söndürüldü. Tipik olarak, reaktif 8 uL peptidlerin 25 ug ilave edilir.
  6. Yeniden asitleştirmek% 5 FA 8 uL eklenmesiyle reaksiyon karışımları (98% v / v).
  7. Altı numune toplam üretmek için hafif ve ağır dimetile peptidler (Şekil 1) birleştirin. Tablo 1 Bkz Bu çalışma için kullanılan örnek etiketleme ve havuzu bir açıklaması.
  8. adım 3.2 ve 3.3 uygun numune tuz giderme gerçekleştirin.

5. Isobaric Etiketleme (Lys kalıntıları)

  1. tri-etil amonyum bikarbonat (TEAB) tamponu (pH-8.5), 100 mM dimetile peptitlerin 100 ug (1 ug / ml) ile sulandırın.
  2. Imalatçının protokolünde belirtildiği gibi izobarik reaktifler hazırlayın (Malzeme / Reaktiflerin Tablo bakınız).
  3. ~ 10 s için peptidler ve vorteks çözündürülmüş izobarik reaktifler (41 uL) ilave edilir. Yaklaşık 1 saat boyunca bir mikro santrifüj tüpü çalkalayıcı üzerinde örnekleri çalkalayın. 8 uL hidroksilamin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca numune inkübe (ağırlık / hacim,% 10) ile olan reaksiyonları söndürün.
  4. bir sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de tek bir karışım ve tuzunun giderilmesi (Adım 3.1-3.3) veya deposuna altı etiketli örnekleri havuz.
    NOT: proteom kapsamını ve derinliğini artırmak için, çok boyutlu bir ayırma stratejisi önerilirgibi kuvvetli katyon değiştirme (SCX).

6. güçlü katyon alışveriş

  1. Üreticinin protokolü doğrultusunda SCX gerçekleştirin (Malzeme Tablo).
    1. amonyum format çözeltilerinin ~ 1 mL (20 mM, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM, ve 500 mM),% 10 asetonitril (ACN),% 0.1 FA (pH 3) ile hazırlanır.
    2. pipet üstünden kırmızı kapağını çıkarın ve ambalaj malzemesi pipet alt kısmına doğru olduğundan emin olmak için bulamaç ambalaj pipet dokunun.
      NOT: Kritik: protokolün sonuna kadar pipet kenara atma.
    3. bir mikro santrifüj tüpüne (2 mL) üst kısmına santrifüj adaptörünü ve iç pipet sabitleyin.
    4. pipet uçlarına SCX sulandırma tamponu 150 mcL ekleyin.
    5. Oda sıcaklığında (4,000 xg) 6 dakika pipet uçları santrifüjleyin. Bu adımı iki kez daha tekrarlayın ve atık atın.
    6. p çözündürülürSCX sulandırma 150 uL tampon içinde peptidlerin. pH değeri 3 olduğundan emin olun.
    7. pipet uçları, santrifüj (6.1.5 bakınız) peptidleri ekleyin ve eluent tutun.
    8. yeni bir mikro santrifüj tüpüne (2 mL) filtre ve pipet aktarın ve 20 mM amonyum format çözeltisinin 150 uL ekleyin. Oda sıcaklığında (4,000 xg) 6 dakika boyunca santrifüj ve eluent tutun.
    9. Adımı tekrar 6.1.8 ek yedi kez, amonyum format ardışık konsantrasyonlarda (yani, 40 mM, 60 mM, 80 mM, 100 mM, 150 mM, 250 mM ve 500 mM) kullanılarak.
  2. mikro santrifüj tüplerine (1.5 ml) sekiz SCX fraksiyonlar aktarın ve santrifüj buharlaştırma kullanarak bunları konsantre (adım 3.3).

7. Sıvı Kromatografi-Tandem Kütle Spektrometresi (LC-MS / MS) ve MS3

  1. % 0.1 FA, filtre ile kütle spektrometresi dereceli su peptitleri sulandırın ve bir otomatik numune şişesine koyun. foll olarak filtre peptidlerakımlarının:
    1. 0.65 um bir filtre ihtiva eden bir mikro santrifüj tüpüne yeniden peptidleri ekleyin (Malzeme Tablo).
    2. 1 dakika için 12,000 x g'de santrifüjleyin peptidler. Filtreyi çıkarın atmak ve bir oto-numune şişesine süzülür peptidler ekleyin.
  2. aşağıdaki mobil faz olarak tamponlar hazırlayın:% 3,% 0.1 FA (A) (v / v) ACN ve% 100 ACN% 0.1 FA (B).
  3. C18 malzeme (5 um, 200 A gözenek boyutu) ile 2 cm paketlenmiş tuzak kolonuna her SCX fraksiyon numunenin 6 uL enjekte edilir.
    Not: aşağıdaki gibi tuzak örnek bir temizlik: 3 dak,% 0 B; 2B, sıvı kromatografi sistemi kullanılarak 3 uL / dakika (Malzeme Tablo).
  4. analitik ayırma yöntemi çalıştırın. Cı-18 malzeme ile dolu, bir 75 um id x 13.2 cm lazer çekilmiş ucu eritilmiş silis kılcal kolonu (5 um, 100 A) kullanın. gradyanı: 0-5 dakika,% 10 B; 5-40 dakika,% 10-15 B; 40-90 dakika, 15-25% B; 90-115 dakika, 25-% 30 B; 115-130 dak, 30-60% B; 130-135 dak, 60-80% B; 135-145 dakika,% 80 B, 145-150 dak, 80-10% B; 150-180 dakika,% 10 B; 300 nL / dakika, 180 dakika.
  5. Analitik ayırma yöntemi çalışırken kütle spektrometresi için veri toplama çalıştırın.
    Not: 400-1,600 m / z, 60.000 çözünürlük, otomatik kazanç kontrol (AGC), 1 x 10 6 iyonları, maksimum püskürtme süresi 500 ms hedef aşağıdaki gibidir: MS araştırması tarama parametrelerdir. Aşağıdaki gibi CID-MS / MS parametreleri şunlardır: en 1-7 ya da en iyi 8-14 veri bağımlı alıcı (DDA), 3 m / z yalıtım genişliği, 500 minimum sinyal,% 35 normalize çarpışma enerjisi (NCE), 0.25 aktivasyon q , 10 ms'lik aktivasyon zaman, 3 x 10 4 AGC, 50 ms maksimum enjeksiyon süresi. Aşağıdaki gibi HCD-MS 3 için parametreler şunlardır: 200 minimum sinyal, 4 m / z izolasyon genişliği,% 60 NCE, 0.1 aktivasyon süresi, 3 x 10 5 AGC, 250 ms IT, 300-1,300 m / z MS / MS seçim aralığı un-parçalı ana iyonu dahil değildir.
  6. en 1-7 ve üst 8-14 koşular her ikisi için iki kopya halinde her bir analizi yapın.
    Not: örnekleri Orbitrap veya tribrid kütle spektrometresi içeren bir aletin yeni bir model ile çalıştırın DDA parametreler değişir ve daha çok MS / MS ve MS 3 tarama dahil etmek için optimize edilebilir. Buna ek olarak, tribrid araçlar için, eş zamanlı ön-seçimi (SPS) 3 kullanılması gerekmektedir -MS.

8. Veri Analizi 16

  1. Böyle fare UniProt gibi uygun bir veritabanına karşı protein analizi yazılımı kullanılarak RAW dosyalarını arayın.
    NOT: Hafif ve ağır dimetilated peptidler aramak için her RAW dosya için iki iş akışı oluşturmak için önemlidir.
  2. Aşağıdaki parametreler kullanılarak RAW dosyalarını Arama: iki cevapsız bölünmeler, peptid kütle aralığı 300-6.000 Da, 15 ppm, ana kütle toleransı, 1 Da parçalanma toleransı ile tripsin. Statik modifikasyonlar: açık dimetilasyon (28,031 peptit N-ucu) veya heavy dimetilasyon (36,076 Da, peptit N-ucu), carbamidomethyl (57,021 Da, C).
    Not: Bazı durumlarda ağır dimetile zirvesidir ~ 7 Da (35,069 Da, peptit N-ucu) ışık dimetile tepe noktasından ve böylece ağır dimetile peptidler için arama akışı içine dahil edilmelidir. Dinamik modifikasyonlar oksidasyon (15,995 Da, E), 6-karmaşık izobarik etiketi (229,163 Da, K). Yanlış keşif oranlarını elde etmek için bir yem veritabanı arama (örneğin 1, 5%) ve izobarik etiketlerin haberci iyon yoğunlukları aramak için kantitasyon düğümü içerir.
  3. istatistik
    1. amacıyla bir elektronik tablo programa İhracat verileri proteini raportör iyon değerlerini normalize etmek. Her bir protein için, sırası ile, iç standart iç standart veya ham raportör iyon yoğunluklarının ortalama oranı ile medyan raportör iyon oranlarına veya ham raportör iyon yoğunluklar ya bölün. Bu tür bir elektronik çizelge programı Pers olarak uygun istatistiksel yazılım kullanıneus, ya da R örnek koşullar arasında önemli değişiklikler tespit etmek.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT N-terminus lisin kalıntılarında etiket peptidleri kimyasal olarak amin bazlı kimyası kullanır ve örnek çoğullama kabiliyetini artırır. Şekil 2, bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden beyin, kalp, karaciğer ve bir doku 12-karmaşık cPILOT analizinden elde edilen temsili MS verilerini gösterir. Tablo 1'de gösterildiği gibi, Alzheimer hastalığı ve vahşi tip fareler için iki biyolojik çoğaltır Bu 12 plex analize dahil edilmişt...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

cPILOT fazla 12 farklı numune eş zamanlı olarak ölçülmesini sağlar. peptidlerin N-terminali ve hem de lizin kalıntılarının başarılı etiketleme sağlamak amacıyla, reaksiyonların her set için doğru pH değerine sahip olması ve peptit etiketleme için ilk dimetilasyon reaksiyonu gerçekleştirmek için zorunludur. N-ucunda seçici dimetilasyon (± 0.2) ~ 2.5 bir pH değerine sahip olması ile gerçekleştirilir. Bu lisin üzerindeki amino gruplarının pKa farklılıklarını ve N-terminali kullanılmasıyla elde edilir. pH değeri 2.5 'de...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar herhangi bir çıkar var.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar RASR için Pittsburgh Başlangıç ​​Fon Üniversitesi ve NIH, NIGMS R01 hibe (GM 117191-01) kabul eder.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Su - MS SınıfıFisher ScientificW6-44 L miktar gerekli değildir
Asetonitril - MS SınıfıFisher ScientificA955-44 L miktar gerekli değildir
Asetik AsitJ.T. Baker9508-01
Amonyum hidroksit çözeltisi (%28 - 30)Sigma Aldrich320145-500ML
Amonyum formatAcros Organics208-753-9
Formik AsitFluka Analitik94318-250ML-F
BCA protein tahlil kitiPierce Thermo Fisher Scientific23227
ÜreBiorad161-0731
TrisBiorad161-0716
Dithiothreiotol (DTT)Fisher ScientificBP172-5
İyodoasetamid (IAMAcros Organics144-48-9
L-SisteinSigma Aldrich, Kimya168149-25G
L-1-tosylamido-2 feniletil kolormetil keton (TPCK) ile tedavi edilen sığır pankreasından TripsinSigma Aldrich, Yaşam BilimleriT1426-100MG
Formaldehit (CH2< / sub>O) çözeltisi; H2O içinde %36,5 - 38Sigma Aldrich, Yaşam BilimleriF8775-25ML
Formaldehit (13< / sup>CD2< / sub>O) çözeltisi; ağırlıkça %20 D 2< / sub>O, 98 atom% D, 99 atom% 13< / sup>CSigma Aldrich, Kimya596388-1G
Sodyum Siyanoborohidrit; reaktif sınıfı, %95Sigma Aldrich156159-10G
Sodyum Cyanoborodeuteride; 96 atom % D, %98 CPSigma Aldrich, Kimya190020-1G
Güçlü Katyon Değişimi (SCX) spin uçları numune hazırlama kitiProtea BioSciencesSP-155-24kit
Trietil amonyum bikarbonat (TEAB) tamponuSigma Aldrich, Yaşam BilimleriT7408-100ML
İzobarik Etiketleme Kiti (TMT 6 plex) - 6 reaksiyon (1 x 0.8 mg)Thermo Fisher Scientific90061
Hidroksilamin hidroklorürSigma Aldrich, Kimya255580-100G
Standart girdap karıştırıcıFisher Scientific2215365herhangi bir karıştırıcı kullanılabilir
Oasis HLB 1 cc (10 mg) ekstraksiyon kartuşlarıSular186000383Bunlar C18 kartuşlardır
Visiprep SPE vakum manifoldu, DL (tek kullanımlık astar), 24 portlu modelSigma Aldrich5726512 portlu bir model de yeterlidir
Speed-vacThermo ScientificSPD1010herhangi bir marka speed vac yeterlidir
Su banyosu odasıThermo Scientific2825/2826Herhangi bir marka  kontrollü sıcaklıklara sahip bir su banyosu odası yeterlidir.
Mekanik Homojenizatör (yani FastPrep-24 5G)MP Biyomedikal116005500
Eksigent Nano LC - Nano LC AS-2 otomatik numune alma cihazı ile Ultra 2DSciex-Bumodel artık mevcut değil. Otomatik örnekleyiciye sahip herhangi bir nano LC yeterlidir.
LTQ Orbitrap Velos Kütle SpektrometresiThermoScientific-Bumodel artık mevcut değil. Diğer yüksek çözünürlüklü cihazlar (örn. Orbitrap Elite, Orbitrap Fusion veya Orbitrap Fusion Lumos) kullanılabilir.
Protein yazılımı (örn. Proteome Discoverer)Thermo ScientificIQLAAEGABSFAKJMAUH 
Analitik teraziMettler ToledoAL54
Karıştırma plakasıVWR12365-382Her marka karıştırma plakası yeterlidir
pH metre (Tris uyumlu)Fisher Scientific (Accumet)13-620-183Herhangi bir marka pH metre yeterlidir
pH 10 tamponuFisher Scientific06-664-261Herhangi bir marka pH tamponu 10 yeterlidir
pH 7 tamponFisher Scientific06-664-260Herhangi bir marka pH tamponu 7 yeterlidir
1.5 mL eppendorf tüpleri, 500 pkFisher Scientific05-408-129Herhangi bir marka 1.5 mL eppendorf tüpleri yeterlidir
0.6 mL eppendorf tüpleri, 500 pkFisher Scientific04-408-120Herhangi bir marka 0.6 mL eppendorf tüpleri yeterlidir
0.65 &mikro; m Ultrafree MC DV santrifüj filtre üniteleriEMD MilliporeUFC30DV00
2 mL mikrosantrifüj tüpler, 72 adetThermo Scientific69720
C18 ambalaj malzemesi (5  &mikro; m, 100 å)BrukerPM5/61100/000Bu ürün artık Bruker'de mevcut değil. Listelenen özelliklere sahip alternatif ambalaj malzemesi yeterli olacaktır
C < alt > 18 < / alt> ambalaj malzemesi (5 / nbsp; &mikro; m, 200 å)BrukerPM5/61200/000Bu ürün artık Bruker'de mevcut değil. Listelenen özelliklere sahip alternatif ambalaj malzemesi yeterli olacaktır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ong, S. -E., et al. Stable Isotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture, SILAC, as a Simple and Accurate Approach to Expression Proteomics. Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).
  2. Koehler, C. J., Arntzen, M. Ø, de Souza, G. A., Thiede, B. An Approach for Triplex-Isobaric Peptide Termini Labeling (Triplex-IPTL). Anal. Chem. 85 (4), 2478-2485 (2013).
  3. Langen, H. F., Evers, M., Wipf, S., Berndt, B., P, From Genome to Proteome 3rd Siena 2D Electrophoresis Meeting. , Wiley-VCH. Weinheim, Germany, Siena. (1998).
  4. Yao, X., Freas, A., Ramirez, J., Demirev, P. A., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Model Studies with Two Serotypes of Adenovirus. Anal. Chem. 73 (13), 2836-2842 (2001).
  5. Reynolds, K. J., Yao, X., Fenselau, C. Proteolytic 18O Labeling for Comparative Proteomics: Evaluation of Endoprotease Glu-C as the Catalytic Agent. J. Proteome Res. 1 (1), 27-33 (2002).
  6. Gygi, S. P., et al. Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags. Nat Biotech. 17 (10), 994-999 (1999).
  7. Schmidt, A., Kellermann, J., Lottspeich, F. A novel strategy for quantitative proteomics using isotope-coded protein labels. PROTEOMICS. 5 (1), 4-15 (2005).
  8. Thompson, A., et al. Tandem Mass Tags: A Novel Quantification Strategy for Comparative Analysis of Complex Protein Mixtures by MS/MS. Anal. Chem. 75 (8), 1895-1904 (2003).
  9. Ross, P. L., et al. Multiplexed Protein Quantitation in Saccharomyces cerevisiae Using Amine-reactive Isobaric Tagging Reagents. Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).
  10. Xiang, F., Ye, H., Chen, R., Fu, Q., Li, L. N,N-Dimethyl Leucines as Novel Isobaric Tandem Mass Tags for Quantitative Proteomics and Peptidomics. Anal. Chem. 82 (7), 2817-2825 (2010).
  11. Ting, L., Rad, R., Gygi, S. P., Haas, W. MS3 eliminates ratio distortion in isobaric multiplexed quantitative proteomics. Nat Meth. 8 (11), 937-940 (2011).
  12. McAlister, G. C., et al. Increasing the Multiplexing Capacity of TMTs Using Reporter Ion Isotopologues with Isobaric Masses. Anal. Chem. 84 (17), 7469-7478 (2012).
  13. Frost, D. C., Greer, T., Li, L. High-Resolution Enabled 12-Plex DiLeu Isobaric Tags for Quantitative Proteomics. Anal. Chem. 87 (3), 1646-1654 (2015).
  14. Robinson, R. A. S., Evans, A. R. Enhanced Sample Multiplexing for Nitrotyrosine-Modified Proteins Using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging. Anal. Chem. 84 (11), 4677-4686 (2012).
  15. Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Global combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) approach with selective MS(3) acquisition. Proteomics. 13 (22), 3267-3272 (2013).
  16. Evans, A. R., Gu, L., Guerrero, R., Robinson, R. A. S. Global cPILOT analysis of the APP/PS-1 mouse liver proteome. PROTEOMICS - Clin Appl. 9 (9-10), 872-884 (2015).
  17. Gu, L., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. Sample Multiplexing with Cysteine-Selective Approaches: cysDML and cPILOT. J. Am. Soc Mass Spectrom. 26 (4), 615-630 (2015).
  18. Dephoure, N., Gygi, S. P. Hyperplexing: A Method for Higher-Order Multiplexed Quantitative Proteomics Provides a Map of the Dynamic Response to Rapamycin in Yeast. Sci Signal. 5 (217), rs2(2012).
  19. Hebert, A. S., et al. Neutron-encoded mass signatures for multiplexed proteome quantification. Nat Meth. 10 (4), 332-334 (2013).
  20. Merrill, A. E., et al. NeuCode Labels for Relative Protein Quantification. Mol Cell Proteomics. 13 (9), 2503-2512 (2014).
  21. Braun, C. R., et al. Generation of Multiple Reporter Ions from a Single Isobaric Reagent Increases Multiplexing Capacity for Quantitative Proteomics. Analytical Chemistry. 87 (19), 9855-9863 (2015).
  22. Everley, R. A., Kunz, R. C., McAllister, F. E., Gygi, S. P. Increasing Throughput in Targeted Proteomics Assays: 54-Plex Quantitation in a Single Mass Spectrometry Run. Anal. Chem. 85 (11), 5340-5346 (2013).
  23. Gu, L., Robinson, R. A. S. High-throughput endogenous measurement of S-nitrosylation in Alzheimer's disease using oxidized cysteine-selective cPILOT. Analyst. 141 (12), 3904-3915 (2016).
  24. Cao, Z., Evans, A. R., Robinson, R. A. S. MS3-based quantitative proteomics using pulsed-Q dissociation. Rapid Commun Mass Spectrom. 29 (11), 1025-1030 (2015).
  25. Swaney, D. L., Wenger, C. D., Coon, J. J. Value of Using Multiple Proteases for Large-Scale Mass Spectrometry-Based Proteomics. J. Proteome Res. 9 (3), 1323-1329 (2010).
  26. McAlister, G. C., et al. MultiNotch MS3 Enables Accurate, Sensitive, and Multiplexed Detection of Differential Expression across Cancer Cell Line Proteomes. Anal. Chem. 86 (14), 7150-7158 (2014).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Dimethylation LabelingProteomics AnalysisTissue HomogenizationStrong Cation ExchangeMass SpectrometryAlzheimer Disease ModelBiological Replicates

İlgili makaleler