Birliğin Rekombinant Protein Ekspresyonu, Kristalleştirilmesi ve Biyofiziksel Araştırmaları Bacillus - Konserve Nükleotid Pyrophosphorylase, BcMazG

Özet

Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonunun zorunlu patojendir, bu nedenle genleri ve proteinleri üzerine yapılan çalışmalar kesinlikle düzenlenmiştir. Alternatif bir yaklaşım, ortolog genleri incelemektir. B. cereus , bc1531'de B. antrasis ortologunun biyofizikokimyasal çalışmalarını, minimal deney ekipmanı gerektiren ve ciddi güvenlik endişeleri içermeyen çalışmalarını anlattık.

Özet

Gerçek patojenlerden genleri ve proteinleri incelerken emniyet kısıtlamalarını ve yönetmelikleri aşmak için bunların homologları incelenebilir. Bacillus anthracis ölümcül inhalasyon şarbonuna neden olan zorunlu bir patojendir. Bacillus cereus , yakın evrimsel ilişkisi nedeniyle B. anthracis'i incelemek için faydalı bir model olarak düşünülür. B. anthracis'in ba1554 - ba1558 gen kümesi B. cereus'daki bc1531 - bc1535 kümesi ile Bacillus thuringiensis'deki bt1364 - bt1368 kümesi ile yüksek oranda korunmuştur, bu da Bacillus cinsindeki ilişkili genlerin kritik rolünü göstermektedir. Bu el yazması, B. anthracis'teki gen kümesinden birinci gen ( ba1554 ) 'ün bir protein ürününü B. cereus , bc1531'deki ortologunun rekombinant bir proteinini kullanarak hazırlamak ve karakterize etmek için kullanılan yöntemleri açıklamaktadır.

Giriş

Rekombinant protein ekspresyonu, sınırlı protein miktarı ve zararlı kontaminasyon gibi doğal protein kaynaklarıyla ilişkili problemlerin üstesinden gelmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ayrıca, patojenik genler ve protein araştırmalarında ilave güvenlik önlemleri gerektirmeyen alternatif bir laboratuvar suşu kullanılabilir. Örneğin, Bacillus cereus , yakın evrimsel ilişkileri nedeniyle Bacillus anthracis'i incelemek için faydalı bir modeldir ¹ .

B. anthracis , insanlarda ve hayvanlarda ölümcül inhalasyon şarbonuna neden olan zorunlu bir patojendir ve potansiyel olarak bir biyolojik silah olarak kullanılabilir ² . Dolayısıyla, B. anthracis ile ilgili laboratuvar çalışmaları, ABD Hastalık Kontrol Merkezleri tarafından sıkı bir şekilde düzenlenir ve laboratuar alanının negatif oda basıncıyla ayrılması zorunluluğu getiren biyogüvenlik seviyesi 3 (BSL-3) uygulamaları gerektirir. B. anthracis'in aksine , B. cereus bir BSL-1 ajan olarak kategorize edilir ve bu nedenle en az güvenlik kaygısı vardır. B. cereus , enfeksiyon sırasında gıda zehirlenmesine neden olan ve tıbbi yardım almadan tedavi edilebilen, fırsatçı bir patojendir. Bununla birlikte, B. cereus B. anthracis ile birçok kritik geni paylaştığı için, B. anthracis proteinlerinin fonksiyonları B. cereus ^1'in ilgili homologları kullanılarak incelenebilir.

B. anthracis'in ba1554 - ba1558 gen kümesi, bc1531 - bc1535 kümesi ile oldukça korunmuştur B. cereus'un yanı sıra Bacillus thuringiensis'in bt1364-bt1368 kümesiyle , gen organizasyonu ve sekansı açısından. Dahası, ilgili kümelerin ilk genleri ( ba1554 , bc1531 ve bt1364 ) tamamen korunmuştur ( yani, % 100 nükleotid sekansı özdeşliği)Bacillus türündeki gen ürününün kritik bir rolü. Bu gen kümelerindeki konumu nedeniyle ba1554 , varsayılan bir transkripsiyon regülatörü ³ olarak yanlış tanımlandı. Bununla birlikte, ba1554 ürününün amino asit sekansı analizi, nükleotid pirofosfohidrolaz aktivitesine sahip olan ve transkripsiyon faktörü aktivitesi ^{4 , 5} ile ilişkili olmayan MazG ailesine ait olduğunu gösterir. MazG ailesine ait proteinler genel dizi ve uzunluk bakımından çeşitlilik göstermesine rağmen, bir EXXE _12-28 EXXD motifiyle ("X" herhangi bir amino asit artığı anlamına gelir) karakterize edilen yaygın bir ~ 100 kalıntı MazG alanını paylaşırlar ve sayı X kalıntılarının sayısını belirtir).

MazG alanı belli bir katalitik etkinliği her zaman doğrudan doğruya açıklamaz. Escherichia coli'den bir MazG üyesi (EcMazG), iki MazG alanına sahiptir, ancakC-terminal MazG alanı enzimatik olarak aktif ⁶ . Dahası, MazG enzimlerinin substrat özgüllüğü spesifik olmayan nükleozid trifosfatlardan (EcMazG için) belirli dCTP / dATP'ye (integrin ile ilişkili MazG için) ve dUTP'ye (dUTPazlar için) ^{6 , 7 , 8 , 9 arasında} değişir. Bu nedenle, BA1554 proteininin biyofizyokimyasal analizleri, NTPaz etkinliğini teyit etmek ve substrat özgüllüğünü deşifre etmek için gereklidir.

Burada, B. anthracis ba1554'ün bir ortologu olan B. cereus bc1531 geninin protein ürününü moleküler düzeyde karakterize etmek için bir BSL-3 tesisi olmayan çoğu laboratuvarın izleyebileceği adım adım bir protokol sunuyoruz. Kısaca, rekombinant BC1531 (rBC1531), E. coli'de eksprese edildi ve bir afınite etiketi kullanılarak arıtıldı. X-ışını kristalografik deneyleri için, kristalRBC1531 proteininin zation koşulları tarandı ve optimize edildi. RBC1531'in enzimatik aktivitesini değerlendirmek için, geleneksel olarak kullanılan radyoaktif olarak işaretlenmiş nükleotidlerden kaçınmak için NTPaz etkinliği kolorimetrik olarak izlenmiştir. Son olarak, elde edilen biyofizikokimyasal verilerin analizi, rBC1531'in oligomerleşme durumunu ve katalitik parametrelerini belirlememize ve rBC1531 kristalinden X-ışını kırınım verilerini elde etmemize olanak sağladı.

Protokol

1.RBC1531'in Rekombinant Protein Üretimi ve Saflaştırılması

1. Bir rekombinant BC1531 proteini (rBC1531) ekspresyon plazmidinin hazırlanması
   1. B. cereus'un genomik DNA'sını hazırlayın ¹⁰ .
   2. Sırasıyla Bam HI ve Sal I kısıtlama enzimi siteleri oluşturmak için ileri ve geri primerler (Bkz. Malzeme Listesi) kullanılarak polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile B. cereus genomik DNA şablonundan bc1531 genini yükseltin ¹⁰ .
   3. PCR ürününü ve değiştirilmiş bir pET49b vektörünü (pET49bm) Bam HI ve Sal I kullanarak tanımlayın ( ¹¹⁾ .
   4. Söndürülen PCR ürününü ve vektörünü (adım 3'te tarif edildiği gibi) bir 10 uL reaksiyonda T4 DNA ligaz kullanarak 1.1.3 adımından karıştırın. 18 ° C'de 30 dakika inkübe edin.
   5. 50 μL kimya içine ligasyon reaksiyonu 3 mcL pipetleyinYetkili E. coli DH5α hücrelerini bir tüp içinde tutun. Pipetleme yaparak yavaşça karıştırın ve 30 dakika boyunca buz üzerinde bırakın. 42 ° C'de 45 sn ısı şoku. 1 mL Luria-Bertani (LB) ortamı ekleyin ve kuvvetli çalkantılar yaparken hücreleri büyütünüz (250 rpm, 37 ° C, 45 dak.).
   6. Adım 1.1.6'dan 100 μL dönüştürülmüş hücreleri alın ve bunları 100 μg / mL kanamisin (Kan) ile LB-agar plakalarına yayın. ~ 18 saat boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
   7. Steril bir uç kullanarak koloniler seçin ve 100 μg / mL Kan ile 3 mL LB ortamında hücreleri büyütün; Çalkalayın (250 rpm, 37 ° C, 18 saat).
   8. Plazmid DNA'yı, açıklandığı gibi bir alkalin-SDS liziz yöntemi kullanarak hazırlayın.
   9. DNA dizilemesi kullanılarak rBC1531-ekspresyon yapısının nükleotid dizisini doğrulayın ¹² .
2. RBC1531 proteinin aşırı ekspresyonu
   1. E. coli BL21 (DE3) suşunu rBC1531-exp ile yeniden transforme edinAşırı ekspresyon için aşamalar 1.1.5-1.1.6'da tarif edildiği gibi hazırlama plazmiti.
   2. Bir koloni seçin ve 50 μg / mL Kan (LB + Kan) içeren 10 mL LB ortamında büyütün; 37 ° C'de 18 saat şiddetle çalkalayın.
   3. 1 L LB + Kan ortamında gece boyunca 10 mL kültür inoküle edin ve OD ₆₀₀ (600 nm'de optik yoğunluk) ~ 0.7'ye ulaşıncaya kadar 37 ° C'de büyütün.
   4. Sıcaklığı 18 ° C'ye soğutmak için ~ 15 dakika boyunca buz soğuk suda kültür batırın ve rekombinant protein ekspresyonu için 1 mM nihai konsantrasyonda kültür izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin. Kültürü 18 ° C'de ek bir 16-18 saat daha büyütün.
3. RBC1531'in saflaştırılması
   1. Hücreleri santrifüjle (5,000 xg, 4 ° C, 30 dakika) hasat edin. Hücreleri rahatsız etmeyecek şekilde süpernatanı dikkatle atın. Hücreleri, 10 mM imidazol içeren 50 mL fosfat tamponlu salin (PBS) solüsyonunda yeniden süspanse edin.
   2. Hücre lizatlarının fazla ısınmasını önlemek için (saat: 2 dak. 30 s; devir sayısı: 5 s; devreden çıkma: 10 s; genlik:% 38), buz üzerinde sonikasyon ile hücreleri iki kez lize edin.
   3. Santrifüjleme (~ 25.000 xg, 4 ° C, 30 dakika) ile hücre lisatını boşaltın.
   4. Dengelenmiş nikel boncuklarını 2,5 x 10 cm'lik bir cam kromatografi kolonuna yerleştirmek için, 3 mL nikel boncukları ve 10 mM imidazol ve yerçekimi akışı içeren 60 mL PBS'yi ekstra tamponla karıştırın.
   5. Süpernatantı adım 1.3.3'ten önceden dengelenmiş nikel boncukları olan kolona aktarmak için pipet ve düşük devirde (~ 20 rpm) bir eğirme tekerleğinde 2 saat boyunca 4 ° C'de inkübe edin.
   6. Süpernatanın yerçekimi ile boşaltılmasına izin verin ve kolondaki nikel boncuklarını 10 mM imidazol ihtiva eden 100 mL PBS ile üç kez yıkayın.
   7. 250 mM imidazol içeren 4 x 5 mL PBS uygulayarak rBC1531 proteini elute edin.
   8. Adım 1.3.7'den 15 uL elüsyon alın ve% 15 SDS-PAGE'de çalıştırın. Üzerinde protein bantları görselleştirmekCoomassie mavisi boyama ¹⁰ kullanarak jel.
4. RBC1531 proteinin afinite etiketlerinin trombin proteoliziyle giderilmesi
   1. Fraksiyonları diyaliz tüpüne pipetleyin (molekül ağırlığı kesildi: 3 kDa) ve tüp, 4 L trombin bölünme-uyumlu tampon (20 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl ve 1.5 mM β-merkaptoetanol) içeren bir beher içine yerleştirin. Gece boyunca 4 ° C'de.
   2. Kesirleri pipetleyin ve konik bir boruya aktarın.
   3. 280 nm'de absorbansı ölçün ve tarif edildiği gibi rBC1531 protein konsantrasyonunu hesaplayın ¹³ .
   4. 0.5 mL'lik bir tüpte 50 μg rBC1531 alın ve çeşitli miktarlarda trombin ekleyin ( yani 2, 1, 0.6 ve 0.3 birim). N-terminal afinite etiketini parçalamak için gereken en düşük trombin miktarını belirlemek için rBC1531 ve trombin reaksiyonlarını 20 ° C'de ~ 3 saat inkübe edin.
   5. RBC1531 ve trombin reaksiyonlarını% 15SDS-PAGE ile yıkayın ve N-terminal afinite etiketini tamamen sindiren ve etiketsiz bir rBC1531 üreten en düşük trombin miktarını ( örn., 50 μg rBC1531 başına 0.3 ünite trombin) belirleyin.
   6. 15 mL'lik bir tüpe 10 mg rBC1531 proteini ve 60 ünite trombin ekleyin ve trombin-proteoliz reaksiyonu için ~ 3 saat boyunca 20 ° C'de inkübe edin.
   7. Açıklanan moleküler ağırlıkların ve elüsyon hacimlerinin standart bir eğrisini hazırlamak için jel filtreleme standartlarını boyut dışlama kromatografısi (SEC) sütununa uygulayın ¹³ .
   8. Adım 1.4.6'dan trombin ile sindirilmiş rBC1531 proteinini bir santrifüj filtresi tüpüne (molekül ağırlığı kesilmiş: 3 kDa) yerleştirin ve 5 mL'den daha düşük bir hacme indirgemek için 3 ° C'de 4 ° C'de santrifüjleyin.
   9. Konsantre rBC1531 proteinini SEC sütununa uygulayın ve tüp başına 0.5 mL içinde elüsyona uğramış 60 fraksiyon toplamayın ¹³ .
   10. Her fraksiyonun 15 μL'ini alın, onları% 15'lik bir SDS-PAGE üzerinde çalıştırın ve stai10'da tarif edildiği gibi, Coomassie boyama çözeltisi (% 0.15 (v / v) Coomassie parlak mavi,% 40 (v / v) metanol ve% 10 (v / v) glasiyal asetik asit) kullanılarak jel.
   11. RBC1531 içeren fraksiyonları pipetleyin ve bir tüpe toplayın.

2. rBC1531'in Kristalizasyon Tarama ve Optimizasyonu

1. RBC1531 protein kristalleşmesi için tarama koşulları
   1. Adım 1.4.8'de tarif edildiği gibi, rBC1531'i, adım 1.4.11'den ~ 18.5 mg / mL'ye kadar bir santrifüj filtresi tüpü kullanarak konsantre hale getirin.
   2. Her kristalleştirme tarama solüsyonundan 50 μL (bkz. Bölüm 2.2) ¹⁴ , 96-gözlü oturma-damla kristalizasyon plakalarının oyuklarına ilave edin. Oturan bir yatağa 0.5 uL 18.5 mg / mL rBC1531 protein solüsyonu yerleştirin. Protein solüsyonunu 0.5 mL'lik iyi çözeltiyle karıştırın, plakanın tamamı için işlemi tekrarlayın.
   3. Plakayı açık yapışkan filmle örtün.96 oyuklu plakaları 18 ° C'ye yerleştirin ve buhar difüzyonuna izin verin.
   4. 2-3 hafta boyunca günlük olarak kristal oluşumunu izlemek için hafif bir mikroskop kullanarak damlaları 20-40X büyütmede tarayın.
   5. Elde edilen rBC1531 protein kristallerini kullanarak X-ışını kırınım verilerini ¹² toplayın.
2. RBC1531 kristalleşme koşullarının optimizasyonu
   1. Seçilen başlangıç ​​kristalleştirme koşul solüsyonundan ( örn., 0.1 M sodyum cacodylate, pH 6.5 ve 1.0 M sodyum sitrat) 500 mcL hazırlayın ve oturma damlası için 24 gözlü bir kristalleştirme plakasını doldurun.
   2. Bir oturma yatağına 0.5 μL 18.5 mg / mL rBC1531 protein solüsyonu ilave edin, 0.5 mL'lik iyi çözeltiyle karıştırın ve plakayı açık yapışkan filmle hemen örtün. Plakayı 18 ° C'ye yerleştirin.
   3. Haftalık bir mikroskop altında kristal büyümesine bir hafta boyunca dikkat edin.
   4. PH değerini değiştirerek çeşitli kristalleşme koşullarını optimize edin ( örn., PH 5.5-6.8) ve sodyum sitratın tuz konsantrasyonunu ( yani, 0.9-1.2 M) değiştirerek tekil kristaller elde edildi. ~ 1 hafta boyunca kristal büyümesini izleyin ve X-ışını kırınım verileri toplamak ¹² .

3. rBC1531'in Nükleozid Trifosfataz (NTPaz) Aktivitesinin Karakterizasyonu

1. İnorganik fosfat bağımlı kolorimetrik çalışmanın doğrulanması
   1. Bir pirofosfat (100 mM) stokunu hazırlayın ve reaksiyon tamponunun 200 mcL'sinde (20 mM HEPES, pH 7.4; 150 mM) 0,1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100 ve 250 mcM nihai konsantrasyonlarına kadar sulandırın. MM NaCI ve 2 mM MgCl2) ile yıkandı. İlk plakayı bir kontrol olarak kullanın (bu pirofosfataz içermez). İkinci plakanın, adım 3.1.2'de belirtildiği gibi, bir çalışma plakası olarak pirofosfataz içerdiğinden emin olun.
   2. 0.01 birim Saccharomyces cerevisiae inorganik pYrophosphatase (1 μL) çalışma plakasının çukurlarına bırakın ve 20 ° C'de 30-60 dakika inkübe edin.
   3. Molibden asit çözeltisini, 7: 3 oranında amonyum molibdat (% 0.86 v / v) ve askorbik asit (% 14 v / v) çözeltileri ile karıştırarak hazırlayın. Çalışma ve kontrol kuyularına molibdat asit çözeltisi 16 uL ekleyin ve 15 dakika bekleyin.
   4. Optik _yoğunluğu 690 nm'de (OD 690 nm) _okuyun .
2. Kolorimetrik NTPaz tahlili
   1. 100 mM nükleozid trifosfat (NTP) substrat stoğu hazırlayın ve 180 uL tahlil tamponu (20 mM HEPES, 100 mM NEP) içinde beklenen konsantrasyona ( örn., 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88 veya 132 uM) PH 7.4; 150 mM NaCI ve 2 mM MgCl2).
   2. Adım 3.2.1'den 20 μg rBC1531 (1.5 mM) ve NTP substratları, 96 oyuklu bir plakada 200 μL'ye kadar reaksiyona ekleyin ve iyice karıştırmak için pipetleyin. Plakayı kapağı ile kapatın ve 30 dakika boyunca 37 ° C inkübatöre yerleştirin.Substrat hidrolizi reaksiyonu gerçekleştirmek için.
   3. Plakayı 70 ° C su banyosuna aktarın ve rBC1531 aracılı katalitik reaksiyonları durdurmak için 15 dakika bekletin.
   4. Reaksiyon plakasının her bir gözüne (adım 3.2.3'ten) 0,01 ünite S. cerevisiae inorganik pirofosfataz (1 uL) ilave edin ve 20 ° C'de 30 dakika inkübe edin. Rengi (~ 15 dakika) geliştirmek için reaksiyon plakasına molibdat asit çözeltisi 16 uL ekleyin. OD _690nm'de okuyun.
   5. Michaelis-Menten denklemini kullanarak tarif edildiği gibi analiz edin ¹² .

Sonuçlar

Bu çalışmada ilgilenilen proteinin karakterizasyonu, tercihen birkaç miligramdan daha fazla rekombinant B. cereus bc1531 (rBC1531) proteininin yeterli bir miktarının hazırlanmasıyla başlamıştır. BC1531 proteinini kodlayan DNA parçası, ba1554'e özdeş ortolog genler içerdiği için B. cereus'un genomik DNA'sını şablon olarak kullanarak PCR ile hazırlandı . RBC1531, E. coli hücrelerinde çözünür bir protein olarak aşırı eksprese edildi. RBC1531 proteini, 6x-...

Tartışma

Gerçek patojenlerle ilgili çalışmalar, güvenlik kısıtlamaları ve düzenlemeleri nedeniyle sınırlıdır. Alternatif olarak, patojenler, evrimsel olarak ilişkili patojen olmayanlar veya daha az patojenik türler kullanılarak incelenebilir. ba1554 geni, B. anthracis'te kritik bir gen olarak kabul edilir. Neyse ki, klinik olmayan B. cereus'ta aynı gen mevcuttur.Bu nedenle, ciddi güvenlik endişeleri olmaksızın, rekombinant BC1531 proteini biyofiziksel ve enzimatik karakterizasyon için kullanılabilir. B...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Bacillus cereus ATCC14579	Doku Kültürü için Kore Koleksiyonu	3624
Genomik DNA hazırlık kiti	GeneAll	106-101	Genomik DNA hazırlama
İleri astar	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	em>BamHI sitesinin altı çizili
Ters astar	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI sitesinin altı çizili
nPfu-Forte	Enzimomik	P410	PCR polimeraz
BamHI	Enzimatik	R003S
SalI	Enzimonomik	R009S
pET49b ekspresyon vektörü	Novagen	71463	İfade vektörü, benzeşim etiketleri ve BamHI/SalI siteleri eklemek için değiştirildi10
T4 DNA ligaz	Enzimatik	M001S
Diyaliz memebran	Thermofisher	18265017
Kuru blok ısıtıcı	JSR	JSBL-02T
LB et suyu (Luria-Bertani)	LPS çözeltisi	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson ve Şirketi
Kanamisin	LPS çözeltisi	KAN025
Mini hazırlık kiti	Favorgen	FAPDE300	Plazmid DNA hazırlığı
BL21 (DE3) Yetkili hücre	Novagen	69450-3CN
İzopropil ve beta;-D-1-tiyokalaktopiranosit (IPTG)	Fisher BioReaktifler	50-213-378
Sodyum klorür	Daejung	7548-4100	PBS malzemesi
Potasyum klorür	Daejung	6566-4405	PBS malzemesi
Potasyum fosfat	Bio Basic Inc	PB0445	PBS malzemesi
Sodyum fosfat	Bio Basic Inc	S0404	PBS malzemesi
Imidazol	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Nikel boncuk
Döndürücü	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Çift Renk Standartları	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE protein standardı
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie boyama çözeltisi
Metil alkol	Samchun kimyasal	M0585	Coomassie boyama çözeltisi
Asetik asit	Daejung	1002-4105	Coomassie boyama çözeltisi
Diyaliz memebrane	Thermofisher	68035
2-Merkaptoetanol	Sigma-aldrich	M6250
Trombin	Merckmillipore	605157-1KUCN	20 &mu'luk alikotlar hazırlayın; L (&mu başına 1 Birim; L) ve 70 ° C'de saklayın; Kullanmadan önce C ve çözdürün
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Boyut dışlama kromatografisi
Jel filtrasyon standardı	Bio-rad	151-1901
Santrifüj filtre	Amicon	UFC800396
Kristralizasyon plakaları	Hampton araştırması	HR3-083	96 kuyucuklu oturma damla plakası
JCSG çekirdek takımı I-IV	Qiagen	130924-130927	Kristalleşme secreening çözeltisi
Mikroskop	Nikon	SMZ745T
Cryschem plakaları	Hampton araştırması	HR3-158	24 kuyulu oturma damla plakası
İnorganik pirofosfataz	Sigma	10108987001
Amonyum molibdat çözeltisi	Sigma	13106-76-8
L-askorbik asit	Sigma	50-81-7
NTP substrat	Startagene	200415-51
Spektrofotometre	Biotek	SynergyH1	mikroplaka okuyucu
GraphPad Prism 5		Pencere için GraphPad