Yöntem makalesi

Channelrhodopsins'teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

DOI:

10.3791/55497

⸱

22 Mayıs 2017

 ,  ,  , 
1Experimental Biophysics, Institute of Biology, Humboldt-Universität zu Berlin

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Geçtiğimiz on yıl boyunca, kanalhodopsinler nörobilimsel araştırmalarda vazgeçilmez bir unsur haline geldi ve hedef hücrelerdeki elektrik süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde manipüle etmek için kullanılan araçlar haline geldi. Bu bağlamda, bir kanalhodopsinin iyon seçiciliği özellikle önem taşımaktadır. Bu makale, HEK293 hücrelerindeki elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları yoluyla Proteomonas sulcata'nın yakın zamanda tanımlanmış bir anyon iletici kanallıdopsininin klorür seçiciliğinin araştırmasını açıklamaktadır. Işık geçitli fotokroallerinin ölçülmesine yönelik deneysel prosedür, hızlı bir şekilde değiştirilebilir - ideal olarak monokromatik bir ışık kaynağı gerektirir, aksi halde geleneksel bir patch-clamp tertibatının mikroskopta birleştirilir. Deneyden önce preparatif prosedürler, tamponlanmış solüsyonların hazırlanması, sıvı bağlantı potansiyelleri üzerine düşünceler, hücrelerin tohumlanması ve transfeksiyonu ve yama pipetlerinin çekilmesi ile ilgili olarak özetlenmektedir. Akım-gerilim ilişkisinin gerçek kaydıS farklı klorür konsantrasyonları için reversal potansiyelleri belirlemek için transfeksiyondan 24 saat sonra 48 saat gerçekleşir. Son olarak, elektrofizyolojik veriler, klorür iletiminin teorik düşüncelerine göre analiz edilir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Channelrhodopsins (ChR), hareketli yeşil alglerin göz noktasında bulunan ve fototaksis ve fobik reaksiyonlar için birincil fotosensör olarak işlev gören ışık geçmeli iyon kanallarıdır. 2002'deki ilk tanımından bu yana, ChRs ortaya çıkan optogenetik alanın yolunu açtı ve iskelet kasları, kalp veya beyin 3 , 4 , 5 gibi çeşitli uyarılabilir hücrelerde uygulanabilir. ChR'lerin hedef hücrelerde ekspresyonu ilgili hücrenin ışık kontrollü iyon geçirgenliğine neden olur. Nöronal bağlamda, bu, aktarılan iyona bağlı olarak, hareket potansiyeli (AP) tetiklemenin

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-protocol-1
Şekil 1: Mandal kelepçesi kurulumu. (1) Işık kaynağı, (2) optik fiber, (3) programlanabilir kepenk, (4) sayısallaştırıcı, (5) kepenk sürücüsü, (6) yükseltici, (7) perfüzyon sistemi, (8) kişisel bilgisayar, (9) monitör (10) faraday kafes, (11) mikroskop sahne, (12) perfüzyon girişi, (13) perfüzyon çıkışı, (14) kayıt odası, (15) sıvı seviyesi sensörü, (16) ağar köprüsü ile banyo elektrotu, (17) Pipet tutucu, (22) mikroskop lamba güç kaynağı, (23) su dolu U-tüp, (24) mikroskop lamba yuvası, (21) ters yönlü mikroskop, (1....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 2 , tarif edilen protokolden sonraki ölçümlerden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Yeşil ışık ile aydınlatma esnasında, Ps ACR1 hızlı bir geçici akım içerir ve bu hızla sabit bir akım seviyesine kadar azalır. Işık kapatıldıktan sonra, fotokupiller milisaniye içinde sıfıra iner ( Şekil 2A ). Ekstrasellüler klorür konsantrasyonunun değişimi, elde edilen fotokupl izlerinde doğrudan görülebilen ters potansiyelin kaymasına neden olu.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tanımlanmış iyonik ve elektrik koşullarındaki ters potansiyellerin saptanması, ChRs'in ışık aktivasyonu sonrasında taşınan iyon türleri hakkında bilgi verir. Tek bir iyon türü karmaşık bir fizyolojik ortamda çeşitlenirse ve elde edilen ters potansiyel teorik Nernst potansiyeline göre değişirse, bu iyon türü taşınan tek sayıdır.

Bununla birlikte, ChR'ler için, ters potansiyel kaymalar, farklı iyonik türlere geçirgenlik ve ayrıca iletken iyonlar arasındaki rekabet nedeniyle Nernst denk.......

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mükemmel teknik yardım için Maila Reh, Tharsana Tharmalingam ve özellikle Altina Klein'e teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Alman Araştırma Vakfı (DFG) (SFB1078 B2, PH için FOR1279 SPP1665) ve Kataliz, UniCat, BIG-NSE (JV) ve E4 (PH) Kavramlarını Birleştiren Kümeler tarafından desteklendi.

....

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
HEK293 hücreleriSigma Aldrich85120602İnsan embriyonik böbrek hücreleri
RetinalSigma AldrichR2500all-trans retinal
FuGENE HDPromegaE2312Transfeksiyon reaktifi
DMEMBiochromeFG 0445Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta
AgarozRoth3810Agar köprüleri
CaCl2Roth5239CaCl2 2H2O
CsClBiomol2452
EGTARoth3054
FBSBiyokromS0615Hücre kültürü
GlikozRothHN06D (+) - Glikoz
KClRoth6781
MgCl2Roth2189MgCl2 6H2O
NaClRoth3957
NMGSigma AldrichM2004N-Metil-D-glukamin
Na-AspartatSigma AldrichA6683L-Aspartik asit sodyum tuzu monohidrat
Sitrik asitRoth6490
AgeIThermoFischerScientificER1462Restriksiyon enzimi
XhoIThermoFischerScientificER0695Restriksiyon enzimi
NheIThermoFischerScientificER0975Restriksiyon enzimi
XL1Blue E. coliAgilent Technologies200249Kemokompetif E. coli
KanamisinRothT832
Lizojeni et suyu ortamıRothX964
Agar-AgarRoth6494Agar plakaları
Plazmid saflaştırma kitiMarchery-Nagel740727.25
Penisilin / StreptomisinBiyokromA 2213Hücre kültürü
Poli-D-lizin hidrobromürSigma AldrichP6407-5MGKapak kayma kaplaması
MicroforgeÖzel yapımYangın parlatma
Serolojik pipetlerTPPFarklı boyutlar
Temiz tezgahKojairBiowizard SL130
KarıştırıcıIKARCT klasik
Gümüş telBilim ÜrünleriAG-T25; AG-T10Elektrotlar, 0,64 mm (banyo); 0,25 mm (elektrot)
pH ölçerKnick765 Kalimetrik
OzmometreVogelOM 815
MikroskopCarl ZeissID03Yangın parlatma
CO2 inkübatörüBağlayıcıCB150
Hücre kültürü kaplarıTPP9304034 mm iç çap
Kapak kızaklarıRothP23215 mm çap
TermometreRö ssel MesstechnikMTM12
Işın ayırıcıChroma2101190/10 iletim
Pipet tutucuALA Scientific InstrumentsPPH-1P-AXU-0-1.5
HeadstageMoleküler CihazlarCV203BU
AmplifikatörMoleküler CihazlarAxoPatch200B
Sayısallaştırıcı MolekülerCihazlarDigiData1400Dijital analog dönüştürücü
Işık kaynağıTILL FotonikPolikrom V540 nm tam yoğunluğa ayarlayın
MikroskopCarl ZeissAxiovert 100
DeklanşörVincent AssociatesVS25
Deklanşör sürücüsüVincent AssociatesVCM-D1
Cam kapilarriesWarner InstrumentsG150F-3Ateşle parlatılmış uçları olan boresilikat kılcal damarlar OD 1,5 mm İç çap 0,86 mm
Mikropipet çektirme SutterInstrumentsP1000
Banyo işleyicisiLorenz Messgerä tebauMPCU
Üç Bantlı filtre setiChroma69008Floresan filtresi  ECFP/EYFP/mKiraz 
CCD kameraWatecWat-221SCCD
OptometreGigahertz OptikP9710Işık yoğunluklarını ölçün
ObjektifCarl Zeiss421462-9900-000W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
MikromanipülatörScientificaPatchStar
Kayıt odasıÖzel yapım
Güç kaynağıMansonHCS-3202Mikroskoptan kaynaklanan elektriksel gürültüyü önler dahili güç kaynağı
Titreşim yalıtımlı masaNewportM-VW-3636-OPT-01
Faraday kafesiÖzel yapım veya herhangi bir ticari eşleştirme masası
HortumlarHerhangi bir ticari; örneğin RothBanyo kullanımı ve pipet basıncının uygulanması için farklı boyutlar ve malzemeler; agar köprüleri
Doğrusal çalkalayıcıSunlab InstrumentsSU 1000
Sıvı bağlantı potansiyeli hesaplayıcısıMoleküler Cihazlar veya doğrudan Peter H. BarryProgram, Clampex edinim yazılımına dahildir veya şu adresten edinilebilir: p.barry@unsw.edu.au
Veri toplama yazılımıMoleküler CihazlarClampex 10.X
Veri değerlendirme yazılımıMoleküler CihazlarClampfit 10.X
PsACR1GenBank veya AddgeneKF992074.1 veya Addgene plazmid #85465PsACR1 için gen kodlaması
Amplifikatör kılavuzuMolekülerCihazlar Akson Kılavuzu

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hegemann, P. Algal sensory photoreceptors. Annu. Rev. Plant Biol. 59, 167-189 (2008).
  2. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-1: a light-gated proton channel in green algae. Science. 296 (5577), 2395-2398 (2002).
  3. Bruegmann, T., et al.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Kanalrodopsin Elektrofizyolojisiyon Se icili i l mKlor r Se icili i AnaliziHEK293 H cre TransfeksiyonuI kla Tetiklenen Fotokimyasal Ak mlarAk m Gerilim li kileriTers D nme Potansiyeli BelirlemePipet Haz rlamaSol syon Tamponlama

İlgili makaleler