Yöntem makalesi

Fare embriyonik fibroblastlar transkripsiyon faktör aracılı yeniden programlanması sonra kardiyomiyosit alt tiplerini değerlendirilmesi

7K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55456

⸱

22 Mart 2017

 , 
1Department of Internal Medicine- Cardiology, UT Southwestern Medical Center

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5'in retrovirüs aracılı bir iletimini kullanarak çeşitli yeniden programlanmış kardiyak alt tiplerin oluşturulması ve ölçülmesi için adım adım bir protokolü açıklar.

Özet

Bir hücre tipinin diğerine doğrudan yeniden programlanması, son zamanlarda rejeneratif tıp, hastalık modellemesi ve soy spesifikasyonu için güçlü bir paradigma olarak ortaya çıkmıştır. Özellikle, fibroblastların Gata4, Hand2, Mef2c ve Tbx5 (GHMT) tarafından indüklenmiş kardiyomiyosit benzeri miyositlere (iCLM'ler) dönüştürülmesi, in vitro ve in vivo olarak de novo kardiyak miyositler oluşturmak için önemli bir yolu temsil eder. Son kanıtlar, GHMT'nin daha önce takdir edilenden daha fazla kardiyak alt tip çeşitliliği ürettiğini ve bu nedenle ek çalışmalar yürütmek için sistematik bir yaklaşıma duyulan ihtiyacın altını çizdiğini göstermektedir. Bununla birlikte, doğrudan yeniden programlama terapötik bir strateji olarak kullanılmadan önce, spesifik kardiyak alt tipler oluşturmak için soy dönüşümünün mekanik temelleri ayrıntılı olarak anlaşılmalıdır. Burada, fare embriyonik fibroblastlarının (MEF'ler) GHMT aracılı yeniden programlanması yoluyla iCLM'lerin üretilmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Verimli yeniden programlamayı gerçekleştirmek için MEF izolasyonu, retroviral üretim ve MEF enfeksiyonu yöntemlerini özetliyoruz. Yeniden programlanmış hücrelerin alt tip kimliğini belirlemek için, tanımlanmış bir dizi uyumlu antikor kullanarak iCLM'ler üzerinde immünositokimya gerçekleştirmek için adım adım bir yaklaşımı detaylandırıyoruz. iCLM'lerin ve bireysel atriyal (iAM), ventriküler (iVM) ve kalp pili (iPM) alt tiplerinin konfokal mikroskopi, tanımlanması ve miktar tayini için yöntemler de sunulmaktadır. Son olarak, prototipik doğrudan yeniden programlama deneylerinin temsili sonuçlarını tartışıyoruz ve verimli soy dönüşümünü sağlamak için protokolümüzün önemli teknik yönlerini vurguluyoruz. Birlikte ele alındığında, optimize edilmiş protokolümüz, araştırmacıların bireysel CM alt tiplerinin tanımlanmasını gerektiren anlamlı kardiyak yeniden programlama deneyleri yürütmeleri için aşamalı bir yaklaşım sağlamalıdır.

Giriş

Kalp embriyo 1, 2 geliştirmek için ilk fonksiyonel bir organdır. dolaşım sistemi ile birlikte, bu oksijen, besin ve geliştirme sırasında bir atık bertaraf mekanizması sağlamaktadır. Üç hafta döllenmeden sonra, insan kalbi ilk kez yener ve onun uygun düzenleme kardiyomiyositlerde (CMS) tarafından yapılmaktadır. Bu özel hücrelerin geri dönüşümsüz kaybı dolayısıyla ilerici kalp yetmezliği altında yatan temel bir konudur. Böyle Zebra balığı ve Xenopus gibi bazı organizmaların kalp rejenerasyon potansiyeli varken, yetişkin memeli kalp 3, 5, 6 daha sınırlıdır. Böylece, kalbin kritik işlevi göz önüne alındığında, kalp hastalığı tek başına 7 Amerika Birleşik Devletleri'nde 600.000 ölüm için muhasebe, dünyada önde gelen ölüm nedeni olduğunu şaşırtıcı değildir.verimli tamir veya yaralı miyokard yerine refore, hücre bazlı terapiler büyük bir klinik öneme sahiptir.

Yamanaka ve arkadaşları 8 seminal Çalışma dört transkripsiyon faktörlerinin zorla ifade pluripotent kök hücreleri tamamen farklılaşmış fibroblast hücrelerini dönüştürmek için yeterli olduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, tüm pluripotent kök hücre stratejilerinin tümörijenik kapasitesi terapötik amaçlar için kullanımı ile önemli bir sorun olmuştur. Bu bir pluripotent sahne kaçınarak alternatif yöntemler hücrelerin transdifferentiate için aramak için bilimsel alanını motive etti. Son zamanlarda, çeşitli gruplar transkripsiyon ektopik ifadesi ile uyarılan kardiyomiyosit-benzeri hücreler (iCLMs) fare fibroblast doğrudan dönüşüm göstererek bu stratejinin uygulanabilirliğini göstermiştir Gata4, Mef2c Tbx5 ve daha sonra, Hand2 (GMT ve GHMT faktörleri sırasıyla) 9, 10. furthermore aynı strateji, in vivo olarak, insan-türevi doku 9, 11, 12 gerçekleştirilebilir. Son çalışmalar, ek faktörler ya da daha fazla kalp yeniden programlama verim 13, 14, 15 geliştirmek için modüle edilebilir yolakları sermiştir. Birlikte ele alındığında, bu çalışmalar rejeneratif tedaviler için yönlendirilmiş transdiferansiyonun potansiyelini göstermektedir. Ancak, metodolojik farklılıklara 16 CM yeniden programlama, bilinmeyen moleküler mekanizmaları, tutarsız tekrarlanabilirlik düşük verimlilik ve iCLMs heterojen yapısı adressiz kalır.

şirketinden iCLM heterojen değerlendirmek için biz sarkomer gelişimi ve kardiyak nesilli Specificatio tanımlanması için ayrı ve sağlam tek hücreli deneyi tasarlanmıştırN-iki fonksiyonel kardiyomiyositlerde gerekli özellikleri. Atriyal (AM), ventriküler (VM) ve kalp pili (PM) 17, 18, 19, 20: konumlarını ve eşsiz elektriksel özellikleri ile tanımlanan kalbinde CM en az üç ana tipi vardır. Bir orkestra birlikte, onlar kan düzgün pompalama sağlar. Kalp yaralanması sırasında, bir veya tüm alt tipleri etkilenebilir ve hücre tedavisi tip bir vaka ile ayrı ayrı ele alınması gerekir. az iş alt tipi özellikleri düzenleyen moleküler mekanizmaları incelemek için yapılırken Şu anda, en stratejileri, kardiyomiyositlerinin genel nesil odaklanmak.

Aşağıdaki çalışma düzgün iyi organize sarkomer ölçmek kardiyomyosit alt tiplerinin çeşitli bir dizi tanımlamak için nasıl ayrıntıları. Kalp pili (PM) 'e özgü muhabir Fareyi kullanarak, biz bir i uygulamak mümkünmmunocytochemical yaklaşım kaynaklı atriyal benzeri miyositleri (IAM), uyarılmış ventriküler benzeri miyositleri (IVM) ve uyarılmış PM benzeri miyositleri (IPMS) 21 ayırt etmek. Bizim gözlemlere dayanarak sadece sarkomer organizasyonu sergileyen hücreler spontan dayak yeteneğine sahiptirler. Bu eşsiz yeniden programlama platformu rolünü değerlendirmek için izin verir tek hücreli çözünürlükte sarkomer organizasyonu, alt tip şartname ve CM yeniden programlama verimliliği belli parametreleri.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvan uygulamaları içeren tüm deneysel prosedürleri UT Güneybatı Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.

Hcn4-GFP E12.5 Fare Embriyonik Fibroplastı 1. izolasyonu (MEFS)

  1. homozigot Hcn4-GFP erkeklerde ve CD-1 dişiler arasındaki zamanlanmış çiftleşmelerin ayarlayın.
  2. karbondioksit ötanazi ve sonraki servikal dislokasyon ile E12.5 hamile kadın Kurban.
    1. , Daha önce 23 22 tarif edildiği gibi kesme forseps ile rahim boynuzları çıkarın ve Ca + 2 ya da Mg olmayan 1x Fosfat tamponlu tuz (PBS) ile buz üzerinde bir Petri 2+ içine yerleştirin.
  3. steril tekniği kullanarak doku kültürü kaputu sonraki tüm adımları uygulayın.
    1. makas kullanılarak ve forseps diseksiyon kesesi rahim ve amniyotik embriyolar çıkarın. Daha iyi kullanım için ekli plasentayı tutun. pregnant CD-1 dişi genellikle 10 ila 14 yavrular doğurur.
    2. Forseps kesme kullanılarak, izole edilmiş embriyolar, almak ve hızlı bir şekilde% 70 (h / h), EtOH içinde iki kez yıkayın.
      NOT: yıkar hücre ölümünü en aza indirmek için hızlı olmalıdır.
    3. İzole embriyolardan kalp de dahil olmak üzere, baş, kol ve bacaklarını, kuyruk ve iç organları çıkarın.
    4. Yaklaşık olarak 1 mm3 büyüklüğünde steril bir jilet kullanılarak 1 x PBS ve ince kıyma 1 mL 10 cm'lik bir tabak içinde kalan doku yerleştirin.
    5. PBS ile 50 ml konik tüp içine kıyılmış doku aktarın.
    6. 3 dakika boyunca 300 xg'de Spin. Dikkatle aşırı PBS aspire.
    7. embriyo başına steril% 0.25 tripsin-EDTA 1 ml. 15 dakika boyunca 37 ° C su banyosu içinde hücreleri inkübe edin. Yavaşça tüpü her 4 dakikada bir karıştırın. Aşırı sindirim dokusu önemli ölçüde verim düşürecektir.
    8. 4 saniye boyunca maksimum hızda (3200 rpm) vorteks hücre karışımı.
    9. embriyo başına fibroblast ortam 2 ml ilave edilir ve karıştırılır. filtre tsüzgecinden hücreleri yardım etmek için bir pipet kullanarak 100 mikron hücre süzgecinden hrough. Sonraki tüm ortamlar oluşturulması için Tablo 1'e bakınız.
    10. 4 dakika boyunca 300 xg'de Spin. Dikkatle süpernatant aspire.
    11. 3 embriyoların başına taze fibroblast medya 10 ml ekleyin ve 6-10 kez çiğnemek.
    12. hazırlanan her 3 embriyolar için 1 15 cm doku kültürü çanak hücreleri Plate. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde kültür, gece boyunca.
    13. Gece boyunca inkübasyondan sonra, plaka başına ortam taze 30 ml ile değiştirin. bir gecede geri kuvöz içine hücreleri yerleştirin.
      NOT: floresan mikroskop altında Hcn4-GFP + hücre kirlenme kontrol edin. Kültür GFP olmalı - ve sadece yeniden programlama üzerine GFP + olur.
    14. Bir sonraki gün, taze, önceden ısıtılmış,% 0.25 tripsin-EDTA 3 mL hasat hücreleri. Kont ve hücreleri dondurma. Tipik olarak, mL başına 3 x 10 6 hücre hücreleri dondurma. beklenen YieLD embriyo başına 3 x 10 6 hücre olmalıdır.

2. Retrovirus Üretim ve yeniden programlanması

Dikkat: Aşağıdaki protokol bulaşıcı retrovirüslerin üretimi ve işleme gerektirir. BSL-2 kurallar ve steril tekniği altında Biyogüvenlik Seviye 2 kabine aşağıdaki adımları uygulayın. retrovirüslere maruz kalan tüm malzemelerin imha etmek için% 10 çamaşır suyu kullanın.

  1. Retrovirüs üretimi ve MEFS hazırlık
    Not: Aşağıdaki protokol 24 oyuklu plakalar içinde retroviral 6 oyuklu plakalar içinde üretimi ve MEF enfeksiyonu içindir. Diğer formatlar için, Tablo 2'ye bakınız. Zamanlama (bölüm 2.3 ve Şekil 2'ye bakın) her bir deney için uygun bir şekilde koordine edilmesi gerekir bu yüzden MEFS, Gün -1 de kaplanır.
    1. Plat-E (PE) üreticinin önerilerine göre hücreler koruyun. Kısaca, DMEM kültür PE hücreleri,% 10 FBS, 1 ug / ml ile takviye edilmiş puromycin, 10 ug / ml Blasticidin, penisilin ve streptomisin üzerine yayıldı. Passage hücreleri 1: Kültür% 70-90 confluency ulaştığında 4 her iki günde.
    2. Gün -2: Transfeksiyondan bir önceki gün, transfeksiyon ortamı bir 6-yuvalı plaka / oyuk 1 x 10 6 hücre Plat-E hücreleri tohum. Hücreler, transfeksiyondan zamanında% 70-80 konfluent olmalıdır.
  2. Ticari bir transfeksiyon ajanı kullanılarak transfeksiyon.
    Not: Ticari reaktifler transfeksiyondan önce oda sıcaklığında (RT) olmalıdır. DNA, transfeksiyonu için, GHMT kokteyli 9 oluşturmak için her bir retroviral plazmid DNA tek tek (G, H, K ve T) ekleyin.
    1. Gün -1: 15 ml konik bir tüp içinde polistiren, bir 6-yuvalı plaka formatı için reaksiyon başına transfeksiyon reaktifi 6 uL düşük serum ortamında 60 uL karıştırın. Oda sıcaklığında 5 dakika süreyle inkübe karışımı.
      Not: Burada kullanılan transfeksiyon reaktif plastik bağlanır beri,doğrudan indirgenmiş serum ortamına Transfeksiyon etkinliğindeki bir azalma bilmek dd.
    2. reaksiyon başına GHMT kokteyli 2 mikrogram toplam ekleyin ve hafifçe karıştırın dokunun. vorteks etmeyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca reaksiyon inkübe edin.
    3. damla damla bir şekilde PE hücrelere adım 2.2.3 den karışımı ekleyin.
    4. 37 ° C,% 5 CO2 inkübatörü içinde bir gece boyunca transfekte Plat-E hücreleri inkübe edin. transfeksiyon zamanı kaydedin.
  3. Hcn4-GFP fare embriyonik fibroblast tohumlama.
    1. 1 saat MEFS kaplama önce, immünsitokimya 24 plaka hazırlayın.
      1. kuyu başına 12 mm fibronektin lamel ekleyin.
      2. (Örneğin, SureCoat) sığır kollagen çözeltisi 300 uL ile kaplayın kuyu, 1 saat boyunca 37 ° C kuluçka makinesi içinde inkübe edilir.
      3. hemen MEF kaplama öncesi aspire kaplama solüsyonu.
    2. Hcn4-GFP MEFS donmuş şişe çözülme ve önceden ısıtılmış fibrobl ile x1 yıkayın5 dakika boyunca 500 xg'de ast ortamı.
    3. tripan mavisi dışlama veya benzeri boyalar kullanarak hücre canlılığı belirleyin. aşağıdaki formül kullanılarak kültür mL'si başına canlı hücre sayısını hesaplayın:
      % Canlı hücreler = [1.00 - (toplam hücrelerin mavi hücre sayısı / Adet)] x 100
      1. aşağıdaki formül kullanılarak canlı hücrelerin toplam sayısını hesaplayın:
        Hücre süspansiyonu canlı hücreler =% canlı hücreler x seyreltme faktörü x 10,000 x toplam hacim
    4. Daha önce hazırlanan sığır kollagen çözelti fibronektin lamel ile 24 oyuklu plaka oyuk başına tohum 3 x 10 4 hücre.
  4. İletimi ve MEF'lerin yeniden programlama
    NOT: Üreticinin notlarına göre, düzgün Plat-E hücreleri 1 x 10 7 enfeksiyon birimlerinin / mL ortalama titreye üretmek yapılmaktadır. titre doğrudan her bir deney için ölçülen olmasa da, bir GFP kontrolü her zaman enfeksiyon verimliliği için bir vekil olarak yer almaktadır.Yüksek GFP tanımı ve yoğunluğu (GFP +>% 95), tipik olarak iCLMs başarıyla GHMT aracılı üretimi ile ilişkilidir.
    1. Gün 0: 24 saat post-transfeksiyon, 0.45 um gözenek boyutlu yüzey aktif madde içermeyen selüloz asetat filtre ile PE retroviral orta filtre ve 15 ml konik bir tüp aktarın. 8 ug / mL'lik bir nihai konsantrasyona kadar polibren ekleyin. Dikkatle taze transfeksiyon orta 2 ml hücreleri doldurmak.
      NOT: Ortam çok hızlı değiştirilirse Hücreler kolayca levhadan ayırmak.
    2. Kültür MEF'lerin orta aspire ve taze toplanan retroviral orta eklemek; Bir 6-çukurlu levha başına ortam 1.7 mL vermelidir. 24-iyi levha başına ~ 800 uL ekleyin. inkübatör MEF plaka dönün ve gece inkübe edin.
    3. 1. Gün: tekrarlayın 2.4.1 ve 2.4.2 adımları. 2. Virüs toplandıktan sonra hücreleri atın. inkübatör virüslü MEFS dönün ve onları bir gecede dinlendirin.
    4. 2. Gün: 48 saat sonrası indüksiyon, 1x PBS ile hücre klimalı ortam ve yıkama x1 aspire. 24 gözlü bir levha başına 500 uL önceden ısıtılmış iCLM ortam ekleyin.
    5. 3 gün - her 2 iCLM medya değiştirin. 14 gün kalp reprogramming immünsitokimya (ICC) analizi için viral indüksiyon sonrası süreç plakası.

Yeniden programlanması MEFS 3. immün

  1. 14-gün-indüksiyon sonrası, dikkatlice medya aspirat.
  2. buz soğukluğunda 1x PBS 300 ul her bir durulayın. Fazla çözüm aspire.
  3. 24 gözlü bir levha başına% 4 paraformaldehit (PFA) çözeltisi 250 uL hücreleri saptamak. Oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkalayın.
    Not: - boyama önce 2 hafta sabit hücreler 1, 4 ° C de PBS içinde saklanabilir.
  4. 300 uL% 0.1 PBS-Triton® X-100 (PBST) ile yıkanır kuyu X3 Permeabilize hücreleri. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Son yıkamadan sonra aşırı çözüm aspire.
  5. 10 Blok300 uL / ​​kuyu başında 1x Evrensel Blok Tampon ile oda sıcaklığında min.
  6. (ICC) boyama tampon hazırlayın: engelleme tampon 1x PBS ve 1x Universal 1: 1 ekleyin. ICC boyama tamponu primer antikorlar seyreltilir ve 4 ° C'de gece boyunca inkübe antikor. Önerilen dilüsyonları için maddi bölümüne bakın.
    1. Jüri özel IPM ve IAM tanımlama için fare a-aktinin, tavuk αGFP ve tavşan ile slaytlar bir çift Leke.
    2. iPM ve IVM tanımlama için fare α-aktinin, tavuk αGFP ve tavşan Myl2 ile slaytlar bir çift Leke.
  7. Ertesi gün, 300 uL% 0.1 PBST ile kuyu x3 yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Son yıkamadan sonra aşırı çözüm aspire.
  8. ICC tampon boyama ikincil antikor dilüsyonları hazırlayın. Önerilen dilüsyonları için maddi bölümüne bakın. İkincil antikorlar, ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin.
    1. Aşağıdaki ikincil Antikorların tüm slaytlar Lekes: fare Alexa-555, tavuk Alexa-488 ve tavşan Alexa-647.
  9. 300 uL% 0.1 PBST ile kuyu x3 yıkayın. Yıkamalar arasında oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Işıktan koruyunuz.
  10. cam bir mikroskop lamı, 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), 1.5 ug / ml ihtiva eden montaj medya 2.4 uL ekleyin. Dikkatle, 24 plaka kuyudan lamel kaldırmak fazla çözüm kaldırmak ve montaj medya ile cam slayt transfer. Yavaşça fazla hacim ve havayı çıkarmak için lamel basın.
  11. Tercih oje veya plastik dolgu macunu ile mühür slaytlar. Mağaza ışıktan korunan 4 ° C'de slaytlar.

Konfokal Mikroskobu kullanılarak Kardiyak Alt Tiplerinin 4. Kimlik

Not: görüntüleme için, konfokal mikroskop en az 2 floresan 405 spektral algılama kapasitesine sahip detektörler 488, 555 ve 639 nm dalga boyları ile donatılmış IPMS, IamS ve IVMS tespit etmek için gereklidir. imagPlan-Apochromat 20X / 0.75 objektif ya da daha iyi kullanarak e hücreleri. Üreticinin görüntü analiz yazılımı kullanarak 40X-immersiyon yağı kaliteli görüntüler elde edebilirsiniz yakınlaştırma görüntüleri taramak.

  1. Resim kütüphanesi: DAPI, Alexa-488, Alexa-555 ve Alexa-647 kanallı 8 bitlik görüntüleri almak (Böl.). Piksel 2'de 6 s 1024 çerçeve boyutu, çizgi adımı kalma süresi ve 2 ortalama yüksek çözünürlüklü görüntüler için yeterlidir.
  2. Her slayt için, bir ucundan başlayıp yukarı taramaya başlamak ve α-aktinin + Sarkomer + hücreleri için kırmızı floresan kanal (Böl.) Aşağı (örnekler için Şekil 3'e bakın ve Şekil 5A). Sarkomer çizgiler 555 nm dalga boyundaki görsel tespit etmek kolaydır.
    1. Bir α-aktinin + Sarkomer + hücre tespit edildikten sonra, yeşil ch geçin. pozitif olması durumunda ve (IPM) notu tutmak. uzak-kırmızı 647 ch değerlendirmek için bilgisayara geçin. (IAM veya IVM).
      NOT: Hangi Hücrelerα-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / jüri özel - / Myl2 - IPMS olarak belirlenir. GFP ifade hücre (Şekil 4A) boyunca görülecektir.
    2. α-aktinin (fare-Alexa555), Hcn4-GFP (tavuk-Alexa488) ile Leke slaytlar, jüri özel (tavşan-Alexa647) ve DAPI. Α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP olan Hücreler - / jüri özel + IAM vardır. Jüri özel boyama perinükleer ve noktasal (Şekil 4B) görünecektir.
    3. α-aktinin (fare-Alexa555) ile Leke slaytlar, Hcn4-GFP (tavuk-Alexa488), Myl2 (tavşan-Alexa647). Α-aktinin için pozitif hücrelerin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / Myl2 + IVMS vardır. Myl2 boyama sarkomer filamanın boyunca çizgili formu sergileyecek. Nedeniyle lekelenmesi ve Z-düzleminde kalitesinde farklılıklar nedeniyle, çizgiler her zaman (Şekil 4C) kolayca görülebilir olmayabilir.

5. Niceleme

Not: potansiyel olarak yeniden programlanabilir MEF'ler gerçek sayısını belirlemek için, 24-çukurlu plaka 2 kuyu deney oyuklara paralel tohumlanır ve kaplama bir gün sonra hasat edilir. kaplama hücrelerinin toplam sayısı, daha sonra iki kuyu ortalamasının alınmasıyla belirlenmektedir. Bu kaplama gerçek toplam hücreleri (atotal) olur.

  1. sarkomer +
    1. Görme uygun α-aktinin + / Sarkomer + (Sağ paneller Şekil 3) ve kayıt (Şekil 5B-i) bir lamel her hücreyi kontrol edin.
    2. Kaplama gerçek toplam hücrelerin (atotal) her lamel ve böl üzerinde α-aktinin + / Sarkomer + toplam sayısını tablolaştırıyoruz (Şekil 5B-iii). Atotal = 12,500 hücre ve 100 hücre a-aktinin edildi, örneğin, + / Sarkomer + sonra kaplama MEF'ler% 0.8 yeniden programlanması edildi. Bir ortalamareprograming Deney,% 1 α-aktinin + / Sarkomer + hücreler (Şekil 5C) ürün elde edilir.
  2. Alt tür +
    NOT: Aşağıdaki adımlar için, bir temsilci iCLM miktar iş akışı için 5B / C Şekil bakın. Ya alt (Şekil 5B-I) için farklı ise, kısa bir süre, her sarkomerinde + hücre için, çizelgeye. Ortalama sarkomerinde + hücreleri x 100 (Şekil 5B-i) üzerinden alt tipi + hücrelerinin sayısına bölünmesiyle% Alt (Şekil 5B-iii) hesaplayın. Mutlak% alt verimi (Şekil 5B-IV) hesaplamak için, Şekil, alt + hücre sayısına bölün 5B-i x 100 (Şekil 5B-II) 'tohumlanmıştır hücrelerin toplam sayısına göre.
    1. GFP + jüri özel + veya Myl2 ise α-aktinin her + / Sarkomer + hücreleri için, değerlendirme + yukarı.
    2. / Myl2 - - aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP - / jüri özel + ve α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP α-aktinin + / Sarkomer + / Hnc4-GFP + / jüri özel sayısı tablolaştırıyoruz - / Myl2 + hücreleri (Şekil 5B-I).
    3. Her alt tip yüzdesini hesaplamak için, iyi ki + / Sarkomer + hücreleri α-aktinin toplam sayısına göre Tipi + hücre sayısını bölmek ve 100 GHMT ile çarpın IPMS, Iams ve IVMS kabaca eşit oranlarda oluşturur (Şekil 5B-iii).
    4. Alt tipi + hücrelerinin mutlak sayısını hesaplamak için, atotal tarafından deneysel koşul için alt tipi + hücrelerinin toplam sayısını bölmek ve 100 (Şekil 5B-ii) ile çarpın. ortalama iPMS toplam enfekte hücre popülasyonunun% 0.3, Iams% 0,3, temsil veIVMS% 0.25 (Şekil 5B-IV).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

PM-spesifik raportör fare yararlanan biz Şekil 1'de gösterildiği gibi çeşitli endojen miyositleri tanımlamak için multipleks immün strateji geliştirdi. Şekil 2'de gösterilen yeniden programlama adımları aşağıdakı, alt özel CMS indüksiyonu olsa düşük bir oranda, erken 4. günde 21 olarak tespit edilebilir. 14. günde tarafından, deney durdurulabilir ve sarkomer organizasyonu (Şekil 3) ve alt tip-şartname

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Bu çalışmada kardiyak transkripsiyon retrovirüs aracılı ifade yoluyla kardiyak alt tiplerinin farklı setine MEFS dönüşüm için doğrudan yeniden programlama strateji sağlar Gata4, Mef2c Tbx5 ve Hand2 (GHMT) faktörleri. Bir PM özgü muhabiri fare ile birlikte bir multipleks immün yaklaşımı kullanarak, biz tek bir hücre çözünürlükte IAM, IVMS ve IPMS tespit edebiliyoruz. Böyle bir tahlil alt tip çeşitlilik ve sarkomer geliştirilmesine yönelik bireysel transkripsiyon faktörlerinin katkıları izole edebilen vitro siste...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

AF-P., Ulusal Bilim Vakfı Lisansüstü Araştırma Bursu tarafından 2015165336 No'lu Hibe kapsamında desteklenmiştir. N.V.M, NIH (HL094699), Burroughs Wellcome Fund (1009838) ve March of Dimes (#5-FY14-203) tarafından sağlanan hibelerle desteklendi. Young-Jae Nam, Christina Lubczyk ve Minoti Bhakta'ya protokol geliştirme ve veri analizine yaptıkları önemli katkılardan dolayı teşekkür ederiz. Ayrıca değerli teknik katkılar için John Shelton'a ve bilimsel tartışmalar için Munshi laboratuvarı üyelerine teşekkür ederiz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
DMEMSigmaD5796iCLM ortamı, Plat-E ortamı, fibroblast ve Transfeksiyon ortamının
bileşeni Orta 199Thermo Fisher Bilimsel11150059iCLM ortamının bileşeni
Fetal sığır serrumunun (FBS)SigmaF2442iCLM ortamı, Plat-E ortamı, fibroblast ve Transfeksiyon ortamının bileşeni
İnsülin-Transferrin-Selenyum GThermo Fisher Bilimsel41400-045iCLM ortamının
MEM vitamin çözeltisiThermo Fisher Scientific11120-052iCLM ortamının bileşeni
MEM amino asitleriThermo Fisher Scientific1601149iCLM ortamının
bileşeni Esansiyel olmayan amino asitlerThermo Fisher Scientific11140-050iCLM ortamının bileşeni
Antibiyotik-AntimikotiklerThermo Fisher Scientific15240062iCLM ortamının
B-27 takviyesiThermo Fisher Scientific17504044iCLM ortamının
Isıyla İnaktive Edilmiş At SerumuThermo Fisher Scientific26050-088iCLM ortamının bileşeni
NaPyruvateThermo Fisher Scientific11360-70iCLM ortamının bileşeni
Penisilin/StreptomisinTermo Fisher Scientific1514022Plat-E media ve fibroblast media
bileşeni Puromisin Thermo Fisher ScientificA11139-03Plat-E ortamının
bileşeni Blasticidin   Gemini Bio-Products400-128PPlat-E ortamının
GlutamaxThermo Fisher Scientific35050-061Fibroblast ortamının bileşeni
Konfokal lazer tarama LSM700ZeissKonfokal analiz için
FuGENE 6 transfeksiyon ReaktifiPromegaE2692Transfeksiyon reaktifi 
Opti-MEM Azaltılmış Serum OrtamıThermo Fisher Scientific31985-070Transfeksiyon reaktifi 
PolibrenMilliporeTR-1003-Gİndüksiyon reaktifi. 8 & mu'luk bir son konsantrasyonda kullanın; M/mL
Platinyum-E (PE) Retroviral Packagin Hücre Hattı, EkotropikHücreBiolabsRV-101Retroviral pacaking hücre hattı
Tripsin% 0.25 EDTAThermo Fisher ScientificMEF'ler ve Plat-E ayrışması için
Fare anti ve alfa; -Aktinin (Klon EA-53)SigmaA7811Antikoru. Konfokal analiz için 1:200
Tavuk anti-GFP IgYThermo Fisher ScientificA10262Antikorunda kullanın. 1:200
Tavşan Pab anti-NPPA 'de kullanın;AbgentAP8534AAntikoru. 1:400
Tavşan Pab anti Myl2 IgG 'de kullanın;ProteinTech10906-1-APAntikoru. DAPI
(4 ', 6-Diamidino-2-Fenilindol, Dihidroklorür) ile 1:200 Vectashield çözeltisinde kullanın)Vector LabsH-1500Konfokal analiz için boya
Superfrost Plus Mikroskop slaytlarıThermo Fisher Scientific12-550-1525 x 75 x 1.0 mm
BioCoat Fibronektin 12 mm lamellerNeuVitro CorpGG-12-1.5Konfokal analiz için lameller
100 μ m hücreli süzgeçThermo Fisher Scientific08-771-19
0.45 μ m Şırınga filtreleri SFCA 25MMThermo Fisher Scientific09-740-106Virüs filtrasyonu için
6 mL ŞırıngalarCovidien8881516937Virüs filtrasyonu için
Keçi anti-Tavuk IgY (H & L) A488AbcamAB150169Konfokal analiz için ikincil antikor. 1:400
Eşek anti-tavşan A647 IgG(H+L) Thermo Fisher ScientificA31573Konfokal analiz için ikincil antikor. 1:400
Keçi anti-fare IgG (H + L) A555Thermo Fisher ScientificA21422Konfokal analiz için ikincil antikorda kullanın. Hücre geçirgenliği için 1:400
Triton X-100Sigma93443-100ml'de 
Dulbecco'nun CaCl 2< / sub> ve MgCl 2< / sub> içermeyen PBS'si (D-PBS)SigmaD8537
Güç Bloğu 10x Evrensel Engelleme reaktifiThermo Fisher ScientificNC9495720H2O'da 1x'e seyreltin
%16 Paraformaldehit sulu çözeltisi (PFA)ElektroMikroskopi Bilimleri 15710%4'te dH2O
6 cm  plakalardaOlympus25-260
6 oyuklu plakalarGenesee Scientific25-105
24 oyuklu plakalarGenesee Scientific25-107
10 cm Doku kültürü kaplarıCorning4239
15 cm  Doku kültürü kaplarıThermo Fisher Scientific5442
15 mL Konik tüplerCorning4308
50 mL Konik tüplerCorning4249
%0.4 Tripan mavisi çözeltisi SigmaT8154Canlılık için
Etil Alkol 200 geçirmezThermo Fisher Scientific7005
Çamaşır SuyuThermo Fisher Bilimsel6009
bileşeni bileşeni bileşeni bileşeni Konfokal analiz için Konfokal analiz için Konfokal analiz için kullanın kullanın

Kaynaklar

  1. Sissman, N. J. Developmental landmarks in cardiac morphogenesis: comparative chronology. Am J Cardiol. 25 (2), 141-148 (1970).
  2. Buckingham, M., Meilhac, S., Zaffran, S. Building the mammalian heart from two sources of myocardial cells. Nat Rev Genet. 6 (11), 826-835 (2005).
  3. Ali, S. R., et al. Existing cardiomyocytes generate cardiomyocytes at a low rate after birth in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (24), 8850-8855 (2014).
  4. Bergmann, O., et al. Evidence for cardiomyocyte renewal in humans. Science. 324 (5923), 98-102 (2009).
  5. Senyo, S. E., et al. Mammalian heart renewal by pre-existing cardiomyocytes. Nature. 493 (7432), 433-436 (2013).
  6. Lin, Z., Pu, W. T. Strategies for cardiac regeneration and repair. Sci Transl Med. 6 (239), 239rv231(2014).
  7. Writing Group, M., et al. Heart Disease and Stroke Statistics-2016 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 133 (4), e38-e360 (2016).
  8. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  9. Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
  10. Ieda, M., et al. Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by defined factors. Cell. 142 (3), 375-386 (2010).
  11. Qian, L., et al. In vivo reprogramming of murine cardiac fibroblasts into induced cardiomyocytes. Nature. 485 (7400), 593-598 (2012).
  12. Fu, J. D., et al. Direct reprogramming of human fibroblasts toward a cardiomyocyte-like state. Stem Cell Reports. 1 (3), 235-247 (2013).
  13. Zhou, H., Dickson, M. E., Kim, M. S., Bassel-Duby, R., Olson, E. N. Akt1/protein kinase B enhances transcriptional reprogramming of fibroblasts to functional cardiomyocytes. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (38), 11864-11869 (2015).
  14. Zhou, Y., et al. Bmi1 Is a Key Epigenetic Barrier to Direct Cardiac Reprogramming. Cell Stem Cell. 18 (3), 382-395 (2016).
  15. Zhao, Y., et al. High-efficiency reprogramming of fibroblasts into cardiomyocytes requires suppression of pro-fibrotic signalling. Nat Commun. 6, 8243(2015).
  16. Miki, K., Yoshida, Y., Yamanaka, S. Making steady progress on direct cardiac reprogramming toward clinical application. Circ Res. 113 (1), 13-15 (2013).
  17. Atkinson, A., et al. Anatomical and molecular mapping of the left and right ventricular His-Purkinje conduction networks. J Mol Cell Cardiol. 51 (5), 689-701 (2011).
  18. Bootman, M. D., Smyrnias, I., Thul, R., Coombes, S., Roderick, H. L. Atrial cardiomyocyte calcium signalling. Biochim Biophys Acta. 1813 (5), 922-934 (2011).
  19. Miquerol, L., Beyer, S., Kelly, R. G. Establishment of the mouse ventricular conduction system. Cardiovasc Res. 91 (2), 232-242 (2011).
  20. Später, D., Hansson, E. M., Zangi, L., Chien, K. R. How to make a cardiomyocyte. Development. 141 (23), 4418-4431 (2014).
  21. Nam, Y. J., et al. Induction of diverse cardiac cell types by reprogramming fibroblasts with cardiac transcription factors. Development. 141 (22), 4267-4278 (2014).
  22. Conner, D. A. Current Protocols in Molecular Biology. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).
  23. Jozefczuk, J., Drews, K., Adjaye, J. Preparation of mouse embryonic fibroblast cells suitable for culturing human embryonic and induced pluripotent stem cells. J Vis Exp. (64), (2012).
  24. Burns, J. C., Friedmann, T., Driever, W., Burrascano, M., Yee, J. K. Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotyped retroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transfer into mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (17), 8033-8037 (1993).
  25. Ichim, C. V., Wells, R. A. Generation of high-titer viral preparations by concentration using successive rounds of ultracentrifugation. J Transl Med. 9, 137(2011).
  26. Qian, L., Berry, E. C., Fu, J. D., Ieda, M., Srivastava, D. Reprogramming of mouse fibroblasts into cardiomyocyte-like cells in vitro. Nat Protoc. 8 (6), 1204-1215 (2013).
  27. Yang, R., et al. Direct conversion of mouse and human fibroblasts to functional melanocytes by defined factors. Nat Commun. 5, 5807(2014).
  28. Muraoka, N., Ieda, M. Direct reprogramming of fibroblasts into myocytes to reverse fibrosis. Annu Rev Physiol. 76, 21-37 (2014).
  29. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. , (1997).
  30. Bass, G. T., et al. Automated image analysis identifies signaling pathways regulating distinct signatures of cardiac myocyte hypertrophy. J Mol Cell Cardiol. 52 (5), 923-930 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Do rudan Yeniden ProgramlamaGHMT Yeniden Programlamand klenmi Kardiyomiyositlermm nositokimyaKonfokal MikroskopiSarkomer OrganizasyonuAlt Tip BelirlemeRetroviral Transd ksiyon

İlgili makaleler