Channelrhodopsins'teki İyon Seçiciliğinin Elektrofizyolojik Olarak Belirlenmesi için Tam Hücreli Yama Kelepçesi Kayıtları

Özet

Bu makale, channelrhodopsinin iyon seçiciliğinin, HEK293 hücreleri kullanılarak elektrofizyolojik tam hücre yama-klemp kayıtlarıyla nasıl belirlendiğini açıklamaktadır. Burada, anyon seçici bir channelrhodopsinin klorür seçiciliğini araştırmak için deneysel prosedür gösterilmiştir. Bununla birlikte, prosedür farklı seçiciliğe sahip diğer channelrhodopsinlere aktarılabilir.

Özet

Geçtiğimiz on yıl boyunca, kanalhodopsinler nörobilimsel araştırmalarda vazgeçilmez bir unsur haline geldi ve hedef hücrelerdeki elektrik süreçlerini invaziv olmayan bir şekilde manipüle etmek için kullanılan araçlar haline geldi. Bu bağlamda, bir kanalhodopsinin iyon seçiciliği özellikle önem taşımaktadır. Bu makale, HEK293 hücrelerindeki elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları yoluyla Proteomonas sulcata'nın yakın zamanda tanımlanmış bir anyon iletici kanallıdopsininin klorür seçiciliğinin araştırmasını açıklamaktadır. Işık geçitli fotokroallerinin ölçülmesine yönelik deneysel prosedür, hızlı bir şekilde değiştirilebilir - ideal olarak monokromatik bir ışık kaynağı gerektirir, aksi halde geleneksel bir patch-clamp tertibatının mikroskopta birleştirilir. Deneyden önce preparatif prosedürler, tamponlanmış solüsyonların hazırlanması, sıvı bağlantı potansiyelleri üzerine düşünceler, hücrelerin tohumlanması ve transfeksiyonu ve yama pipetlerinin çekilmesi ile ilgili olarak özetlenmektedir. Akım-gerilim ilişkisinin gerçek kaydıS farklı klorür konsantrasyonları için reversal potansiyelleri belirlemek için transfeksiyondan 24 saat sonra 48 saat gerçekleşir. Son olarak, elektrofizyolojik veriler, klorür iletiminin teorik düşüncelerine göre analiz edilir.

Giriş

Channelrhodopsins (ChR), hareketli yeşil alglerin göz noktasında bulunan ve fototaksis ve fobik reaksiyonlar için birincil fotosensör olarak işlev gören ışık geçmeli iyon kanallarıdır. 2002'deki ilk tanımından bu yana, ChRs ortaya çıkan optogenetik alanın yolunu açtı ve iskelet kasları, kalp veya beyin ^{3 , 4 , 5} gibi çeşitli uyarılabilir hücrelerde uygulanabilir. ChR'lerin hedef hücrelerde ekspresyonu ilgili hücrenin ışık kontrollü iyon geçirgenliğine neden olur. Nöronal bağlamda, bu, aktarılan iyona bağlı olarak, hareket potansiyeli (AP) tetiklemenin ^{6 , 7 , 8} veya inhibisyon ^{9 , 10'un} mekansal ve zamansalIşık hassasiyeti, bir ChR varyantının iyon seçiciliğinin optogenetik uygulamasını nasıl belirlediğini vurgular.

Chlamydomonas reinhardtii ve Volvox carteri'den keşfedilen ilk ChRs, protonlara , ayrıca sodyum, potasyum gibi monovalent katyonlara ve daha az oranda kalsiyum ve magnezyum gibi iki değerlikli katyonlara karşı geçirgendir11,12,13. Bugün, 70'den fazla doğal katyon ileten kanalrodopsin (CCR) ^{14 , 15 , 16 , 17} ve değişik özelliklere sahip ^{18 , 19 , 20} değişik mühendislik varyasyonları Fotokupi boyutu, spektral duyarlılık, kinetik ve katyon seçiciliği mevcuttur. Nörobilimde, CCR'lerHücreleri harekete geçirmek ve AP'leri tetiklemek için kullanıldığında ışık tahrikli mikrobiyal pompalar yıllardır nöronları susturmak için mevcut tek antagonistti. 2014'te, iki grup aynı anda CCR'lerin, moleküler mühendislik ^{9 , 21} aracılığıyla varsayılan iyon iletken gözenek boyunca polaritenin değiştirilmesi yoluyla anyon ileten kanalrodopsinlere (ACR'ler) dönüştürülebileceğini gösterdi. Daha sonra doğal ACR'ler birkaç kriptofit alg içinde tanımlandı ^{22 , 23 , 24} . En önemlisi, ACR'lerin hafif aktivasyonu, erişkin nöronlardaki klorür akımlarına aracılık eder ki, emilen foton başına yalnızca tek yükleri taşıyan mikrobik pompalardan çok daha düşük ışık yoğunluklarında nöronal aktivitenin engellenmesine izin verir.

ChR aktivitesi doğrudan HEK293 hücrelerindeki ışık kaynaklı akımların elektrofizyolojik yama-klemp kayıtları ile ele alınabilir. Yama kelepçesiTekniği başlangıçta 1970'lerin sonlarında geliştirildi ve Hamill ve ark. Tarafından daha da geliştirildi . , Yüksek akım çözünürlüğü ve membran voltajının doğrudan kontrolü ile küçük bir hücreden (bütün hücre modu) akımların varlığının kayıt edilmesine izin verir ²⁶ . Hücre kültürüne uygulanan bu teknik, iyonik ve elektrik kayıt koşullarını doğru bir şekilde kontrol eder ve iyon seçiciliğinin yanı sıra toplam akımın iyonların görece katkısı ile çalışılmasını sağlar. Burada, Proteomonas sulcata'nın ( Ps ACR1) ^{22 , 23'ün} anyon iletken kanal rehidopsiyonu için iyon seçiciliğinin incelenmesini, yüksek klorür iletkenliğini kanıtlamak için çeşitli hücre dışı klorür konsantrasyonları altındaki akım-voltaj ilişkilerinin kaydı inceleyerek örnekleyeceğiz.

Protokol

Şekil 1: Mandal kelepçesi kurulumu. (1) Işık kaynağı, (2) optik fiber, (3) programlanabilir kepenk, (4) sayısallaştırıcı, (5) kepenk sürücüsü, (6) yükseltici, (7) perfüzyon sistemi, (8) kişisel bilgisayar, (9) monitör (10) faraday kafes, (11) mikroskop sahne, (12) perfüzyon girişi, (13) perfüzyon çıkışı, (14) kayıt odası, (15) sıvı seviyesi sensörü, (16) ağar köprüsü ile banyo elektrotu, (17) Pipet tutucu, (22) mikroskop lamba güç kaynağı, (23) su dolu U-tüp, (24) mikroskop lamba yuvası, (21) ters yönlü mikroskop, (18) headstage, Valf, (25) titreşim önleyici masa, (26) CCD kamera. ( A ) Fotoğraflar ve ( B ) kurulumun şematik gösterimi. T daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen buraya tıklayınızOnun şekli.

1. Kayıttan Önce Kurulum

	içi.	extra.1	extra.2
	Yüksek klorür	Yüksek klorür	Düşük klorür
	C [mM]	C [mM]	C [mM]
Na-ASP	0	0	140
NaCl	110	140	0
KCl	1	1	1
CsCl	1	1	1
CaCl2	2	2	2
MgCI2	2	2	2
HEPES	10	10	10
EGTA	10	0	0
pH	7.2	7.2	7.2
osmolarite	290 mOsm	320 mOsm	320 mOsm

Tablo 1: Tamponlanmış Solüsyonların İyonik Kompozisyonu. HEK hücrelerinde klorür seçicilik deneyleri için hücreiçi (intra.) Ve hücre dışı (ekstra.) Tamponların bileşimi. Kullanılan kısaltmalar: etilen glikol tetraasetik asit (EGTA), 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) ve aspartat (ASP). Tüm konsantrasyonlar mM cinsindendir.

1. Kayıt solüsyonlarını, Tablo 1'de gösterildiği gibi iyon konsantrasyonları ile hazırlayın.
   1. MgCl ₂ , CaCl ₂ , KCl ve CsCl için ultra saf suda 15 mL 2 M stok solüsyonu hazırlayın.
   2. Katı bileşenleri 100 mL'lik hücre içi ve500 mL ekstraselüler tamponlu solüsyonları, tablo 1'e göre ayrı ayrı behere yerleştirin ve hazırlanan stok çözeltilerinin ilgili miktarını daha sonra ekleyin. Örneğin, hücre içi tampon için 0.3803 g (10 mM) EGTA, 0.2383 g (10 mM) HEPES ve 0.6428 g (110 mM) NaCI kullanın ve 100 uL 2 M MgCI2 ve CaCl2 ve 50 uL 2 M KCI ve CsCl stok solüsyonları.
   3. Çok saf su ekleyin ve sitrik asit ve N-metil-D-glukamin (NMG ⁺ ) gibi, ChR tarafından yürütülmeyen, ölçüm ile müdahale etmeyen asitler ve bazlar kullanarak pH'ı dikkatle ayarlayın.
   4. Ozmolarite, hücre içi için 290 mOsm ve glikozlu hücre dışı çözeltiler için 320 mOsm olarak ayarlanır.
      Not: Biraz hipoosmotik hücre içi çözümleri yama başarısını artırır ²⁶ .
   5. Tüm solüsyonları steril filtre ile 0.22 μm'lik filtrelerden geçirin. Çözeltileri 4 ° C'de iki hafta depolayınS veya uzun süreli depolamada -20 ° C'de dondurulmalıdır.
2. Sıvı bağlantı potansiyellerini hesaplayabilir ve kayıt protokollerini hazırlayabilir.
   NOT: Bütün hücre konfigürasyonunu oluşturduktan sonra hücre dışı klorür konsantrasyonunun değişimi, düzeltilmesi gereken önemli sıvı birleşim potansiyeline (LJP) neden olur ^{27 , 28} . LJP'ler doğrudan ölçülebilir veya hesaplanabilir, burada ikinci seçenek kullanılır. Bu protokolde, her harici tampon için bir kayıt protokolünü gerektiren on-line düzeltme kullanılacaktır. Bununla birlikte, daha büyük bir harici çözüm seti için yanlış düzeltmeyi önlemek için LJP'nin düzeltilmesi önerilmektedir.
   1. Birleşim potansiyeli hesaplayıcıyı (JPC) açın ²⁷ ve 'Yeni Deneme' diyalogunu açın. Ardından "Yama sıkıştırma ölçümleri" ni seçin. "Bütün hücre ölçümleri", "Standart tuz çözeltisi elektrodu" nu seçin ve bir sıcaklık girin.25 ° C. Her adım arasında, "sonraki" düğmesine basarak seçimi kabul ederek ilerleyin.
      NOT: Deneyler, klimalı bir laboratuarda 25 ° C'lik oda sıcaklığında yapılır. Deneyleri başlatmadan önce tampon çözeltilerin oda sıcaklığına sahip olduğundan emin olun. Numune sıcaklığını değiştirmek için bir kuluçka safhası veya bölmesi kullanılabilir. Banyo sıcaklığı sıklıkla bir termometre ile ölçülebilir.
   2. Tablo 1'de listelenen konsantrasyonlara göre pipetli solüsyonun ve yüksek klorür tampon maddesinin bütün anyon ve katyon konsantrasyonlarını ekleyin.
      NOT: JPC başlangıç ​​koşulları için -0.5 mV'lik bir LJP'yi hesaplar.
   3. Düşük klorür tampon maddesinin anyonik ve katyonik bileşimine girmek için "Yeni Banyo Çözeltisi" ne tıklayın.
      NOT: JPC, şimdi değiştirilmiş ekstraselüler kayıt çözümüne göre +12.6 mV yeni bir LJP hesaplayacaktır.
   4. Için iki LJP düzeltmeli protokol hazırlayın.Hesaplanan LJP'yi uygulanan tutma potansiyelinden çıkararak iki ölçüm koşulunu; -0.5 mV yüksek ve düşük klorür harici çözümler için +12.6 mV. Böylece, her iki durumda da -80 mV'lik LJP düzeltmeli bir başlangıç ​​tutma potansiyeli elde etmek için protokoller sırasıyla -79.5 mV (yüksek klorür) ve -92.6 mV (düşük klorür) ile başlar.
      NOT: Aşağıdaki adımlar, malzeme listesinde bahsedilen veri edinme yazılımı için geçerlidir.
   5. Satın alma yazılımındaki protokol düzenleyicisini açın. "Mod" menüsüne geçerek "Episodik uyarı" yı seçin ve 7 temizleme ekleyin.
   6. Editördeki "Dalgaformu" menüsüne geçin ve 0 mV tutma potansiyeline sahip 200 ms periyot ve bunu takiben yüksek klorür için -79.5 mV değerinde değişen tutma potansiyeli olan 2 sn periyot ekleyin. Her taramada tutma potansiyelini 20 mV artırmak için ikinci periyot için 20 mV'luk bir "Delta seviyesi" ekleyin.
   7. Dalga şeklindeki voltaj adımları içinde540 nm ışıkla (3.10 mW / mm²) 500 ms'lik bir aydınlatma periyodu uygulayın. Bunu yapmak için, açıklanan ikinci periyottan 500 ms sonra ışık kaynağını kontrol eden bağlı deklanşörün "dijital bit düzenini" değiştirin (bkz. 1.2.6).
      NOT: Işık yoğunluğu genlik veya inaktivasyon gibi kanal akımlarının biyofiziksel özelliklerini etkileyebilir. Bu nedenle, ışık gücü yoğunlukları daima bildirilmelidir. Tüm optikleri ve lamelleri geçtikten sonra ışığı ölçmek için kalibre edilmiş bir optometre kullanın. Güç yoğunluğunu hesaplamak için nesnenin aydınlık alanını bir nesne mikrometresi ile belirleyin ve ölçülen ışık gücünü belirlenen aydınlatılmış alana bölün.
   8. Yüksek klorid hücre dışı çözeltinin protokolünü kaydedin. Protokolü değiştirin ve birinci seviye tutma potansiyelini -92.6 mV değiştirin (düşük dış klorür). Düşük klorür hücre dışı durumu ölçmek için bu ikinci protokolü kaydedin.
3. Cam kapağın lisin kaplaması uyarlanmış protokole göre kayar ²⁹ .
   1. Bir cam petri kabı içine 100 kapak fişleri yerleştirin ve 250 mL HC1 (1 N) ekleyin.
   2. Petri kabı kapak folyolarıyla doğrusal çalkalayıcıya yerleştirin ve kapak kayışlarını temizlemek için 120 rpm'de 72 saat çalkalayın ve daha sonra pH'ı nötralize etmek için ultra saf su ile durulayın.
   3. Daha temizlik için bunları az miktarda% 95 etanol içinde bekletin.
      NOT: Devam etmeden önce temiz kapak fişleri% 70 etanol içinde saklanabilir. Aşağıdaki adımlar için laminer akış kaputunun altında çalışın.
   4. Bir Bunsen brülörü ve cımbız kullanarak, her kapak kaymasını alevlendirin ve yeni bir petri kabına aktarın.
   5. Cam kapak fişlerini 150 rpm'de doğrusal bir çalkalayıcı ile çalkalarken oda sıcaklığında en az 1 saat (veya gece boyunca) steril 50 ug / mL poli-D-lisin solüsyonu ile inkübe edin.
   6. Fazla poli-D-lisini çıkarmak için kapak fişlerini çok saf su ile yıkayın.
   7. Kapak fermuarlarını steril kağıda 10 dakika kadar kurumaya bırakın ve sterilizasyon için UV ışığına maruz bırakın (en az 20 dakika).
   8. Kapak fişlerini, kullanana kadar alüminyum folyo ile kaplanmış steril bir petri kabına koyun.
4. Standart moleküler biyoloji teknikleri kullanılarak mCherry ile kaynaştırılmış Ps ACR1 geninin DNA'sını hazırlayın.
   1. Restriksiyon enzimleri veya diğer kurulan klonlama yöntemleri kullanılarak mCherry floroforu çerçevesinde Ps ACR1'i kodlayan insan kodonuna göre optimize edilmiş gen dizisini bir peGFP-C1 plasmidine (CMV promotor, kanamisin direnci) klonlayın.
      Not: Diğer fluoroforlar da kullanılabilir, ancak kurulumda mikroskop altında flüoresanslarını izlemek için uygun filtre setlerine sahip olduğunuzdan emin olun.
   2. Standart protokole göre ısı şoku vasıtasıyla plasmid DNA'yı kemocompetent XL1Blue E. coli hücrelerine dönüştürün ve agar plakalarına (30 μg / mL kanamisin) ³⁰ yerleştirin > Sup. Kaplanmış bakterileri 37 ° C'de gece boyunca büyütün.
   3. Ertesi gün, tek kolonilerden alınan hücrelerle birlikte 30 μg / mL kanamisin ile desteklenmiş 4 ml likozyojen broth ortamı aşılayın ve bir gece boyunca 37 ° C'de ve 180 rpm'de gece boyunca inkübe edin.
   4. Gecelik inkübasyondan sonra, imalatçının talimatlarına uygun olarak ticari olarak temin edilebilir bir kit (bakınız Malzeme Tablosu ) kullanılarak kültürlerden plazmid DNA'yı saflaştırınız.
5. Hücreleri tohumladım
   NOT: Adımları laminar bir akış kaputunun altında yapın.
   1. 35 mm'lik bir petri kabı içinde üç adete kadar lizin kaplı cam kapak folyosunu yan yana koyun.
      NOT: Birbirinize kaymayı önlemek için çanağın tabanına hafifçe bastırın.
   2. Her çanakta% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile takviye edilmiş 2 mL standart Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) içinde 1.5 x 10 ⁵ HEK hücresi tohumları.
   3. At all- trans retinaya ilave1 uM'lik bir nihai konsantrasyon. Adım 1.6 ile devam etmeden önce hücreleri en az bir gün daha büyütün.
6. Lipofeksiyon yoluyla hücreleri geçici olarak transfecte ³¹ .
   1. Her bir hücre çanağı için, FBS ve 6 uL transfeksiyon reaktifi olmadan 250 μL DMEM'de (adım 1.4'te hazırlandığı gibi) 2 μg plazmid DNA'nın bir çözeltisi hazırlayın (Bkz. Malzeme Tablosu ).
   2. 15 dakika kuluçkadan sonra, yavaşça (damla damla) çözeltiyi hücrelere ekleyin.
7. Agar köprüleri hazırlayın
   1. 50 mL steril sodyum klorür çözeltisine (140 mM) 0.75 g agaroz ekleyin ve bir mikrodalga fırında ısıtarak çözün.
      NOT: Ağar köprü hazırlığı için 2 - 3 M KCl, daha yüksek konsantrasyon ( örneğin köprüden sabit difüzyon) ve K ⁺ ve Cl ^- iyonlarının eşit hareket kabiliyeti nedeniyle LJP'yi daha da düşürür, ancak iyon- (özellikle Cl-) sızıntısını en aza indirgemek için önlenmiştir Içine Banyo çözeltisi ³² .
   2. Bir şırınga kullanarak sıvı agaroz çözeltisi ile 10 mcL pipet uçları (veya küçük çaplı bir hortum) doldurun.
      NOT: Köprüde hava kabarcıklarından kaçının.
   3. Agar köprüleri soğutulduktan ve katılaştıktan sonra, bunları steril 140 mM sodyum klorür çözeltisi içinde saklayın.
8. Kayıt ve banyo elektrotlarını hazırlayın.
   1. Banyodaki gümüş telleri ve patch-clamp tertibatının kayıt elektrodunu çıkarın.
   2. Önceki deneylerdeki gümüş klorürü gidermek için zımpara ile telleri silkeleyin. Temiz gümüş telini 3 M KCl'ye daldırın ve gümüş klorür ile elektrolitik kaplama için 1,5 V'luk bir pozitif kutupa bağlayın.
      NOT: Bir pil yerine bir laboratuar güç kaynağı kullanılabilir.
9. Düşük bir dirençli yama pipetlerini (1.5-3.0 MΩ) cam kılcallardan bir mikropipet çekici ile çekin ve Brown ve diğerleri tarafından tarif edildiği gibi ateş parlatınLass = "xref"> 33. Ölçüm günü için pipetleri tozsuz olarak saklayın.
10. 30 dakika önceki kayıtlardan çalışma sıcaklığına kadar ısınmak için tüm kurulum bileşenlerini açın. Tamponların oda sıcaklığında olduğundan emin olun.

2. Seçkenlik Ölçümleri

1. 1.6'da açıklanan hücrelerin geçici transfeksiyonundan 24-48 saat sonra kayıtları başlatın.
2. Ölçüm odasına bir kapak kayışı yerleştirin ve harici tamponun sızmasını önlemek için silikon ile mühürleyin. Bir sonraki deney seti için petri kabını diğer kapak folyolarıyla birlikte bir kuluçka makinesinde saklayın.
3. Hücrelerin ayrılmasını önlemek için dikkatli bir şekilde hücre dışı tampon (yüksek [Cl ^- ]) doldurun, daha sonra mikroskop altına yerleştirin ve hücre görüntüleme için 40X hedefini kullanın.
4. Banyo elektrodunun üzerine bir agar köprüsü koyun ve sıvı seviyesi sensörü ve banyo tutucusunun perfüzyon çıkışıyla birlikte odaya yerleştirin.
5. Eski değiştirKalıntı kültür ortamı ve ayrılmış hücreleri çıkarmak için iki kez harici hücre çözeltisi 1 mL taze harici çözelti (yüksek [Cl ^- ]) ile yıkandı.
6. Hücreleri odağa getirin ve diğer hücrelerden izole edilmesi gereken transfekte (flüoresan) bir hücre arayın. MCherry'i heyecanlandırmak ve görselleştirmek için üç bantlı filtre seti ve turuncu ışık (590 nm; bant genişliği 15 nm;% 100 yoğunluk) kullanın.
   NOT: HEK hücreleri, komşularına boşluk kavşakları ^{34 ile} elektriksel olarak bağlanabilir ve tüm hücre konfigürasyonunda düşük zar direncine neden olabilir.
7. Çekilen pipetlerden birini hücre içi çözeltiyle doldurun ve birkaç kez pipet çevirerek hava kabarcıklarını alın.
8. Pipet tutacağı üzerine pipet takın ve ucun tıkanmasını önlemek için pozitif bir basınç uygulayın.
9. Düzeltme pipetinin ucunu mikroskop altında bulun ve mikromanipülatörü kullanarak hücrenin yakınına gidin.
   NOT: Aşağıdaki adımlar,Mpeptör, veri toplama ve değerlendirme yazılımları.
10. Veri toplama yazılımındaki "membran testi" ni başlatın ve "membran testi" çalıştırırken "banyo modu" kullanarak belirtilen yazılım aracılığıyla manuel veya otomatik olarak bir voltaj adımı (test pulsu, örneğin 10 mS için 5 mV, taban çizgisi 0 mV) Veri edinme yazılımında.
11. Pipet direncinin istenen aralıkta (1,5-3,0 MΩ) olup olmadığını kontrol edin.
12. "Membran testi" nin "banyo modu" nda çalışırken amplifikatördeki pipet kaydırma düğmesini çevirerek pipet potansiyelini ayarlayarak sıfır ofset akımlar.
13. Tüm hücre konfigürasyonunda bir yama oluşturun ²⁶ .
    NOT: Aşağıdaki adımlar, kullanılan pipet tutucusunun yan bağlantı noktasına iletilen pozitif ve negatif basınç uygulamasını gerektirir. Bu, bir şırınga, bir ağız parçası veya bir elektronik olarak koni yoluyla yapılabilirTrolled basınç regülatörü. Bu protokolde pozitif ve negatif basınç bir ağız parçası vasıtasıyla uygulanır.
    1. Üzerinden yama pipetiyle hücrenin yanına yavaş yavaş yaklaşın ve dokunmadan önce pozitif basıncı rahatlatın.
       NOT: Uç hücreye yakın olduğunda, direnç hafifçe yükselir; Bu, test darbesinin azaltılmış boyutu ile gösterilir.
    2. "Membran testi" ni "banyo modu" ndan "yama modu" na, böylece bekleme potansiyelini beklenen istirahat potansiyeline (-30 ila -40 mV) değiştirin.
    3. Bazı durumlarda, hücreye bağlı konfigürasyon, pozitif basıncın (2.13.1) serbest bırakılmasından sonra kendini oluşturur, öyle değilse, gigaseal oluşumuna yardımcı olmak için yavaşça negatif basınç uygulayın.
       NOT: Test ekibi, darbenin başında ve sonunda iki küçük kapasitif tepe değerine düştüğünde ve membran direnci GΩ aralığında olduğunda, hücreye bağlı yapılandırma kurulur; -60 mV m'ye kadar negatif gerilimlerBu, gigaseal oluşumunu kolaylaştırır.
    4. Test palsına düz tepki elde etmek için "pipet kapasitans kompanzasyonu" düğmelerini çevirerek pipet kapasitesini telafi edin.
    5. Tam hücreli konformasyon elde etmek için, yamayı, negatif basınç veya negatif basınç ile artan mukavemet arasında kısa darbeler uygulayarak mühür bozulmadan yırtın.
       NOT: Hücrelere bağlı hücrelerden tam hücreli konfigürasyona geçiş başarılı bir şekilde kapasitif zirve artışıyla belirtilir.
    6. Zar potansiyelini istenen tutma voltajına doğru sıkıştırmak için, bütün hücre parametresini ve kullanılan amplifikatörün telafi ayarlarını ayarlayarak seri direnç telafisini uygulayın.
       1. "Seri direnç telafisi" paneli "membran testi" ni "bütün hücre" moduna geçirin, kapasitif yanıtın aşırı ve titremesinden kaçınarak "tahmini" ve "düzeltme" değerlerini 90'a kadar açın, tüm hücreyi açınKompanzasyon anahtarı açılmalı ve tüm hücre parametrelerini, ideal olarak düz bir test sızdırmazlık tepkisi elde etmek için amplifikatörün uygun ön panel düğmeleriyle ("bütün hücre kapasitesi" ve "seri direnci") tekrarlayan bir şekilde ayarlayın.
          NOT: Bu prosedür farklı imalatçılar arasında değişiklik göstereceğinden seri direnç telafisinin ve düzeltmesinin ayrıntılı açıklaması için amplifikatör el kitabına veya kılavuza bakın.
    7. Tam hücre konfigürasyonunu oluşturduktan sonra, yama pipet ³⁵ aracılığıyla hücre içi çözeltinin yeterli bir şekilde değiştirilmesini sağlamak için kayıttan önce en az 2 dakika bekleyin.
14. Daha önce kurulmuş olan protokolleri kullanarak ışık tutarlı akımları farklı tutma potansiyellerinde kaydedin (1.2'de).
15. Ekstraselüler tamponu bölgedeki düşük [Cl ^- ] yamayı yok etmeden en az beş kez değiştirin ve t de bir başka akım-gerilim ilişkisi (adım 1.2'yi kaydedin) kaydedinO yeni klorür konsantrasyonu.
    NOT: Otomatik tampon değişimi için bir perfüzyon sistemi bu işlemi kolaylaştırır, ancak gerekli değildir.
16. 2.15'i tekrarlayın. Test edilecek her iyonik koşul için, ancak yukarıda açıklanan "membran testi" ile ölçümler arasındaki yamanın kalitesini defalarca kontrol edin.
    NOT: Doğru membran voltajını ve istikrarlı hücre içi iyon kompozisyonunu garanti altına almak için zar direnci 500 MΩ'un üzerinde olmalıdır, oysa erişim direnci 10 MΩ'u geçmemelidir, bkz . 2.12.6). Membran testi için bütün hücre parametre kompanzasyonunu kapatmayı unutmayın.
17. 2.2 tekrarlayın. 2.15'e. Birkaç hücre için, ancak hücrelerin sağlıklı olmasını sağlamak için her test serisi için yeni bir kapak kayışı kullanın.

3. Veri Değerlendirmesi

1. Aydınlatmadan önce ortalama akımı çıkararak her akım izinin taban çizgisini ayarlayın.
2. Ortalama durağan fotokupi I _s ( NOT: Protokole veya bilimsel soruna bağlı olarak sabit fotokupili belirlemek için zirve ışık akımlarını analiz edin veya ortalamanın uzunluğunu değiştirin.
3. Test edilen tüm koşullar ve farklı hücreler için 3.1 ve 3.2 adımlarını tekrarlayın.
4. Elde edilen tutma potansiyeline karşı belirlenen fotokroaller çizin.
   NOT: Birden fazla ölçüm ortalaması alınırsa, bireysel kayıtlar belirli bir koşula veya hücrenin kapasitesine göre normalleştirilebilir.
5. Akım-voltaj ilişkisinin voltaj ekseni ile kesişimi, ters potansiyelini (net akım sıfır) temsil eder. İki komşu veri noktası arasındaki doğrusal enterpolasyonla bunu belirleyin.
   NOT: Fotokrasilerin polarite tersine çevrilmesi yoksa, kesişme noktasının bir yaklaştırmasını elde etmek için son iki noktadan doğrusal olarak ekspolasyon yapın.
6. Belirlenmiş r ortalamasının ortalamasıAynı koşullar için everspower potansiyelleri ve onları harici tampon çözeltilerinin klorür konsantrasyonuna karşı planlayın ( Şekil 2B'ye bakın ).

Sonuçlar

Şekil 2 , tarif edilen protokolden sonraki ölçümlerden elde edilen temsili sonuçları göstermektedir. Yeşil ışık ile aydınlatma esnasında, Ps ACR1 hızlı bir geçici akım içerir ve bu hızla sabit bir akım seviyesine kadar azalır. Işık kapatıldıktan sonra, fotokupiller milisaniye içinde sıfıra iner ( Şekil 2A ). Ekstrasellüler klorür konsantrasyonunun değişimi, elde edilen fotokupl izlerinde doğrudan görülebilen ters potansiyelin kaymasına neden olu...

Tartışma

Tanımlanmış iyonik ve elektrik koşullarındaki ters potansiyellerin saptanması, ChRs'in ışık aktivasyonu sonrasında taşınan iyon türleri hakkında bilgi verir. Tek bir iyon türü karmaşık bir fizyolojik ortamda çeşitlenirse ve elde edilen ters potansiyel teorik Nernst potansiyeline göre değişirse, bu iyon türü taşınan tek sayıdır.

Bununla birlikte, ChR'ler için, ters potansiyel kaymalar, farklı iyonik türlere geçirgenlik ve ayrıca iletken iyonlar arasındaki rekabet nedeniyle Nernst denk...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HEK293 hücreleri	Sigma Aldrich	85120602	İnsan embriyonik böbrek hücreleri
Retinal	Sigma Aldrich	R2500	all-trans retinal
FuGENE HD	Promega	E2312	Transfeksiyon reaktifi
DMEM	Biochrome	FG 0445	Dulbecco'nun Modifiye Kartal Orta
Agaroz	Roth	3810	Agar köprüleri
CaCl2	Roth	5239	CaCl2 2H2O
CsCl	Biomol	2452
EGTA	Roth	3054
FBS	Biyokrom	S0615	Hücre kültürü
Glikoz	Roth	HN06	D (+) - Glikoz
KCl	Roth	6781
MgCl2	Roth	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	Roth	3957
NMG	Sigma Aldrich	M2004	N-Metil-D-glukamin
Na-Aspartat	Sigma Aldrich	A6683	L-Aspartik asit sodyum tuzu monohidrat
Sitrik asit	Roth	6490
AgeI	ThermoFischerScientific	ER1462	Restriksiyon enzimi
XhoI	ThermoFischerScientific	ER0695	Restriksiyon enzimi
NheI	ThermoFischerScientific	ER0975	Restriksiyon enzimi
XL1Blue E. coli	Agilent Technologies	200249	Kemokompetif E. coli
Kanamisin	Roth	T832
Lizojeni et suyu ortamı	Roth	X964
Agar-Agar	Roth	6494	Agar plakaları
Plazmid saflaştırma kiti	Marchery-Nagel	740727.25
Penisilin / Streptomisin	Biyokrom	A 2213	Hücre kültürü
Poli-D-lizin hidrobromür	Sigma Aldrich	P6407-5MG	Kapak kayma kaplaması
Microforge	Özel yapım		Yangın parlatma
Serolojik pipetler	TPP		Farklı boyutlar
Temiz tezgah	Kojair	Biowizard SL130
Karıştırıcı	IKA	RCT klasik
Gümüş tel	Bilim Ürünleri	AG-T25; AG-T10	Elektrotlar, 0,64 mm (banyo); 0,25 mm (elektrot)
pH ölçer	Knick	765 Kalimetrik
Ozmometre	Vogel	OM 815
Mikroskop	Carl Zeiss	ID03	Yangın parlatma
CO2 inkübatörü	Bağlayıcı	CB150
Hücre kültürü kapları	TPP	93040	34 mm iç çap
Kapak kızakları	Roth	P232	15 mm çap
Termometre	Rö ssel Messtechnik	MTM12
Işın ayırıcı	Chroma	21011	90/10 iletim
Pipet tutucu	ALA Scientific Instruments	PPH-1P-AXU-0-1.5
Headstage	Moleküler Cihazlar	CV203BU
Amplifikatör	Moleküler Cihazlar	AxoPatch200B
Sayısallaştırıcı Moleküler	Cihazlar	DigiData1400	Dijital analog dönüştürücü
Işık kaynağı	TILL Fotonik	Polikrom V	540 nm tam yoğunluğa ayarlayın
Mikroskop	Carl Zeiss	Axiovert 100
Deklanşör	Vincent Associates	VS25
Deklanşör sürücüsü	Vincent Associates	VCM-D1
Cam kapilarries	Warner Instruments	G150F-3	Ateşle parlatılmış uçları olan boresilikat kılcal damarlar OD 1,5 mm İç çap 0,86 mm
Mikropipet çektirme Sutter	Instruments	P1000
Banyo işleyicisi	Lorenz Messgerä tebau	MPCU
Üç Bantlı filtre seti	Chroma	69008	Floresan filtresi  ECFP/EYFP/mKiraz
CCD kamera	Watec	Wat-221SCCD
Optometre	Gigahertz Optik	P9710	Işık yoğunluklarını ölçün
Objektif	Carl Zeiss	421462-9900-000	W Plan-Apochromat 40X/1.0 DIC
Mikromanipülatör	Scientifica	PatchStar
Kayıt odası	Özel yapım
Güç kaynağı	Manson	HCS-3202	Mikroskoptan kaynaklanan elektriksel gürültüyü önler dahili güç kaynağı
Titreşim yalıtımlı masa	Newport	M-VW-3636-OPT-01
Faraday kafesi	Özel yapım veya herhangi bir ticari eşleştirme masası
Hortumlar	Herhangi bir ticari; örneğin Roth		Banyo kullanımı ve pipet basıncının uygulanması için farklı boyutlar ve malzemeler; agar köprüleri
Doğrusal çalkalayıcı	Sunlab Instruments	SU 1000
Sıvı bağlantı potansiyeli hesaplayıcısı	Moleküler Cihazlar veya doğrudan Peter H. Barry		Program, Clampex edinim yazılımına dahildir veya şu adresten edinilebilir: p.barry@unsw.edu.au
Veri toplama yazılımı	Moleküler Cihazlar	Clampex 10.X
Veri değerlendirme yazılımı	Moleküler Cihazlar	Clampfit 10.X
PsACR1	GenBank veya Addgene	KF992074.1 veya Addgene plazmid #85465	PsACR1 için gen kodlaması
Amplifikatör kılavuzu	Moleküler	Cihazlar Akson Kılavuzu