Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.

Yöntem makalesi

CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi

11.3K görüntülenme

⸱

DOI:

10.3791/55526

⸱

25 Haziran 2017

 ,  , 
1Centro de Ciencias Genómicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Oncomedic Incorporation, Ciudad de México, 3Laboratorio Internacional de Investigación sobre el Genoma Humano, Universidad Nacional Autónoma de México

Bu makalede

Özet

Burada, sinomi DNA sekanslarına restriksiyon enzim sahalarının yerleştirilmesi ve fonksiyonel plazmid geri kazanımına dayanan bir protokol olan plazmit geri kazanım ve restriksiyon enzim yeri ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. Bu protokol protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Özet

Burada, plazmid geri kazanım ve kısıtlama enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajını sunuyoruz. CAPRRESI orijinal plazmid geri kazanım yönteminin pek çok avantajından yararlanır ve DNA ligasyon reaksiyonlarını kolaylaştırmak için kısıtlama enzimi sindirimini sağlar (kimera montajı için gerekli). Bu protokol için, kullanıcılar aynı plazmite vahşi tip genleri klonlamışlardır (pUC18 veya pUC19). Kimeraların birleştirilmesi gereken amino asit dizisi bölgelerinin in silico seçiminden sonra, kullanıcılar şifreleyen tüm eşanlamlı DNA dizilerini elde eder. Geçici Perl betiği, kullanıcıların tüm eş anlamlı DNA dizilerini belirlemelerini sağlar. Bu adımdan sonra, başka bir Perl betiği tüm eş anlamlı DNA dizileri üzerinde kısıtlama enzim siteleri arar. Bu siliko analiz de pUC18 / 19 plazmidlerinde bulunan ampisilin direnç genini ( ampR ) kullanarak gerçekleştirilir. Kullanıcılar, PCR ile wildfit ve ampR genlerini parçalamak için eşanlamlı bölgeler içerisindeki oligonükleotidleri tasarlarlar . Obt'dan sonraTamamlayıcı DNA fragmanlarını arındırma ve saflaştırma, kısıtlama enzimi sindirimi gerçekleştirilir. Şimera montajı, uygun tamamlayıcı DNA fragmanlarının bağlanmasıyla gerçekleştirilir. Küçük ebat (2.686 baz çifti), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik gibi teknik avantajlar sundukları için CAPRRESI için pUC18 / 19 vektörleri seçilmiştir. Kimera montajı için restriksiyon enzimlerinin kullanımı, künt uçlu ürünler üreten DNA polimerazlarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. CAPRRESI, protein kodlayan genlerin eritilmesi için hızlı ve düşük maliyetli bir yöntemdir.

Giriş

Kimerik gen montajı, protein fonksiyonunu ve / veya biyoteknolojik amaçları aydınlatmak için moleküler biyolojide yaygın şekilde kullanılmaktadır. Çakışan PCR ürün amplifikasyonu 1 , plasmid geri kazanım 2 , homolog rekombinasyon 3 , CRISPR-Cas9 sistemleri 4 , bölgeye yönelik rekombinasyon 5 ve Gibson topluluğu 6 gibi genleri kaynaştırmak için farklı yöntemler mevcuttur. Bunların her biri farklı teknik avantajlar sunmaktadır; Örtüşen PCR tasarımının esnekliği, plazmid geri kazanım sırasında yapıların in vivo seçimi veya CRISPR-Cas9 ve Gibson sistemlerinin yüksek etkinliği. Öte yandan, bu yöntemlerin bazılarını yerine getirirken bazı zorluklar ortaya çıkabilir; Örneğin, ilk iki yaklaşım kör uçlu DNA fragmanlarına dayanır ve bu tür ürünlerin ligasyonu stik ile karşılaştırıldığında teknik açıdan zor olabilirKy-bitişli ligasyon. Site yönlendirmeli rekombinasyon, CreoLuxP sisteminde olduğu gibi, orijinal üzerinde fazladan DNA dizileri izi bırakabilir ( 5) . CRISPR-Cas9 bazen hedef bölgeye ek olarak diğer genom bölgelerini de değiştirebilir 4 .

Burada, plasmid geri kazanım yöntemini (PRM) eşanlamlı DNA dizileri üzerindeki kısıtlama enzimi alanlarının eklenmesi ile birleştiren protein kodlayıcı genlerin kaynaştırılması için bir protokol olan plazmid kurtarma ve restriksiyon enzim bölgesi ekleme (CAPRRESI) ile kinera montajı başlattığımızdan, ligasyon verimliliğini arttırıyoruz . Amino asit dizilimi bütünlüğünü sağlamak için, sınırlama enzimi sahaları, eş anlamlı DNA sekansı uzantılarına eklenir. CAPPRESI'nin yararları sıradan laboratuar reaktifleri / araçları ( örneğin enzimler, yetkili hücreler, çözeltiler ve termosikleler) kullanılarak gerçekleştirilebilmesi ve hızlı enzim (uygun enzim kullanıldığında) hızlı sonuçlar verebilmesidir. Kısıtlamaya güvenmekEş anlamlı DNA sekanslarından çıkan enzim siteleri, ilgi proteinleri içindeki tam füzyon noktalarının seçimini sınırlayabilir. Bu gibi durumlarda, hedef genler örtüşen oligonükleotidler kullanılarak kaynaştırılmalı ve sınır enzimi alanları vektörün direnç geni üzerine eklenmelidir.

CAPRRESI yedi basit adımdan oluşur ( Şekil 1 ): 1) klonlama vektörü, pUC18 veya pUC196'nın seçilmesi; 2) kaynaştırılacak olan vahşi tipli dizilerin in silico analizinde; 3) kimera montajı ve plasmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçilmesi; 4) sınırlama enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretilmesi; 5) vahşi tiplendirilmiş genlerin seçilen plazmite bağımsız olarak klonlanması; 6) PCR ile plasmid parçalanması, ardından kısıtlama enzimi sindirimi; Ve 7) DNA ligasyonu ve bakteri dönüşümü kullanılarak plazmid geri kazanım. Bu teknikle üretilen kimerik genler,Sıralama.

PUC18 / 19 vektörleri, küçük boy ( yani 2,686 baz çiftleri), yüksek kopya sayısı, avantajlı sıralama reaksiyon özellikleri ve ticari kullanılabilirlik 7 gibi klonlama ve kimera montajı için teknik avantajlar sunar. Burada, kimera bir araya getirmek ve işlemek için bir Escherichia coli ana ürünü kullanıldı, çünkü bakteri kültürleri ucuzdur ve hızlı büyürler. Bu durumda, füzyon fragmanlarının nihai hedef plasmidlere daha sonra klonlanması gerekecektir ( örn., Bakterilerde pRK415 veya memeli hücrelerinde pCMV gibi ifade vektörleri).

CAPRRESI, iki primer sigma faktörü geninin füzyonu için test edildi: E. colirpoD ve Rhizobium etlisigA . Birincil sigma faktörleri, transkripsiyonun başlatılmasından sorumlu RNA polimeraz altbirimleridir ve bunlar dört alan ( yani, σ1, σ2, σ3 ve σ4) 8'den oluşur . Amino asit dizisi lengtRpoD ve sigA tarafından kodlanan proteinlerin sırasıyla sırasıyla 613 ve 685'dir . RpoD ve SigA% 48 kimliğe sahiptir (% 98 kapsama alanı). Bu primer sigma faktörleri, bölgeler σ2 ve σ3 arasında iki tamamlayıcı parçaya ayrıldı. Bu tasarıma göre iki şimerik gen toplandı: chimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) ve kimerik 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). DNA füzyon ürünleri sıralamayla doğrulanmıştır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

1. CAPRRESI Protokolü

NOT: Şekil 1 , genel CAPRRESI protokolünü gösterir. Bu teknik, siliko tasarıma ve arzulanan kimeraların oluşturulmasına dayanır.

  1. Klonlama plasmidinin seçimi, pUC18 veya pUC19.
    1. Teknik taleplere en iyi uyan pUC vektörünü seçin.
      NOT: Her iki vektör birden fazla klonlama alanının yönlendirilmesi haricinde aynı sıraya sahiptir. Bu, oligonükleotidlerin tasarımı ve PCR plazmiti parçalanması için önemlidir.
  2. Vahşi tipli genlerin ve pUC18 / 19 dizilerinin in silico analizi.
    1. Vahşi tipli genlerin DNA dizilerini elde edin ve bir FASTA format dosyasına kaydedin ( ör . Genes.fas).
      NOT: pUC18 / 19 vektörlerinin sekansları pUC.fas dosyasında bulunur ( Şekil 1 , adım 1).
    2. Hangi kısıtlama enzimini belirleyinYmes, REsearch.pl komut dosyasını çalıştırarak vahşi tipli genleri ve pUC18 / 19 dizilerini kesmeyin. Alternatif olarak, bir çevrimiçi araç ile bir kısıtlama enzim bölgesi araştırması yapın ( Şekil 1 , adım 2).
      1. Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın:
        Perl REsearch.pl genes.fas
        Perl REsearch.pl pUC.fas
        NOT: Bu komutlar aşağıdaki çıktı dosyalarını oluşturur: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas ve pUC_re.fas.
      2. Yabanıl tip genleri, genes_re.fas ve pUC.fas dosyalarını karşılaştırarak seçilen pUC18 / 19 vektörünün çoklu klonlama alanına klonlamak için uygun kısıtlama enzimlerini seçin. Ekin pUC18 / 19 vektörünün ampisilin direnç genine ( ampR ) göre yönünü seçin.
    3. Vahşi tip genlerin kodlama bölgesini (dış oligonükleotidler) büyütmek için ileri ve ters oligonükleotitler tasarlayın. Her 5 'ucuna uygun kısıtlama enzimi bölgesi dahil edinOligonükleotitlerin; Bu insert yönünü belirleyecektir.
      1. İleri oligonükleotidlerde fonksiyonel bir ribozom bağlama sitesi ekleyin.
      2. Her iki vahşi türevi geni de vektörün içine aynı yönde yerleştirin.
  3. Kimera montajı ve plazmid bozulması için kırılma bölgelerinin seçimi.
    1. Translate.pl komut dosyasını çalıştırarak vahşi ve ampR genlerinin amino asit dizisini elde edin ( Şekil 1 , adım 3).
      1. Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın:
        Perl translate.pl genes.fas
        Perl translate.pl ampr.fas
        NOT: Bu betik aşağıdaki çıktı dosyalarını oluşturacaktır: genes_aa.fas ve ampR_aa.fas.
    2. İki vahşi amino asit sekansını uygun bir yazılımla ( örn . KASÇI) küresel olarak hizalayın 9 .
    3. Kimera asse için istenen kırılma bölgelerini seçin (3-6 amino asit)Sıralı hizalamaya dayalı olarak mbly. Onları FASTA formatındaki bir dosyaya kaydedin ( ör . , Regions.fas).
    4. Seçilen amino asit uzayı kodlayan DNA sekanslarını her iki yabanıl tip gen üzerinde bulun.
  4. Restriksiyon enzimi alanlarını içeren eşanlamlı DNA sekanslarının üretimi.
    1. Kırma bölgeleri olarak seçilen her bir amino asit sekansı gerginliği için kodlayan tüm eş anlamlı DNA dizilerini elde edin ( Şekil 1 , adım 4); Bu sekanslar regions.fas dosyasında saklandı.
      1. Bir terminalin içine aşağıdakileri yazın:
        Perl synonym.pl regions.fas
        NOT: Bu betik regions_syn.fas çıktı dosyasını oluşturacaktır.
    2. Sinonim DNA dizileri üzerinde bulunan kısıtlama enzim sitelerini arayın.
      1. Bir terminal içine aşağıdakileri yazın: perl REsynonym.pl regions_syn.fas
        NOT: Bu betik, regions_syn-re.fas çıktı dosyasını oluşturacaktır.
    3. Her iki vahşi tipli genin eşanlamlı sekansları arasında paylaşılan bir kısıtlama enzimi seçin; Bu site kısıtlama enzimi sindirimi yoluyla kimeraları bir araya getirmek için kullanılacaktır. Seçilen kısıtlama enziminin, ne vahşi tip genleri ne de pUC18 / 19 vektör sekanslarını kesmediğini doğrulayın.
      1. Genes_re.fas, pUC_re.fas ve regions_syn-re.fas dosyalarında bulunan kısıtlama enzimlerini karşılaştırın.
    4. Silikonun orijinallerini, eşanlamlı DNA dizileri için, her iki vahşi türe ait genin karşılık gelen lokuslarında değiştirin. Eşanlamlı DNA dizilerini vahşi dizi dosyasına (genes.fas) ekleyin.
    5. Genes.fas dosyasında bulunan genlerin amino asit dizisini elde edin ( perl translate.pl genes.fas ).
    6. Vahşi ve eş anlamlı DNA dizilerinden çevrilen amino asit dizilerini hizalayın. Her iki dizinin de aynı olduğunu doğrulayın.
    7. PU üzerinde bulunan ampR geni ile bu bölümün tüm adımlarını tekrarlayınC18 / 19 vektör.
      NOT: Amaç, ampR genini (dosya ampr.fas) iki tamamlayıcı parçaya bölmektir. AmpR genini bozmak için seçilen kısıtlama enzimi, kimera montajı için kullanılanlardan farklı olmalıdır.
  5. İki vahşi türe ait genin seçilen pUC18 / 19 vektörüne bağımsız olarak klonlanması (Şekil 1, adım 3).
    1. Seçilen pUC18 / 19 plasmid DNA'sını bir plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
      1. Örneğin E. coli DH5α'nın pUC18 plazmid ile transforme edilmesi ve transformantların 37 ° C'de katı LB-0.3 mg / mL ampisilin (Amp) üzerinde büyümesini sağlayın. Bir transformant koloni seçin, yeni bir LB-0.3 mg / mL Amp plakası inoküle edin ve gece boyunca 37 ° C'de büyütün.
      2. Önceki kültürden bir miktar alın ve 6-8 saat boyunca 37 ° C'de sıvı LB-0.3 mg / mL Amp içinde büyütün. Plazmid DNA'sını bir kit kullanarak çıkarın.
    2. PCR kullanılarak, toplam genomik DNA'dan vahşi tip genler yükseltilirHarici oligonükleotidleri saflaştır. Mümkünse yüksek kaliteli DNA polimeraz kullanın. Verimi en üst düzeye çıkaran DNA polimerazını seçin. PCR, üreticinin talimatlarına ve oligonükleotidlerin erime sıcaklığına göre gerçekleştirilir.
      1. Kullanılan DNA polimeraz, amplikon boyutu, şablonu ve oligonükleotitlere bağlı olarak PCR döngülerini çalıştırın. Örneğin, rpoD DNA'sını çoğaltmak için, 50 μL reaksiyon hazırlayın: 5 uL 10x tampon, 2 μL 50 mM MgSO 4 , 10 mM dNTP karışımı 1 uL, her 10-μM oligonükleotidin 2 μL (Tablo 2), 2 Şablon DNA'sı ( E. coli DH5α toplam DNA), 35.8 μL ultra saf su ve 0.2 μL yüksek doğrulukta DNA polimeraz. Aşağıdaki PCR döngülerini çalıştırın: İlk denatürasyon için 1 dakika, ardından 30 çevrim amplifikatörü (denatürasyon için 94 ° C'de 30 saniye, oligonükleotidlerin tavlanması için 60 ° C'de 30 saniye ve 68 ° C'de 2 dakika) genişletmek).
      2. 1.2 g çözünürAgaroz, mikrodalga fırında ısıtılarak 100 mL'lik iki damıtılmış suda yıkanır. Bir jel tepsi ve tarağı toplayın ve yatay jel şist içine koyun. Jel tepsisini eritilmiş agaroz çözeltisi ile doldurun ve katılaşmasına izin verin. Tarağı çıkarın.
      3. Jel elektroforez odasına yerleştirilir. Odaya 1x Tris-asetat-EDTA tamponu doldurun. Jel kuyularına 50 μL PCR ürünü yükleyin. Örnekleri elektroforez ( örn . 110 V'de 1 saat boyunca).
      4. Elektroforezden sonra, jel yavaşça çalkalanarak 10 dakika boyunca 100 mg'lık 1 mg / mL etidyum bromür çözeltisi içeren 100 ml'lik çift damıtılmış suyla lekelenir. Jeli yavaşça sallayarak iki kez damıtılmış suda 10 dakika daha yıkayın; Yatay bir çalkalayıcı kullanın.
        Dikkat: Etidyum bromür toksik bir bileşiktir; Koruyucu eldiven ve pamuklu bir laboratuar önlüğü giyin.
      5. Bir kit kullanarak jelin ilgili bantlarından vahşi tipli gen DNA'yı saflaştırın. Boyanmış jelin bir UV odacığa yerleştirilmesi ile bantları görselleştirin (Önerilen dalga boyu: 300 nm). Jelin maruziyetini asgari seviyede tutun. Bir DNA saflaştırma kiti kullanın ve üreticinin talimatlarını izleyin.
        Dikkat: UV radyasyonu tehlikelidir; Koruyucu bir kalkan, bardak ve pamuk laboratuar ceketi takın.
    3. Üreticinin talimatlarına göre kısıtlama enzimleri ile saflaştırılmış vahşi tipli genleri ve pUC18 / 19 plasmid DNA'yı özümleyin. Mümkünse hızlı sindirim enzimlerini kullanın. Örneğin, ultrafure su 10 uL, 10X tampon 2 mcL, Kpn I kısıtlama enzimi 1 uL ve Xba I kısıtlama enzimi 1 mcL pUC18 DNA (300 ng / μL) sindirmek 6 mcL. Reaksiyonu 30 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın.
      1. Restriksiyon enzimlerini üreticinin talimatlarına göre etkisiz hale getirin. Örneğin, çift sindirim reaksiyonunu Kpn I- Xba I'i 80 ° C'de 5 dakika boyunca etkisiz hale getirin.
    4. Karışım ekleme: hacimsel bir rasattaki vektör DNAO 3: 1. Ligasyon reaksiyonu için üreticinin talimatlarını izleyin. Mümkünse hızlı ligasyon enzimlerini kullanın (reaksiyonu 10 dakika boyunca 25 ° C'de bırakın).
      NOT: Tipik olarak, kitleri kullanarak saflaştırma sonrası DNA konsantrasyonu, sindirim ve ligasyon reaksiyonları için yeterlidir. Örneğin, 6 μL rpoD DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 3 μL pUC18 DNA ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μL), 10 uL 2x tampon, 1 μL ultra safi ilave edin Su ve 1 uL T4 DNA ligazı. Ligasyon reaksiyonu 25 ° C'de 10 dakika bekletilir.
    5. Yardımcı Materyaller'de açıklandığı üzere E. coli DH5α'yı ligasyon reaksiyonundan 2-4 uL ile değiştirin. Dönüştürülen hücreleri katı LB / Amp / X-gal / IPTG plakalarına yerleştirin. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de bırakın.
    6. Beyaz renkli transformant E. coli kolonilerini seçin ve yeni bir LB / Amp plakası üzerine çizin. Plakaları gece boyunca 37 ° C'de bırakın
    7. Ek Malzemelerde açıklandığı gibi, reaksiyonun dizilimi için adayları seçmek için bir koloni PCR yapın. Adalardan plazmid DNA'yı çıkarın. Alternatif olarak, insertleri klonlamak için kullanılan aynı restriksiyon enzimleriyle aday plasmid DNA'yı sindirin.
    8. Sıralı servis sağlayıcı ile sıra adayı yapılandırmaları 10 . Bir DNA birleştirici 11 ( Şekil 1 , adım 5) kullanarak diziyi siliko olarak toplayın .
  6. PCR ile plazma bozunumu, ardından kısıtlama enzimi sindirimi.
    1. Sırasıyla vahşi tip ve ampR genleri için kırılma bölgelerindeki silico ileri ve ters oligonükleotidlerde tasarım. Eşdeğer DNA sekansı için vahşi tip fragmanı (adım 1.4'te elde edilen) siliko olarak değiştirin.
      NOT: Bu eşanlamlı DNA sekansı bir sınır enzim bölgesi içerir. İleri ve geri oligonükleotidler tO kısıtlama enzimi sitesi. Oligonükleotidler 21-27 nükleotid arasında değişmeli ve bir sitozin veya guanin ile sonuçlanmalı ve bir kısıtlama enzimi bölgesi içermelidir. Bir ileri oligonükleotit, şablon DNA üzerindeki hedef bölgesi ile aynı sekansa sahiptir. Bir ters oligonükleotit, şablon DNA üzerindeki hedef bölgenin ters tamamlayıcı dizisidir.
    2. PCR reaksiyonları için DNA şablonu olarak iki vahşi tipli gen yapısını kullanın ( örn., PUC18 rpoD ve pUC18 sigA ). Her bir yapının iki tamamlayıcı parçası elde edin (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2 ve pUC18 sigAσ3-σ4) ( Şekil 1 , adım 6).
    3. DNA örneklerini agaroz jel içine% 1-1.2 [w / v] yükleyin. PCR ürünlerini DNA şablondan elektroforez ile ayırın ( örn . 1 saat boyunca 110 V). Alternatif olarak, DNA şablonunu kırmak için Dpn I ile PCR reaksiyonlarını sindirin .
      NOT: DpnBen enzim sadece metillenmiş DNA dizilerini tanır (5'-GATC-3 ').
      1. Bir DNA saflaştırma kiti kullanarak numuneleri saflaştırın. Üreticinin yönergelerini izleyin.
    4. Üreticinin talimatlarına göre tüm tamamlayıcı DNA parçalarını uygun kısıtlama enzimleri ile iki kez sindirin. Mümkünse hızlı özüt restriksiyon enzimlerini kullanın. Örneğin, pUC18rpoDσ1-σ2 DNA fragmanını Afl II ve Spe I ile üreticinin protokolünü kullanarak çift-sindirin. Sindirim reaksiyonunu 37 ° C'de 15 dakika bekletin.
    5. Restriksiyon enzimlerini üreticinin talimatlarına göre etkisiz hale getirin. Örneğin, Afl II- Spe I'i 80 ° C'de 20 dakika boyunca etkisiz hale getirin.
  7. DNA ligasyonu ve bakteriyel transformasyon kullanılarak plazma geri kazanım.
    1. İstenilen kimerik geni birleştirmek için uygun DNA fragmanlarını hacimsel 1: 1 oranında karıştırın ( Şekil 31, adım 7).
      NOT: Bu yolla ampR geninin bütünlüğü restore edilerek işlevsel bir protein üretilir.
      1. Örneğin, 4 μL pUC18 rpoD σ1-σ2 DNA ( Afl II- Spe I ile sindirim, 150 ng / μL), 4 uL pUC18 sigA σ3-σ4 DNA'sı ( Afl II- Spe I, 150 ng / μL) 10 uL 2x tampon, 2 uL ultra saf su ve 1 uL T4 DNA ligaz; Kitin arındırılmasından sonraki DNA konsantrasyonu, sindirim ve daha sonra ligasyon için yeterlidir. Ligasyon reaksiyonu 25 ° C'de 10 dakika bekletilir.
    2. E. coli DH5α'yı 3-5 μL'lik kinera montaj ligasyon reaksiyonu ile (Takviye Malzemeleri) değiştirin. Gece boyunca 37 ° C'de gece boyunca LB / Amp / X-gal / IPTG plakalardaki transformant hücreleri büyütün.
    3. Beyaz renkli transformant E. coli kolonilerini seçin ve yeni bir LB / Amp plakası üzerine çizin. Plakaları gece 37'de bırakın° C.
    4. Tamamlayıcı Materyaller'de açıklandığı gibi, bir sekanslama reaksiyonu için aday seçmek için bir koloni PCR yapın. % 1-1.2 (w / v) agaroz jelinde bantları elektroforez yaparak gözlemleyin (adım 2.3.2.1'de açıklanmıştır).
    5. Olumlu adaylardan kültürler kazanın. Plazmid DNA saflaştırma kiti kullanarak onlardan plazmid DNA'yı çıkarın.

2. Sıra Adayı Şimerik Yapılar

  1. Sekans servis sağlayıcısının yönergelerini izleyerek, plasmid DNA'nın kalitesinin sıralama reaksiyonu için yeterince iyi olduğundan emin olun. DNA'yı arıtma kitleri kullanarak çıkarın. Örneğin, sekans hizmet sağlayıcısının İnternet sayfasında, numuneler için önerilen DNA konsantrasyonuna özel dikkat gösterin. Bir DNA kantifikasyon cihazı kullanarak numunelerin konsantrasyonunu elde edin.
  2. Sıralı aday kimerik yapılar ile sıralama servis sağlayıcı 10 .
  3. Birleştirin se In silico DNA assembler ile okuma okuma 11 .
  4. Sıralı hizalama takımları 9 , 12 kullanarak toplayılmış karşı silico- tasarlanmış kimerik sekansları hizalayın. Kimerik genin başarıyla kaynaştığını doğrulayın.

3. Hazırlıklar Yapmak

NOT: Canlı hücreleri içeren tüm basamaklar, Bunsen brülörü açıkken temiz bir lamine akış kaputunda yapılmalıdır.

  1. E. coli DH5α-yetkili hücreleri üretmek.
    1. E. coli-uyumlu hücreleri üretmek için, yayınlanmış protokolleri izleyin veya Ek Malzemelere bakın . Alternatif olarak, piyasada bulunan yetkili hücreleri kullanın.
  2. Dönüşen E. coli DH5α-yetkili hücreler.
    1. E. coli kültürlerinin kimyasal transformasyonu için, yayınlanan protokolleri takip edinClass = "xref"> 13 veya Ek Malzemelere bakın . Alternatif olarak bakteriyel transformasyon için elektroporasyon kullanın. Piyasada bulunan yetkili hücreler kullanılıyorsa, üreticinin yönergelerini izleyin.
  3. E. coli DH5α'dan genomik ve plasmid DNA'yı saflaştırma.
    1. Ek Malzemelerde belirtildiği gibi, piyasada bulunan kitleri kullanarak veya yayınlanan protokolleri takip eden nükleik asit ekstraksiyonu gerçekleştirin 13 .
  4. Koloni PCR yapın.
    1. Sonradan sıralama reaksiyonu için aday transformant kolonileri tanımlamak için bu tekniği kullanın.
      NOT: Bu yöntem, dizilerin bütünlüğünün son bir doğrulamasını temsil etmez. Bu tekniğin ayrıntılı bir açıklaması Yardımcı Materyaller'de mevcuttur .
  5. Çözümlerin hazırlanması.
    1. Görmek çözüm hazırlama hakkında daha fazla bilgi için Tablo 1'e bakınız.
  6. CAPRRESI protokolü için gereken komut dosyalarını ve sıra dosyalarını indirin.
    1. İstenen türlerin tüm genom dizisini içeren gen bank dosyalarını indirin, bir genom tarayıcı kullanarak seçilen genin DNA dizisini çıkarın ve fasta dosya biçiminde kaydedin. CAPRRESI protokolü için gerekli olan Perl komut dosyalarını indirin. Komut dizilerini ve sıra dosyalarını aynı dizinde saklayın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 , CAPRRESI'yi tasvir etmektedir. Bu yöntemi kullanarak, iki kimerik gen, iki bakteriyel primer sigma faktörünün alanlarını değiştirerek ( yani, E. coli RpoD ve R. etli SigA) toplandı. RpoD ve sigA genlerinin DNA dizileri sırasıyla GenBank genom dosyalarından Artemis Genome Browser 14 kullanılarak NC_000913 ve NC_007761'den elde edildi. PUC18 vektörünün DNA sekansı, NCBI sunucusu...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CAPRRESI, PRM 2'ye alternatif olarak tasarlandı. Orijinal PRM güçlü bir tekniktir; Seçilen genlerin herhangi bir kısmı boyunca DNA sekanslarının kaynaşmasına izin verir. PRM için, vahşi tipli genler aynı plazmid içine klonlanmalıdır. Bundan sonra, oligonükleotidler, plasmidde bulunan vahşi tip ve antibiyotik direnç genleri içinde tasarlanır. Plazmid parçalanması, künt uçlu, yüksek doğrulukta DNA polimerazları ve önceden tasarlanmış oligonükleotitler kullanılarak PCR ile sağlanır. Tamamlayıcı ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

Bu çalışma Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, Meksika (hibe numarası 154833) ve Universidad Nacional Autónoma de Mexico tarafından desteklendi. Yazarlar, Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos ve Soledad Juarez'e idari ve teknik tavsiyeler için teşekkür etmek istiyorlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Platin Taq DNA polimeraz High FidelityThermo Fisher11304011Künt/3'-A çıkıntı uçlu PCR ürünlerinin bir karışımını üretir
Yüksek saflıkta plazmid izolasyon kitiRoche11754785001Tüm plazmit saflaştırma reaksiyonları için kullanılır
Yüksek saflıkta PCR ürün saflaştırma kitiRoche11732676001Agaroz jellerden elde edilen tüm PCR saflaştırma reaksiyonları
için kullanılırAflII restriksiyon enzimiNew England BiolabsR0520L5'-CTTAAG-3' dizisini tanır ve 37 °C'de keser; C
KpnI-HF kısıtlama enzimiNew England BiolabsR3142L5'-GGTACC-3' dizisini tanır ve 37 °C'de keser; C
SpeI-HF kısıtlama enzimiNew England BiolabsR3133L5'-ACTAGT-3' dizisini tanır ve 37 °C'de keser; C
XbaI kısıtlama enzimiNew England BiolabsR0145L5'-TCTAGA-3' dizisini tanır ve 37 &°C'de keser; C
Ampisilin sodyum tuzuSigma AldrichA0166-5GAntibiyotikler
Nalidiksik asitSigma AldrichN8878-5GAntibiyotikler
Maya ÖzüSigma AldrichY1625-1KGBakteriyel hücre kültürü
Kazein peptonSigma Aldrich70171-500GBakteriyel hücre kültürü
NaClSigma AldrichS9888-1KGSodyum klorür
AgarSigma Aldrich05040-1KGBakteriyel hücre kültürü
XbaI kısıtlama enzimiThermo FisherFD0684Hızlı sindirim XbaI enzim
KpnI kısıtlama enzimiThermo FisherFD0524Hızlı sindirim KpnI enzyme
Hızlı Ligasyon KitiNew England BiolabsM2200SHızlı DNA ligasyon kiti
AflII kısıtlama enzimiThermo FisherFD0834Hızlı sindirim AflII enzyme
SpeI kısıtlama enzimiThermo FisherFD1253Hızlı sindirim SpeI enzyme

Kaynaklar

  1. Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
  2. Vos, M. J., Kampinga, H. H. A PCR amplification strategy for unrestricted generation of chimeric genes. Anal. Biochem. 380 (2), 338-340 (2008).
  3. Hawkins, N. C., Garriga, G., Beh, C. T. Creating Precise GFP Fusions in Plasmids Using Yeast Homologous Recombination. Biotechniques. 34 (1), 1-5 (2003).
  4. Sander, J. D., Joung, J. K. CRISPR-Cas systems for editing, regulating and targeting genomes. Nat Biotechnol. 32 (4), 347-355 (2014).
  5. Nagy, A. Cre recombinase: The universal reagent for genome tailoring. Genesis. 26 (2), 99-109 (2000).
  6. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  7. Norrander, J., Kempe, T., Messing, J. Construction of improved M13 vectors using oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis. Gene. 26 (1), 101-106 (1983).
  8. Gruber, T. M., Gross, C. A. Multiple sigma subunits and the partitioning of bacterial transcription space. Annu Rev Microbiol. 57, 441-466 (2003).
  9. Edgar, R. C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput. Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).
  10. Macrogen Inc. , Seoul, Rep. Of Korea. Available from: http://dna.macrogen.com/eng/index.jsp (2016).
  11. Chevreux, B. MIRA: an automated genome and EST assembler. , Available from: http://www.chevreux.org/thesis/index.html 1-161 (2005).
  12. Thompson, J. D., Gibson, T. J., Higgins, D. G. Multiple sequence alignment using ClustalW and ClustalX. Curr Protoc Bioinformatics. , Chapter 2 (Unit 2.3) 1-22 (2002).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning: A laboratory manual. CSHLP. , (2001).
  14. Rutherford, K., et al. Artemis: sequence visualization and annotation. Bioinformatics. 16 (10), 944-945 (2000).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Etiketler

Sinonim DNA DizileriPerl Betiği AnaliziOligonükleotid TasarımıPCR AmplifikasyonuJel SaflaştırmaDNA Ligasyonu
CAPRRESI: Plazmid Geri Kazanım ve Kısıtlama Enzim Yerinin Eklenmesi ile Chimera Meclisi
Bize Ulaşın
Kütüphaneye Öner

Gizlilik

Kullanım Koşulları

Politikalar

Telif Hakkı © 2026 MyJoVE Corporation. Tüm hakları saklıdır.