farklı genetik kökenden bireysel WT retina atalarıdır Canlı izleme nöron sırasında hücre özerk olmayan sinyalizasyon katkısı değerlendirilmesi için izin verir. Burada, embriyo transplantasyonu yoluyla ve in vivo time-lapse konfokal görüntüleme gen demonte, kimera nesil bir arada bu amaçla kullanılmıştır.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Kimerik Zebra balığı Embriyolar Bireysel Retina progenitörlerin Transgenik Gen İfade Vivo Görüntüleme Hücre otonom olmayan Etkiler Eğitim için
Bu makalede
Özet
Özet
Genetik ve teknik güçlü Zebra balığı omurgalı gen manipülasyon sonuçları hızlı gelişim dönemi boyunca in vivo izlenebilmektedir hangi önemli bir model organizmadır yaptık. Çoklu işlemler hücre çoğalması, gen ekspresyonu, hücre göçü ve morfojenezinin içeren incelenebilir. Önemli olarak, transplantasyon ile kimeralar üretimi kolayca mevcut ortamının etkisi altında mozaik etiketleme ve tek tek hücrelerin izleme sağlayan gerçekleştirilebilir. Örneğin, tek tek nakledilen verici hücreler üzerinde (morfolino mikroenjeksiyon yoluyla örneğin) ana embriyo fonksiyonel gen manipülasyonlar ve canlı görüntüleme, ekstrinsik etkileri (genetik olarak modifiye edilmiş bir ortamda sağlanan) hücre otonom olmayan sinyallerin birleştirilmesi ile değerlendirilebilir. İşte biz bu yaklaşım hücre kaderinin tanımlayabiliriz zamanlaması için bir vekil olarak floresan transgen ifadesi başlangıcını karşılaştırmak için kullanılır nasıl göstermekfarklı genetik konak ortamlarda tirme.
Bu yazıda, donör hücreleri işaretlemek için ve gen konak embriyolarda demonte, kimerik embriyolar oluşturmak için kullanılan nakli tekniğinin bir açıklama ve hazırlanması ve in vivo time-lapse konfokal çalışan için protokol neden Zebra balığı embriyolar microinjecting için protokol sağlar birden çok embriyo görüntüleme. Bu tür bir gen ifadesinin başlangıcı gibi olaylar zamanlamasını karşılaştırırken Özellikle, birden çok noktaya görüntüleme gerçekleştirmek son derece önemlidir. Bu çoklu kontrol ve eş zamanlı olarak işlenen deneysel embriyolardan veri toplama gerektirir. Böyle bir yaklaşım, kolayca herhangi bir organ ya da görüntüleme yaşamak için erişilebilir seçim dokuda dış etkilerden çalışmaları için uzatılabilir, transplantasyonlar kurulan embriyonik kader haritalarına göre kolayca hedef olabilir şartıyla.
Giriş
In vivo omurgalı önemli gelişim süreçleri görselleştirmek için yeteneği normal ve hastalık koşullarını incelemek için Zebra balığı bir anahtar modeli yapma katkıda bulunmuştur (1 gözden, 2). Özellikle nöral retinanın merkezi sinir sistemi erişilebilir bir parçasıdır. Retina nedeniyle son derece organize, henüz nispeten basit yapısı ve omurgalı türlerin 3 genelindeki yüksek oranda korunmuş nöron tiplerine kolayca nöron çalışmalar yapmak için oldukça rahat. Böyle çoğalması, hücre döngüsü çıkış, asimetrik hücre bölünmesi, kader özellikleri, farklılaşma ve nöral devreler olu....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Tüm prosedürler hayvanların bakımı ve kullanımı için pratik Avustralya Ulusal Sağlık ve Tıbbi Araştırma Konseyi koduna hükümlerine göre yürütülür ve kurumsal etik komiteleri tarafından onaylandı.
Zebra balığı 1. Hazırlık
- Yetişkin balık eşleştirme
- Akşam kullanımdan önce uygun boyutta yetiştirme tankları çift (ya da iki çift) olarak yetişkin balık ayarlayın.
- erkek ayrılan kadın, tutmak görmek için balık sağlamak, ancak birbirine değecek bir böleni kullanın.
- Sabah, ışık açıldıktan sonra, bölücüler kaldırmak ve balık rahatsız çiftleşmek için izin verir.
- Başarılı çiftleşme özgün tanklar geri ye....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Bu çalışma yabani tip retina atalarıdır bir morphant ev sahibi embriyo içinde geliştiğinde gen ifadesi zamanlama değişiklikleri değerlendirmek için deneysel bir protokol sunar. Deneysel ana embriyolar retina 7, 26 ara doğan yatay ve amacrine internöronlardan eksikliği Ptf1a morphants vardır. Bunlar standart bir kontrol morfolino enjekte edildi konak embriyolar, kontrol karşılaştırılmıştır.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
verimli, belirli bir post-mitotik hücre tipinde, hatta desenli doku içine ayırt etmek için embriyonik veya uyarılmış multipotent kök hücreleri talimat amaçlayan zaman hangi ölçüde komşu hücrelerin hücre zarı kaderi belirleyen faktörlerin ifade zamanlamasını etkilemesi anlamak esastır. Ayrıca, canlı hayvanın gelişmekte olan hücrelerde bu moleküler olayları inceleyen ayrıca ilgili dinamiği in vivo bu olaylar ile ilgili özel hücresel bağlamlarda (zamansal ve mekansal) bilgi sağlar. Bu tür çalışmalar kolayca tüm om.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu eser (PO 1440 / 1-1) LP PRJ bir ARC Decra (DE120101311) tarafından ve bir Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) araştırma bursu ile desteklenmiştir. Avustralya Rejeneratif Tıp Enstitüsü Victoria Eyalet Hükümeti ve Avustralya Federal Hükümeti fonları tarafından desteklenmektedir. Biz Kei ve ark yayınlanan Burada anlatılan deneyler yaptılar Dr. Jeremy Ng Chi Kei, kabul. 2016 Prof. Higashijima gelen transgenik balık hükümleri için minnettarız ve Profs teşekkür ederiz. H2B-RFP ve H2A-GFP yapıları oluşturmak için pCS2 plazmid Dr. Wilkinson sağlanması için Turner ve Rupp. Biz hayvanların bakımı için FishCore tesis personeli (Monash Üniversitesi) teşekk....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| Agarose | Bioline | BIO-41025 | Agaroz kaplı yemekler birkaç gün önceden hazırlanabilir, kurumasını önlemek için parafilm ile kapatılabilir ve 4 & # 176'da saklanabilir; C |
| Agaroz düşük eriyik | Sigma | A9414-100G | Daha büyük hacimlerde hazırlanabilir, sıvılaştırmak için mikrodalgada pişirilebilir ve daha sonra 40 & # 176'da erimiş halde tutulabilir; C su banyosu. 1 mL alikot hazırlanabilir (monte edilen her embriyo grubu için bir tane). |
| borosillicate glass kılcal boru SDR | Scientfic | 30-0035 | filamentsiz alternatifler kullanılabilir |
| SDR Scientfic | 30-0038 | filamentli borosillicate cam kılcal boru | benzer çapa sahip alternatifler kullanılabilir |
| cam petri kapları (60 mm çap) | Bilim Her | boyutta herhangi bir cam alternatifi | 1070506 |
| Enjeksiyon tüpü (2 m) | Eppendorf | 524616004 | Bu, nakil sırasında iğne tutucuyu şırıngaya bağlar |
| Mikroenjeksiyon kalıbı (kama şeklinde çıkıntılara sahip plastik kalıp) | Uyarlanabilir Bilim Araçları | Benzer şekle sahip | PT-1 |
| mikroiğne kullanılabilir tutucu | Narishige | M-152 | iğnelerinin dış çapına uyan herhangi bir alternatif |
| mikroenjektör | veya Eppendorf Femtojet | gaz basıncı | |
| mikromanipülatör | Coherent Scientific | M330IR | benzer alternatifler kullanılabilir |
| mikro yükleyici ucu | Eppendorf | 5242956003 | |
| Mineral yağ | Sigma | M5904-500ML | |
| iğne çektirme | Sutter Instruments | Model P-2000 | Bu çektirme için kullanılan ayarlar şunlardır: H 430, Fil 4, Vel 50, Del 225, Pul 75. Uygun uç boyutu ile sonuçlanırsa herhangi bir iğne çektirme kullanılabilir |
| Parafilm | Interpath | PM996 | herhangi bir parafin filmi |
| Pasteur pipet plastik | Samco Scientific | 202 | |
| Pasteur pipet camı | Hirschmann Laborgeraete | 9260101 | |
| Pronase | Sigma | P5942-25MG | Proteaz Tip XIV |
| N-fenil tiyoüre | Sigma | P7629-25G | PTU toksiktir ve toza sık sık maruz kalmaktan kaçınmak için bir stok çözeltisi olarak hazırlanabilir, satın almadan / kullanmadan önce MSDS'ye danışın. |
| Qiaquick jel ekstraksiyonu | Qiagen | 28704 | DNA'yı saflaştırmak için herhangi bir alternatif kullanılabilir |
| Rneasy Mini kiti | Qiagen | 74104 | RNA'yı saflaştırmak için herhangi bir alternatif |
| kullanılabilir SP6 mMessage kiti | Qiagen | AM1340 | SP6 kullanarak DNA'yı kopyalamak için herhangi bir alternatif |
Kaynaklar
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nat Rev Genet. 8, 353-367 (2007).
- Scholpp, S., Poggi, L., Zigman, M. Brain on the stage - spotlight on nervous system development in zebrafish: EMBO pra....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
