Zebra balığı<em&gt; Situ</em&gt; Omurilik Omurilik duyusal ve motor nöronlar gelen Elektrofizyolojik Recordings Hazırlık

Özet

Bu yazıda zebra balığı embriyolarının ve larva spinal nöronların elektrofizyolojik kayıtları için yöntemleri tarif eder. Hazırlık yerinde nöronları korur ve genellikle asgari diseksiyonu kapsar. Bu yöntemler, erken larva aşamalarında ilk elektrik uyarılma alımından spinal nöronların çeşitli elektrofizyolojik çalışmaları için izin verir.

Özet

İlk gelişimsel model olarak tanıtılan Zebra balığı, diğer pek çok alanda popülerlik kazanmıştır. hızla gelişen organizma çok sayıda büyütme kolaylığı, embriyonik optik netlik ile birlikte, bu modelin ilk zorlayıcı nitelikleri olarak görev yaptı. Son yirmi yılda, bu modelin başarısı daha da büyük ölçekli mutajenez ekranlarına kendi uyumluluğuyla ve transgenesis kolaylığı ile tahrikli edilmiştir. Daha yakın zamanlarda, gen düzenleme yaklaşımlar modelinin gücünü genişletmiştir.

nöro çalışmalar için, zebra balığı embriyo ve larva birden çok yöntem uygulanabilir olan bir model sunmaktadır. Burada, nöronların, elektrik eksitabiliteye temel bir özelliğinin çalışma izin yöntemleri üzerinde durulacak. Zebra balığı spinal nöronların elektrofizyolojik çalışma için Bizim hazırlık bir kayıt odasına hazırlık sabitlemek için veteriner dikiş tutkal kullanımını içerir. kayıt için alternatif yöntemlerzebra balığı embriyolarının ve larva ince bir tungsten pimi ^{1, 2, 3, 4, 5,} kullanılarak bölmesine hazırlama eki içerir. O kadar ⁴ larva dorsal tarafına monte etmek için kullanılmış olsa da bir tungsten pim çoğunlukla, bir yanal yönde hazırlama monte etmek için kullanılır. dikiş tutkal her iki doğrultuda embriyolar ve larvaları monte etmek için kullanılmıştır. tutkal kullanılarak, en az bir diseksiyon ve böylece sonuç olarak ortaya çıkan zarar vermeden, bir enzimatik işlem kullanılmadan spinal nöronlar erişimi sağlayan, gerçekleştirilebilir. Ancak, larva için, omuriliği çevreleyen kas dokusu çıkarmak için kısa bir enzim tedavisi uygulamak gerekir. Burada tarif edilen yöntemler, birçok developmentà motor nöronlar, internöronlar ve duyu nöronlarının içsel elektriksel özelliklerini incelemek için kullanılmıştırL ^{6, 7, 8, 9} aşamaları.

Giriş

George Streisinger, omurgalı gelişimi ¹⁰ genetik analizi için bir model sistem olarak yaygın zebrabalıkları olarak bilinen Danio rerio kullanımını öncülük etmiştir. Model de dahil olmak üzere birçok avantaj sunmaktadır: (1) nispeten basit ve pahalı olmayan bir hayvancılık; (2) dış gübreleme, erken olgunlaşma aşamalarındaki embriyolar kolay erişim sağlayan; ve (3) saydam bir embriyo, oluştuklarında hücreler, dokular ve organlarda doğrudan ve tekrar gözlemler imkan verir.

takip eden yıllarda, birçok ilerlemeler daha da zebrabalıkları modelin gücünü artırmıştır. Özellikle, ileri genetik ekranlar ve tam ....

Protokol

(; Laboratuar Hayvan Kaynakları Dairesi, Colorado ANSCHÜTZ Üniversitesi Tıp Kampüsü IACUC) Bütün hayvan prosedürleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Zebra balığı Yetiştiriciliği

1. Kaldırın ve 10 saat karanlık / 14 saatlik ışık döngüsüne ve uygun su arıtma ve karşılığında ⁵² ile 28.5 ° C 'de, yetişkin zebra balığı (Danio rerio) korur.
2. Arzu edilen aşamaya (örneğin, 2 dpf) oluşana kadar embriyo ortamda 28.5 ° C 'de zebra balığı embriyolar / larva kaldırın.

Diseksiyon Malzemelerin 2. Hazırlık

1. <....

Sonuçlar

Başarıyla dpf larvaları ile 7 17 büyük büyütme embriyolar Rohon-Sakal nöronlardan kaydettik (Şekil 5A ve 5B). Rohon-Sakal hücreler kaydedildi preparasyon sırt tarafı yukarı monte edilmiştir. Bu tür montaj bunların yüzeysel sırt konum ve büyük soma boyutlarına göre Rohon-Sakal hücrelerinin açık tanımlanmasına izin verir. Kimlik ek bu nöronların basmakalıp hiperpolarize dinlenme membran potansiyelinin (Şekil 5, ek tablo)

Tartışma

Burada tarif edilen yöntemler, omuriliğin en az diseksiyon sonra zebra balığı embriyolarının duyu ve motor nöronların elektriksel ve morfolojik özelliklerini belirlemek için izin verir. Nöronlar, en az 1 saat, bu kayıtların üzerine uygulanan süre sağlıklı kalması. Nöronlar, standart tam hücre konfigürasyonu kullanılarak kaydedilmiştir da çekirdekli yamalardan gibidir; ikinci yöntem iyon akımlarının ⁹ detaylı bir biyofiziksel çalışma engelleyebilirler yer kelepçe sorunları en aza indirir.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Vakum filtresi / Saklama şişesi, 0,22 mm gözenekli	Corning	431096
Şırınga filtresi 0,2 mm	Whatman	6780-2502
Trikain	Sigma	A-5040	Etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu
α-bugarotoksin	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoksin	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 hidrazin tuzu	Moleküler Problar	A-10438	floresan boya
Spin-X santrifüj tüpü filtresi	Corning	8161
Cam mikroskop slaytı	Fisher	12-550C
Sylgard silikon elastomer kiti	Dow Corning	184	silikon elastomer
Petri kapları	Falcon	351029
Borosilikat cam kılcal damarlar	Harvard Aparatı	30-0038	0,78 ve 1,0 mm iç ve dış çaplar (ince cidarlı cam kılcal damarlar)
Borosilikat cam kılcal damarlar	Drummond Scientific	1-000-1000-100	1.13 ve 1.55 mm iç ve dış çaplar (kalın duvarlı cam kılcal damarlar)
Minyatür dikenli polipropilen bağlantı parçası	Cole-Palmer	6365-90
Vetbond doku yapıştırıcısı	3M	1469SB
Kollajenaz XI	Sigma	C7657
Mikroelektrot çektirme	Sutter Instruments	Model P-97
Amplifikatör	Moleküler Cihazlar	Axopatch 200B
Baş aşama	Moleküler Cihazlar	CV203BU
Motorlu mikromanipülatör	Sutter Instruments	MP-285
Tygon boru	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN ve WALL 1/32 IN (esnek laboratuvar boruları)
Elektrot tutucu	Moleküler Cihazlar	1-HC-U
Pharmaseal Üç Musluklar	Baxter	K75
Sayısallaştırıcı	Axon Instruments Digidata	1440A
Ters mikroskop	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40X/0.80W Achroplan objektif	Zeiss
Veri toplama ve analiz yazılımı	Axon Instruments		PClamp 10 - Clampex ve Clampfit
Mikropipet çektirme Sutter	Aletleri	Model P-97
Name	Company	Katalog Numarası	Comments
Diseksiyon ve Kayıt Çözümleri (mM cinsinden)
Hücre içi hariç tüm çözeltiler süzüldüğünde (0,22 mm filtre kapları) ve oda sıcaklığında (RT) saklandığında ~ 2-3 ay stabildir.
Hücre içi çözelti süzülür (0.2 mm şırınga filtreleri) ve donmuş olarak saklanır (-20 °C C) kullanım gününde ayrı ayrı çözülen küçük alikotlarda.
Diseksiyon / Zil Sesi' s çözeltisi			145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (NaOH ile
)Pipet (hücre içi) kayıt çözeltisi			135 KCl, 10 EGTA asidi, 10 HEPES; pH 7.4 (KOH ile).
Banyo (hücre dışı) kayıt çözeltisi / voltaj ve akım kelepçesi			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl < sub>2< / sub>.2H < sub > 2 < / sub>O, 5 HEPES; pH 7.4 (NaOH ile).
Alexa-594 hidrazin tuzu stok çözeltisi.			ddH2O, aliquot (~100 &mikro; l) ve -20 ° C'de saklayın. Kullanım için, 132 kat çözelti içindeki stoğu pipet çözeltisi ile 100 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Seyreltmeden sonra, pipet çözeltisi içeren Alexa-594'ü filtreleyin  bir santrifüj tüpü filtresi ile.
Adı< / güçlü >	< güçlü > Şirket< / güçlü >	< güçlü > Katalog Numarası< / güçlü >	< güçlü > Yorumlar< / güçlü >
< güçlü > İmmobilize edici ajanlar< / güçlü>
% 0.4 etil 3-aminobenzoat metansülfonat tuzu (Trikain)	0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Trikain / 100 mL 0.2 M Tris)
NaOH ile pH'ı 7'ye ayarlayın ve -20 °C'de saklayın.
Kullanım için, stok çözeltisini embriyo ortamında ~ 25 kat seyreltin
250 mM &alfa;-bungarotoksin			ddH2O (1 mg / 500 mL) içinde 250 mM'lik bir stok hazırlayın, 100 & mikro hazırlayın; L alikotlar ve -20 ° C'de sotre.
Kullanım için, hücre dışı çözelti ile 2.500 kat seyrelterek 100 nM'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
1 mM Tetrodotoksin			ddH2O'da (1 mg / 3 mL) 1 mM stok hazırlayın, 100 & mikro hazırlayın; L alikotlar ve -20 ° C'de sotre.
Kullanım için, hücre dışı çözelti ile 500 nM'lik bir nihai konsantrasyona kadar 2.000 kat seyreltin.

içinde% 0.4 stok çözeltisi hazırlayın