Mikroakışkan Aygıtlar Kullanma Tek Budding Maya Hücreleri ömrü ve Hücresel fenotipleri Ölçmek için

mayayı tomurcuklanan araştırma yaşlanma güçlü bir model organizmadır. Bununla birlikte, mayada, geleneksel bir ömrü deneyi sadece emek yoğun değil, aynı zamanda, düşük ^{verimlilik, 1, 2} olan mikrodiseksiyon dayanır. yaşlandıkça Ayrıca, geleneksel mikrodiseksiyon yaklaşım bekar bir anne hücrelerde çeşitli hücresel ve moleküler özelliklerinin ayrıntılı bir görünümünü sağlamaz. Mikro-akışkan cihazlarının gelişimi maya ömrü ölçmek için hem de ana ^{hücreleri, 3, 4, 5, 6, 7, 8,} ömrü boyunca moleküler işaretçileri ve çeşitli hücre fenotipleri takip otomatik bir prosedür sağladı. Maya hücreleri, bir mikro-akışkan cihazın içine yüklendikten sonra, bunlar otomatik zaman tur kullanılarak mikroskop altında izlenebilenE görüntüleme. Işleme araçları görüntülenmesi sayesinde, çeşitli hücresel ve moleküler ^{fenotipleri, 3} elde edilebilir ^{6 kullanılarak} elde edilmesi zor veya imkansız olan birçok vb ömrü, boyut, floresan haberci, hücre morfolojisi, hücre döngüsü dinamiği, dahil olmak üzere, ^8, geleneksel mikrodiseksiyon yöntemi. Mikroakışkan cihazlar birkaç yıl önce ^{3, 4, 6, 7} başarılı gelişme beri maya yaşlanma araştırmalarında önem kazanmıştır. Çeşitli gruplar sonradan daha erken tasarımları ⁵ varyasyonları yayınlanan ve birçok maya laboratuarları kendi çalışma için microfluidic cihazlar kullanmışlardır.

üstel büyümeyi geçiren bir hücre kültüründe, gözlem için mevcuttur yaşlı anne hücre sayısı miniscu olduğunule. Bu nedenle, ömrü ölçümler için mikro-akışkan cihazının genel tasarım prensibi anne hücreleri korumak için ve kızı hücreleri kaldırmaktır. Bu tür tasarımlar maya asimetrik hücre bölünmesini uğrar gerçeği kullanır. Cihaz irade kapanı büyük anne hücrelerinde yapı ve izin küçük kızı hücreleri uzakta yıkanacak. Bu makalede açıklanan mikro-akışkan çip tuzak ana hücrelere yumuşak polidimetilsiloksan (PDMS) ped (dikey sarkık sütun) (Şekil 1) kullanır. Benzer bir tasarıma sahip cihazlar daha önce ^{3, 4, 6, 7} bildirilmiştir. Bu protokol microfluidic cihazlar ve zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için optimize edilmiş basit bir hücre yükleme yöntemi üretmek için daha basit bir prosedür kullanır. mikroakışkan cihaz önemli parametrelerden biri tuzak ana hücrelere kullanılan PDMS pedleri genişliğidir. Bizim dihaz hayatları boyunca izlenebilir taze anne hücrelerinin önemli bir kısmı dahil olmak üzere her yastık altında daha anne hücreleri tutabilir geniş yastıkları kullanır. Hücreler nesiller veya tüm ömrü boyunca bir gözlem gereklidir için izlenmesi gereken zaman ömrü ölçümlerine ek olarak, bu protokol, tek bir hücre zaman atlamalı görüntüleme deneyleri için kullanışlıdır.

1. Silikon Gofret Kalıp İmalat

NOT: Işık maskesi AutoCAD yazılımı ile tasarlandı ve ticari bir firma tarafından üretilmektedir. Bu tasarım farklı desenler (üç kat içerir Ek İçerik 1 ). Birinci, ikinci ve üçüncü tabakaların yükseklikleri sırasıyla yaklaşık 4 um, 10 um ve 50 um olan. Silikon gofret kalıp yumuşak litografi ^{9, 10} kullanılarak photomask oluşturuldu.

1. 10 dk su buharı buharlaşması için 200 ° C'da bir silikon gofret pişiriniz. Spin kat negatif fotorezist SU-8 silikon gofret üzerine.
   Not: Spin kat SU-8 3005, 30 ilk bir tabaka oluşturmak için 5000 rpm'de, SU-8 2010 3000 rpm'de 30 ikinci bir tabaka oluşturmak için, ve SU-8 3025 2,000 rpm'de 30 saniye üretmek için üçüncü tabaka.
2. t önce kaplanmış gofret Yumuşak fırındaDesen transferini diye. Hizalayın ve bir maske hizalama kullanarak "doğrudan temas" modunda gofret maruz.
   Not: Yumuşak fırında birinci tabaka, 95 ° C'de 2 dakika, ikinci tabaka 95 ° C 'de 3 dakika, ve üçüncü tabaka için 95 ° C' de 15 dakika süre ile çok ince bisküvi. 100 mJ / Birinci tabaka için ^cm2, 130 mJ / ikinci katman için ^cm2 ve 200 mJ / üçüncü katmanın için ^cm2'de maruz doz kullanın.
3. maruziyet sonrasında gofreti sonrası pişir ve SU-8 geliştirici kullanarak geliştirmek. _N2 silah ve sert fırında 30 dakika 200 ° C 'de çok ince bisküvi ile gofret kurutun.
   Not: silikon gofret kalıp model tarafı yukarı bakacak şekilde, File bandı kullanılarak 15 cm çaplı plastik Petri kabına sabitlenmiştir. Genellikle, çok sayıda mikro-akışkan kartları aynı zamanda imal edilmesini sağlar aynı kalıp, birçok aynı çip yapıları koydu. Her bir kalıp mikroakışkan fiş imal etmek için pek çok kez yeniden kullanılabilmektedir.

2. mikroakışkanÇip Fabrikasyon

1. Bir denge üzerinde temiz bir tartı tekne yerleştirin ve dengeyi daralayın. tartmak tekne içine PDMS tabanının 50 g dökün.
2. tartı teknesinde PDMS kürleme maddesi, 5 g ekleyin (ağırlık / PDMS tabanına 1:10 oranında ağırlık).
   NOT: Bu hacim, kalıp ile bir 15 cm çaplı bir Petri tabağına dayanır. Farklı büyüklükte bir petri kabı kullanarak, eğer reaktif miktarını ayarlayın.
3. PDMS tabanı ve tek kullanımlık bir pipet ile sertleştirme ajanı karıştırılır. tartım kabı kenarından başlayıp yavaş yavaş içeri doğru hareket eder. küçük kabarcıklar karışım boyunca meydana kadar birkaç dakika süreyle iyice karıştırılır; Karışımın tam PDMS polimerizasyonu için esastır.
4. yavaş Petri kabı içine dökün; Karışım, tam olarak silikon gofret kalıp kapsamalıdır.
5. 10 dakika PDMS karışımından tüm hava kabarcıklarını çıkarmak için bir vakum içinde Petri tabağına yerleştirin. kabarcıklar karışımın yüzeyinde kalır ise, onları dışarı üflemek için bir pipet kullanın.
6. silikon inkübeyaklaşık 2 saat süreyle 75 ° C'de bir fırın içinde PDMS ile gofret kalıbı.
7. Yavaşça gofret kalıp yapımı için herhangi bir zarar vermeden, silikon gofret kalıp kapalı polimerize PDMS tabaka soyun. Seçenek olarak ise, bir tek kenarlı endüstriyel jilet kullanılarak desen etrafında en az 5 mm aralık ile silikon gofret kalıp şirketinden PDMS kesme; hafifçe gofret kalıp kapalı PDMS katmanı soyun.
8. model tarafı yukarı bakacak şekilde tezgah PDMS tabaka yerleştirin. Dikkatle yapı hasarı önlemek için her bir çip kenarından uygun bir devamlılığının bir tek kenar endüstriyel jilet ile tek tek çip kesip.
9. yukarı bakacak şekilde model tarafı, her bir kanal tarafına düz bir şekilde giriş ve çıkış çevrelerine boyunca delikler bir zımba kalem (0.75 mm İD) kullanın.
   NOT: Bu delikler ortamın akışı için yol oluşturun. Nedenle, çevrelerinde geçmesi ve PDMS tabakasının içinden tüm yol yumruk için çok önemlidir. Emin oldelikten PDMS sütunları kaldırın.
10. deliğe tekrar delme kalem iğne sokarak her delinmiş delik edin. İğne herhangi bir blokaj bulunmamaktadır belirten diğer taraftan dışarı gelebilir emin olun. Desen yüzeye bant uygulama yavaşça toz parçacıklarını temizlemek için bant soyulabilir. bu adımı en az üç kez tekrarlayın. sterilizasyonu korumak için PDMS üzerinde viski bant temiz bir parça bırakın.
11. PDMS'den karşı tarafında bu işlemi tekrarlayın ve yanı üzerine bant son dilimini bırakın.
12. 0,13-0,17 mm kalınlığında, 24 mm x 30 mm kapak camı hazırlayın. yüzey sterilize etmek için toz sökücü ile cam üzerinde% 70 etanol püskürtme ve kurutma; buna ek olarak, cam otoklavlanmış su ile yıkandı ve toz sökücü ile kurutulabilir.
13. Plastik bir plakaya kapak cam ve PDMS aktarın. PDMS viski bandını çıkarın ve yukarı bakacak desen tarafını yerleştirin. Aktarım sırasında desen yüzeye sahip herhangi bir temastan kaçının.
14. Dikkatle hidrofilik yüzeyler (plazma işlemi sırasında karşılaştığı yüzeyler), bağlantı, kapak camı üzerine PDMS yerleştirin. PDMS ve kapak cam arasında hava kabarcığı olmadığından emin olun.
15. en az 2 saat boyunca 75 ° C'de bir fırın içinde PDMS çip inkübe edin.
    Not: Eksik mikro sıvılaştırma deney sırasında mikroskop üzerine sızıntıya neden olabilir. Bu nedenle, biraz cımbız ile kenarlarından PDMS kaldırarak PDMS ve kapak camı arasındaki bağı kontrol edilmesi önemlidir. Yavaşça başarılı bağı belirten kapak camı ayırmak gerektiğini PDMS kaldırarak.

3. Deney hazırlığı

1. % 70 etanol çözeltisi ayrıca PDMS çip hazırlanmasından önce 1 gün içinde giriş ve çıkış boruları daldırın.
2. tüpleri yıkamak için otoklava su ile 5 ml şırınga doldurun. şırınga üzerindeki tüp takmayı ve su ile tüp ateş basması her tüp yıkayın.
3. etanol kalıntısını temizlemek için, yıkama adımı en az 3 kez tekrarlayın.

Deneylerden sonra, hücreler ve birçok hücresel ve moleküler fenotipleri yaşam süreleri kaydedilmiş zaman atlamalı görüntüleri elde edilebilir. her bir hücreden ekstre edilebilir, farklı bir dizi özellik olduğundan, analiz ilk adım, pozisyonları ve hücre sınırları ve izlenen çeşitli olayların zamanlama dahil olmak üzere hücreleri ve olayları, açıklama şekildedir tomurcuklanan olaylar olarak. Bu ek açıklamalar daha kolay gelecekte farklı özelliklere hücrelerin aynı setine dönmek ve analiz etmek için yapacaktır. Gibi ImageJ 11 ve ilgili eklentileri, görüntü analizi yazılımını kullanarak, fenotiplerin listesi daha sonra hücrelerin kayıt açıklamaları kullanarak resim verilerinden elde edilebilir.

mikroakışkan cihazı ile ölçülen fenotipleri birkaç örnek aşağıda verilmiştir. maya ömrü fenotipiHer hapsolmuş ana hücre tarafından üretilen tomurcukları sayısının sayılması ve Kaplan-Meier tahmin ile tahmin edilerek elde edilebilir. Başlangıçta mikroakışkan cihazlar içinde sıkışıp hücreler bilinmeyen yaştan bulunmaktadır. Bu bilinmeyen yaş gelen ömrü ölçümlerinin verevi en aza indirmek için, daha önceki yöntemler ömrü 4, 7 kalibre Yakalanan hücreleri üzerinde tomurcuk izleri ortalama sayısı kullanılır. Ancak, tomurcuk yara ölçümleri hücrelerin ilave boyanma gerektiren ve önyargı sadece dolaylı bir tahmin sağlayabilir. Bu protokolü kullanarak, cihaz sık zaten tuzağa hücrelerden kapalı budded taze kızı hücrelerini hapseder. Bu hücreler daha sonra anne hücrelerine dönüşür. Bu tür hücreler bizim mansap görüntü analiz yazılımı (Film 1) kullanılarak tespit edilebilir. Bunlar taze anne hücreleri daha doğru bir ömrü ölçümü sağlar. Şekil 2'de gösterildiği gibi, taze ana hücrelerin ömrü eğrileri iştigal edildibilinmeyen yaş hücrelerin olanlarla kırmızı. Bu deneyde, taze anne hücrelerinin ortalama ömrü (medyan ömrü farkı yaklaşık 2 kuşak) biraz daha uzundu.

Tomurcukları, Şekil 3'te gösterildiği gibi, iki ardışık tomurcuklanan olaylar arasındaki zaman aralığı olarak diğer ilginç fenotip, sayısına ek olarak, görüntüleme verileri 3, 7, 8 elde edilebilir. Hücreler daha yavaş bir kaç başlangıç ​​buddings aşağıdaki hızlı tomurcuklanma dönemine girdi. tomurcuklanma bu yaş hücrelerin sağlıksız durumunu belirten yaşamlarının sonuna doğru dramatik yavaşladı. Hücre döngüsü dinamikleri genç ve yaşlı hücrelerin hücresel durumuna dair çok faydalı bilgiler içerir ve telomeraz mutantlar 12 karakterize etmek, örneğin, kullanılmıştır. Önemli olan, bu cihaz olabiliryaşlanma sürecinin bir sürücü olabilir moleküler markörlerin takibi için izin ömrü (Şekil 4) boyunca floresan sinyalleri ölçmek için kullanılır.

Şekil 1: mikro-akışkan cihazının tasarımının şematik bir. Cihaz paralel olarak çalışabilir 6 bağımsız fonksiyonel modülden oluşmaktadır. Her bir modül, iki yan kanallara bağlı bir ana kanal yapılmıştır. Her bir yan kanal 113 sarkık sütun bulunmaktadır. Ek bir köprü, iki yan kanallar ile ana kanal bağlamak için orta ilave edilir. Daha küçük kızı hücreleri uzakta akışı ile yıkanır ise anne hücreleri pensile sütunlar altında sıkışıp vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 3: yaş hücre olarak aralıkları değişiklik tomurcuklanan uzunluğu. buddings arasındaki zaman dilimlerinde olarak ölçülen tomurcuklanma aralıkları renk kodlu, hücreler kendi çoğaltma ömrü tarafından emredildi edildi ve taze anne hücreleri Eylül edildibilinmeyen tarihin hücrelerinden arated. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: bir mikro akışkan cihazı kullanılarak Isı Şoku Faktör 1 (HSF1) aktivitesini ölçer. Hsf1-aktivite raportör HSE yukarı 13 ile sakat CYC1 promotöre kaynaşık, yeşil floresan proteini (GFP) ile inşa edilmiştir. Floresan görüntüleri her 30 dakikada alındı. GFP yoğunluğu daha sonra bir özel MATLAB 14 kullanılarak belirlenmiştir. her bir hücre için veri noktaları bağlı ve bir renkli hat ile gösterilir. Bu deneyde, soy bir gece boyunca 30 ° C'de% 2 glikoz (ağırlık / hacim) ile SD ortamı içinde büyütülmüştür; bu daha sonra geri kazanımı için aynı ortam ile seyreltildi. sonrasında,% 0.05 glukoz (ağırlık / hacim) ile SD ortamı floresans ölçüm sırasında mikro akışkan çip hücrelerin büyümesi için kullanılmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Film 1: Taze anne hücrelerinin bir örneği bütün ömrü boyunca cihazın içinde hapsolmak. Film bir tuzağa hücreden doğan bir taze anne hücreyi gösterir. Filmin başında kırmızı ok taze anne hücre ve ilk tomurcuklanma konumunu işaretler. Bu anne hücresi onun bütün ömrü boyunca mikroakışkan cihaz sıkışıp oldu. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız. (Indirmek için sağ tıklatın.)

Yazarlar, rekabet eden hiçbir finansal çıkarları olmadığını beyan ederler.