Yeni nesil elektroporasyon, gen ekspresyonunu ve hücre davranışını değiştirmek için insan Th17 hücrelerini küçük RNA'larla transfekte etmek için etkili bir yöntemdir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Yeni Nesil Electroporasyonun tarafından İlköğretim İnsan Th17 Hücreleri Küçük RNA Transfeksiyon
Bu makalede
Özet
Özet
CD4+ T hücreleri, çevredeki sitokin ortamına bağlı olarak efektör T yardımcı hücrelerinin birkaç alt kümesine farklılaşabilir. Th17 hücreleri, polarize sitokinler IL-1β, IL-6, IL-23 ve TGFβ varlığında aktive edilerek in vitro olarak naif CD4 + T hücrelerinden üretilebilir. Th17 hücreleri, hücre dışı bakteri ve mantarlara karşı bağışıklığı düzenler, ancak anormal aktiviteleri aynı zamanda çeşitli otoimmün ve enflamatuar hastalıklarla da ilişkilendirilmiştir. Th17 hücreleri, kemokin reseptörü CCR6 ile tanımlanır ve ana transkripsiyon faktörü, RORγt ve karakteristik efektör sitokin IL-17A ile tanımlanır. Th17 hücre farklılaşması için optimize edilmiş kültür koşulları, kontrollü bir ortamda insan T hücresi biyolojisinin mekanik çalışmalarını kolaylaştırır. Ayrıca, RNA girişimi veya mikroRNA (miRNA) taklitçilerinin veya inhibitörlerinin eklenmesi yoluyla belirli genlerin ve gen ekspresyon programlarının önemini incelemek için bir ortam sağlarlar. Bu protokol, yeni nesil bir elektroporasyon cihazı kullanılarak küçük RNA'larla farklılaşan birincil insan Th17 hücrelerinin geçici transfeksiyonu için kullanımı kolay, tekrarlanabilir ve oldukça verimli bir yöntem sağlar.
Giriş
CD4 + T hücreleri adaptif bağışıklık tepkisinin önemli Orkestraya bulunmaktadır. Naif CD4 + T hücreleri, birkaç farklı efektör T hücrelerinin (örneğin Th 1, Th2 Th17, vs.) halinde gelişme yetisine sahip olan, yerel mikro 1 bağlı olarak karakteristik bir sitokinler ve transkripsiyon faktörleri, kendi seti, her biri. T hücreleri yapmak soy kararları kendine hem koruyucu bağışıklığın ve hoşgörü için önemlidir. Th17 hücreleri hücre-dışı bakteriler ve mantarlar ile mücadele için bilinen T hücrelerinin bir alt kümesi, ancak bunların uygun olmayan tepkiler aynı zamanda, mültipl skleroz ve psoriasisin
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Bu protokol, insan araştırma etiği için UCSF yönergelerine uyar.
T Hücre Kültürü, CD4 + T hücrelerinin elde edilmesi, ve, Th17 polarizasyon hazırlanması 1.
- Gün 0, CD3, anti-insan (2 ug / ml) ve anti-insan CD28 oyuk başına 1.5 mL ile kat 6 oyuklu doku kültür plakaları (4 ug / ml), en az 2 saat boyunca, kalsiyum ve magnezyum ile PBS içinde 37 ° C.
- Alternatif olarak, kaplama, gece boyunca 4 ° C'de plakalar. parafilm plakaları sarın.
- üreticinin talimatlarına göre yoğunluk gradyan santrifüjü ile kordon kan mononükleer hücreleri (CBMCs) hazırlayın.
DİKKAT: dikkatle ç....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Başarılı bir şekilde insan Th17 hücrelerini elektroporat güvenilir bir sistem geliştirmek için ilk adım nitro farklılaşmış insan Th17 hücre kültürlerinde sağlam oluşturmak oldu. Th17-polarize koşullar altında kültür T hücreleri kemokin reseptörü CCR6 ve transkripsiyon faktörü RORγt (Şekil 1A, sol) olarak ifade edilmiştir. T hücreleri (sağ Şekil 1A) olmayan polarizasyon (THN) koşullar altında kültüre edildiği zaman Bu işaretleyiciler ola.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Bu protokol, insan Th17 hücrelerine küçük RNA verilmesi için geliştirilmiş bir yöntemi temin etmektedir. İnsan Th17 hücreleri burada kullanılmış olsa da, küçük RNA ile elektroporasyon bu yöntem, Th1, Th2 ve Tregs gibi primer insan T yardımcı alt grupları, birlikte kullanılabilir. Hücreler transfeksiyondan önce kültür içinde etkinleştirilmiş olmalıdır böylece saf CD4 + T hücreleri için, iyi sonuçlar vermemiştir. Bu protokol için, ilk olarak daha iyi bir IL-17A üretimi için in vitro kültür sistemi opti.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.
Teşekkürler
Bu çalışma, ABD Ulusal Sağlık Enstitüleri hibeleri (R01HL109102, P01HL107202, U19CA179512, F31HL131361), Lösemi ve Lenfoma Derneği akademisyen ödülü (K.M.A.) ve Ulusal Genel Tıp Bilimleri Enstitüsü (NIGMS) Tıp Bilimcisi Eğitim Programı (Grant #T32GM007618) (M.M.) tarafından desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| anti-insan IL-17A PE | ebioscience | 12-7179-42 | Klon: eBio64DEC17 |
| anti-insan IFNg FITC | ebioscience | 11-7319-82 | Klon: 4S. B3 |
| anti-insan CD4 eVolve605 | ebioscience | 83-0047-42 | Klon: SK3 |
| fare anti-insan CD196 (CCR6) BV421 | BD biyolojik bilimler | 562515 | Klon: 11A9 |
| anti-insan RORgt AF647 | BD biyolojik bilimler | 563620 | Klon: Q21-559 |
| anti-insan CD45 eFluor450 | ebioscience | 48-9459-42 | Klon: 2D1 |
| Foxp3 / Transkripsiyon Faktörü Boyama Tampon Seti | ebioscience | 00-5523-00 | Hücre içi transkripsiyon faktörü akış sitometrisi boyama için |
| Hu FcR Bağlanma İnhibitörü Saflaştırılmış | ebioscience | 14-9161-71 | |
| ImmunoCult-XF T Hücre Genişletme Ortamı | Kök Hücre Teknolojileri | 10981 | "Serumsuz Baz Ortamı" |
| MACS CD28 saf fonksiyonel sınıf, insan | Miltenyi Biotec | 130-093-375 | Klon: 15E8 |
| anti-insan CD3 Saflaştırılmış | UCSF monoklonal antikor çekirdeği | N/A | Klon: OKT-3 |
| LEAF saflaştırılmış anti-insan IL-4 | Biolegend | 500815 | Klon: MP4-25D2 |
| anti-insan IFNg, fonksiyonel sınıf saflaştırılmış | ebioscience | 16-7318-85 | Klon: NIB42 |
| Rekombinant insan IL-23 | Peprotech | 200-23 | |
| Rekombinant insan IL-1 ve beta; | Peprotech | 200-01B | |
| Rekombinant insan TGF-β 1 | Peprotech | 100-21C | |
| Rekombinant insan IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| siGENOME Kontrol Havuzu, Hedeflemeyen #2 | Dharmacon | D-001206-14-05 | |
| siGENOME SMARTpool İnsan RORC | Dharmacon | M-003442-00 | |
| siGENOME SMARTpool İnsan PTPRC | Dharmacon | M-008067-01 | |
| Dynabeads El Değmemiş İnsan CD4 T Hücreleri Kiti | ThermoFisher Scientific | 11346D | İnsan CD4+ T hücresi İzolasyon Kiti |
| Neon Taşıma Sistemi | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Yeni nesil elektroporasyon cihazı |
| Neon Taşıma Sistemi 10 μ L Kiti | ThermoFisher Scientific | MPK1096 | |
| Yeniden Süspansiyon Tamponu T | ThermoFisher Scientific | Kitte Sağlanır (MPK1096) | "Transfeksiyon Yeniden Süspansiyon Tamponu" |
| Lymphoprep | Kök Hücre Teknolojileri | #07801 | Yoğunluk Gradyanı Orta |
| costar 6 kuyucuklu doku kültürü ile tedavi edilmiş plakalar | Corning | 3516 | düz tabanlı plakalar |
| Costar 48 oyuklu doku kültürü uygulanmış plakalar | Corning | 3548 | düz tabanlı plakalar |
| BD Pharm Lyse lizing tamponu, 10x | BD biosciences | 555899 | Kullanmadan önce damıtılmış su ile 1x çözelti yapılmalıdır |
Kaynaklar
- Zhu, J., Yamane, H., Paul, W. E. Differentiation of Effector CD4 T Cell Populations*. Ann Rev Immunol. 28 (1), 445-489 (2010).
- Korn, T., Bettelli, E., Oukka, M., Kuchroo, V. K. IL-17 and Th17 Cells. Ann Rev Immunol. 27 (1), 485-517 (2009).
- Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
