Yöntem makalesi

Antikor conjugates ilk değerlendirilmesi ile Viral kaynaklı peptidler hücresel birikimi artan ve tümör hedefleme artırmak için değiştirilmiş

DOI:

10.3791/55440

⸱

8 Mart 2018

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Nuclear Medicine and Radiobiology, Université de Sherbrooke, 2Sherbrooke Molecular Imaging Center (CIMS), Université de Sherbrooke, 3Sherbrooke Institute of Pharmacology

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikor-conjugates için (ACs) birleştiğinde Viral kaynaklı peptidler, moleküler yükleri artan tümör hücre birikmesi ile teslim etme potansiyeli nedeniyle ivme kazanıyor bir yaklaşım var. Peptid konjügasyon, AC ve hücre içi yük birikimi ve tümör hedefleme değerlendirmek için ortak yöntemleri kullanarak, bu protokolü anahtar ilk geliştirme aşamalarında araştırmacılar yardımcı olur.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikor-virüs kaynaklı peptidler ile modifiye conjugates (ACs) tümör hücre teslimat maddeleri, kanser tedavisinde kullanılan ve artan hücresel birikimi nedeniyle üzerinde geçerli ACs Imaging moleküler yükleri için potansiyel olarak güçlü bir sınıfıdır. Sırasında erken AC vitro geliştirme, Floresans teknikleri ve radioimmunoassays hücre içi yerelleştirme, birikimi verimlilik ve hedef hücre özgüllük belirlemek için yeterlidir. Şu anda, hücreleri AC hücre içi birikimi ve yerelleştirme değerlendirmek için hazırlanması için standart yöntemleri üzerinde hiçbir fikir birliği yoktur. Özellikle birkaç aday inşa edilmiştir Eğer virüs kaynaklı peptidler ile modifiye ACs ilk test önemlidir. Hücre içi birikimi Floresans tarafından belirlenmesi ACs arka plan sinyalini hücre yüzeyinde tarafından etkilenen ve birikimi yorumlanması karmaşık. Radioimmunoassays, genellikle tedavi hücreleri şeker ve farklı hücre bölmeleri radyoaktivite ölçülür. Ancak, hücre hücre hücre lizis değişir ve genellikle nükleer ve sitoplazmik bölmeleri yeterince izole değildir. Bu yanıltıcı veri yükü teslim özellikleri oluşturabilir. Radiolabeled virüs kaynaklı peptid-modified ACs radyonüklid görüntüleme tarafından izledi farelerin taşıyan tümör olarak intravenöz enjeksiyon vivo içinde aşamasında tümör hedefleme ve yükü teslim özelliklerinin belirlenmesi için güçlü bir yöntemdir geliştirme. Ancak, bu görece yeni bir ilerleme ve birkaç gruplar virüs kaynaklı peptid-modified ACs bu şekilde değerlendirdi. Peptid-modified AC birikimi virüs kaynaklı confocal mikroskobu ve radioimmunoassays kullanırken daha doğru bir şekilde değerlendirmek için işlem görmüş hücreleri işlenmesi açıklayın. Özellikle, hücre yüzeyine kaldırmak trypsinizing hücreler için bir yöntem ACs bağlı. Ayrıca hücresel ayırma geliştirmek için bir yöntem sağlar. Son olarak, bu protokolü ilk tümör tümör taşıyan farelerde özellikleri hedefleme değerlendirmek için Pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanarak bir vivo içinde yöntemi sağlar. Radyoizotop 64Cu kullandığımız (t1/2 = 12,7 h) olarak bu iletişim kuralı bir örnek yükünde.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Antikor-conjugates (ACs) etkili ilaçlar kanser tedavileri geliştirmek için ve tümör tespit için dönüştürücü bir sınıfının içine olgunlaşması Biyofarmasötikler vardır. Monoklonal radioisotopes, küçük moleküller ve biyolojik toksinler gibi moleküler yükleri için Birleşik antikor (mAb) oluşur, ACs bu yükleri kanser hücrelerinin enfes hedef antijen benzeşme ve özgüllük ile teslim etmek mümkün. Böylece ACs olasılığını önemli ölçüde nonspesifik toksisite azaltmak ve tümör sitesinde yükü aktivite artışı var. Tedavi amaçlı, sitotoksik küçük moleküller (antikor-uyuşturucu conjugates olarak yaygın olarak anılacaktır) taşıma ACs geleneksel tedaviler 1

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Açıklanan in vivo hayvan deneyleri bir onaylanmış protokolüne göre ve merkezi Hospitalier Universitaire de Sherbrooke Etik Komitesi için hayvan deneyleri Etik kurallar altında yapıldı.

1. antikor peptid konjugasyon

Not: ChAcNLS herhangi bir ticari peptid üretici veya üniversite bağlı peptid sentez bir hizmet platformu sentez. ChAcNLS sentezi başvuru 34bulunabilir. Yordamlar 1 ve 2 için 7 g 3, mAb lösemi antijen IL-3Rα 39için belirli olan kullanın.

  1. 1.7 mL microcentrifuge tüp bir 10 mg/mL (~ 1 mg toplam antikor) çözüm 7 g 3 fosfat tamponlu tuz (PBS)....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yordam 1 için 7 g 3 inşaatı bir crosslinker çok güvenilir olduğu gibi sulfo-SMCC kullanarak ChAcNLS ile değiştirilmiş. Genellikle, bir % 12 jel yüklenen ve SDS-PAGE tarafından analiz, MW sulfo-SMCC-- 7 g-3 oranları artırmak için orantılı olarak ayırt kademeli artar bu sonuçlarında kullanılan ve ChAcNLS için ayrı ayrı değerlendirilmesi ağır ve hafif zincirleri için izin verir fiil (şekil 3

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Anti-kanser ajanı sistemik teslimini büyük hedefleri birikimi tümör site ve kanser hücrelerinin içinde alımını artırmak ve sağlıklı dokularda istenmeyen yan etkileri azaltmak için vardır. Tümör hücreleri moleküler yüklerini hedef AC teslim tedavi ve tümör tespit için çok umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, etkinlik eksikliği endosome tuzak tarafından neden olduğu ve önemli bir meydan okuma, akış lizozomal bozulması kalır. Yeni nesil ACs inşası için bir örnek ChAcNLS peptid bu protokolü kullanır, açıklanan yordamları uyar.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa yoktur

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu eser Kanser Araştırma Derneği (Kanada) ve CIMS tarafından finanse edildi. Yazarlar Dr Samia AIT-Mohand ve Jean-François Beaudoin yardım için teşekkür ederiz. Dr. melek Lopez (Üniversitesi Güney Avustralya) mAb A14 için.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Sulfo-SMCCThermo Scientific22122Aralarından seçim yapabileceğiniz birçok homo ve hetero iki işlevli maleimid çapraz bağlayıcı vardır.
Amicon Ultra-0.5 mL Santrifüj FiltrelerEMD MilliporeUFC5050968, 24 ve 96'lık paket boyutları vardır. İhtiyaçlarınıza göre seçin.
Precision Plus Protein Kaleydoskop StandartlarıBioRad1610375EDU10 - 250 kDa arası Mulicolor rekombinant proteinler.
Tripsin-EDTA (% 0.25), fenol kırmızısıThermo Scientific25200056100 veya 500 mL hacimler arasından seçim yapabilirsiniz.
Keçi anti-Fare IgG (H + L) İkincil Antikoru, Alexa Fluor 647 konjugeThermo ScientificA-212351 - 10 & mu; g/mL önerilen
NOTA-NHSCheMatechC100
Lamin A/C antikoru (N-18)Santa Cruz Biyoteknolojisc-6215
Rab7 antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-376362
A14 mAbBD Biosciences555902
NuPAGE LDS Numune Tamponu (4x)Thermo ScientificNP0007
2- MerkaptoetanolSigma AldrichM3148-25ML TF-1a
hücreleriATCCATCC CRL-2003
RPMI 1640 ortaATCCATCC 30-2001
RIPA lizis ve ekstraksiyon tamponuThermo Scientific89900
AMIDE tıbbi görüntüleme yazılımıamide.sourceforge.netücretsiz indirme
FluoView FV1000 Konfokal MikroskopOlympus
Fluoview YazılımıOlympuswww.olympus-lifescience.com
ITLC şeritleriBiodex150-771
adresinde mevcuttur Tamamen

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Verma, S., et al. Trastuzumab emtansine for HER2-positive advanced breast cancer. New England Journal of Medicine. 367 (19), 1783-1791 (2012).
  2. Younes, A., et al. Results of a pivotal....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Antibody ConjugatesCellular AccumulationConfocal MicroscopyRadioimmunoassaysPET ImagingCell FractionationTrypsinizationNuclear LocalizationTumor TargetingFluorescence Microscopy

İlgili makaleler