Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA'lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM'ler) Elektrofizyolojik Analizi

Özet

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Özet

Artık kardiyomiyositler hem insan embriyonik hem de insan kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden (hPSC) yüksek verimle türetilebilir. HPSC kaynaklı kardiyomiyositlerin (hPSC-CM'ler), insanlardaki kardiyovasküler hastalıkları, özellikle de aritmi sendromlarını modellemek için büyük bir değere sahip oldukları giderek daha fazla tanınmaktadır. Uyuşturucu yanıtlarını tahmin etmek için in vitro sistemler olarak ilâç taramaları ve keşif, güvenlik farmakolojisi ve belki de sonunda kişiselleştirilmiş tıp için potansiyel olarak yararlı olmasını sağlayan ilacın göstergeleridir. Bu hPSC-CM'leri hastalar veya duyarlı kişilerden hiPSC olarak türetmek suretiyle kolaylaştırılacaktır. Bununla birlikte, tüm uygulamalar için, hPSC-CM elektriksel özelliklerinin kesin ölçümü ve analizi, iyon kanallarını hedef alan ve ani kalp ölümüne neden olabilen kardiyak iyon kanal mutasyonları ve / veya ilaçlardan kaynaklanan değişiklikleri tanımlamak için gereklidir. Manuel patch-clamp ile karşılaştırıldığında, çok elektrotlu dizi (MEA) cihazları,Orta ve yüksek kayıt kapasiteli kayıtlara izin verir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin 2D hücre kültürlerinin küçük agregalara ve tek hücrelere ayrılma ve alan potansiyeli olarak kendiliğinden olan elektriksel aktivitelerini kaydetmek için ÇKA'larda plakalamakta olduklarını açıklamaktadır. QT ve RR aralıkları gibi spesifik parametreleri çıkartmak için kaydedilen verilerin analiz yöntemleri de burada açıklanmaktadır. Bu parametrelerdeki değişiklikler, kardiyak aritmilerden sorumlu mutasyonları taşıyan hPSC-CM'lerde ve belirli ilaçların eklenmesinden sonra kardiyotoksik bir riskin bulunduğu kişilerin saptanmasına izin verirken beklenebilir.

Giriş

İnsan Pluripotent Kök Hücreler (hPSCs) kendini yenileme ve farklılaşma ^{1 , 2} yoluyla insan vücudunun neredeyse herhangi bir hücre türünü oluşturma kapasitesine sahiptir. HPSC'lerin birkaç kardiyak soyuna (ventriküler, atriyal, pacemaker benzeri kardiyomiyosit) doğrudan farklılaşması üzerine ayrıntılı protokoller ^{3 , 4 , 5 , 6 , 7} olarak tanımlanmıştır. Kardiyomiyositler elektriksel olarak aktif hücrelerdir ve elektrofizyolojik aktivitelerinin ayrıntılı bilgisi, kalp gelişimi ve hastalığını anlamada son derece bilgilendirici olabilir8. Hastaya özgü hiPSC türevli kardiyomiyositleri (hiPSC-CM'ler), Long QT Sendromu da dahil olmak üzere çeşitli kardiyak aritmilerin hücresel, moleküler ve elektriksel özelliklerini modellemek ve araştırmak için başarıyla kullanılmıştır(LQTS) ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} , Brugada sendromu ¹⁴ ve katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi ^{15 , 16} . Dahası, terapötik müdahaleyi tekrarlamak ve hücresel patolojik fenotip ^{10 , 15 , 20 , 21 ,} 22'yi kurtarmak için hastalıklı hiPSC-CM'lere çoklu ilaçlar eklenmiştir. Daha yakın zamanlarda, kemirgen kardiyomiyositlerin hu'dan oldukça farklı olduğu için ilaç keşfinin erken safhalarına insan sistemlerine duyulan ihtiyaca cevap olarak, WT hiPSC-CM'lere dayanan tarama platformları geliştirilmiştir ( ^{23 , 24 , 25)}İyon kanalı ekspresyonunda ve biyofizikteki mansörler ²⁶ .

Bu amaçla, orta-yüksek verimli uygulama için uygun teknolojiler geliştirilmekte ve uygulanmaktadır. Bunlar zar potansiyelinin, Ca ²⁺ geçici ve gerginlik, empedans ölçümleri (hücre kontraktilitesinin dolaylı bir ölçümü) ve hücre dışı alan potansiyelinin (FP) ölçümleri için optik kayıtları içerir (gözden geçirme için bkz. Referans ²⁴ ). Çok elektrotlu Diziler (MEA) cihazları, tek katmanlı veya kardiyomiyositlerin küçük kümeleri tarafından üretilen ve şekillendirilen elektriksel dalga sinyallerini (veya FP'ler) kaydetmeyi sağlar. FP konturu, kardiyak aksiyon potansiyeli ve bir dereceye kadar elektrokardiyogram (EKG) kayıtları ²⁷ ile korelasyon gösterir; Na ⁺ akışı ve membran depolarizasyonu (R / Q tepe), muhtemelen Ca'ya tekabül eden yavaş bir dalga / plato fazına karşılık gelen bir başlangıç ​​hızlı yükseliş gösterirler2 + akış ve baskın bir K ⁺ efflux (T tepe) karşılık gelen bir repolarizasyon fazı. FP dalga biçiminin dalgalanması, spesifik aksiyon potansiyel evrelerindeki değişikliklerle ilişkilendirilebilir ²⁸ .

Hareket potansiyellerinin patch clamp kayıtları, özellikle yukarı strok hızı ve dinlenme membran potansiyeli gibi parametreler için daha bilgilendirici olabilmesine rağmen, otomatik patch kelepçesi sadece kısa bir süre önce hPSC'ye uygulanmışken orta ve yüksek geçiş skalasındaki deneyler için manuel ölçümler uygulanabilir değildir - ²⁹ . Bununla birlikte, ÇÇ'larda uzatılmış kayıtlar hem akut hem de kronik olarak incelenecek bileşiklere maruz bırakıldığından, ilaç taraması, keşfi ^{24 , 30 için} ve güvenlik farmakolojisi için ^{31 , 32} için hPSC-CM platformlarını kullanmak artık mümkün. Bu, gelecek hassasiyet veya perso sözünü tutar.Tıp ³³ .

Bu protokolün amacı, hPSC-CM'lerin MEA cipslerinde ayrılması ve kaplanması ve FP'lerinin ölçülmesi için gerekli bilgileri sağlamaktır. Bu prosedürde, her adım, optimal hücre sağkalımı ve ayrışmadan sonra toparlanma, MEA plakasına optimal hücre eklenmesi ve standartlaştırılmış analiz ve parametrelerin nicelleştirilmesi sağlanarak optimize edilmiştir. Özellikle, hücre dışı FP kaydı prosedürü, QT ve RR aralıklarının analizi ve ilaç etkilerinin değerlendirilmesi açıklanır ve örneklendirilir.

Protokol

1. Çözeltilerin ve Reaktiflerin Hazırlanması

1. Tablo 1'de açıklanan reaktifleri birleştirerek düşük insülin, sığır serum albümini, polivinilalkol, gerekli lipidleri (LI-BPEL) ortam ^{34 , 35 , 36} kullanarak hPSC-CM kültür ortamı hazırlayın. Ortamı 0.22 um gözenekli bir filtreden geçirin ve 2 haftaya kadar 4 ° C'de saklayın.
2. İnsan rekombinant fibronektin stok solüsyonunu, 200 μg / mL konsantrasyonuna, alikuotu elde etmek için 5 mL steril damıtılmış suda 1 mg insan rekombinant fibronektini hazırlayarak hazırlayın ve -80 ° C'de saklayın.
3. 100 mL sıcak (~ 40-45 ° C) 1 g enzim deterjan tozu çözülüp mikroarray çipinden kalıntı hücrelerin uzaklaştırılmasına yardımcı olmak için% 1 (w / v) enzim deterjan çözeltisi hazırlayın (bkz . Malzeme Tablosu ) Deiyonize su. Çözeltinin soğumasını bekleyin ve 4 ° C'de depolayın fVeya bir yıla kadar.

2. MEA Cipslerinin sterilizasyonu (Şekil 1A)

NOT: MEA'ların birkaç farklı konfigürasyonu mevcuttur; bunlar tek veya çok kuyu formatları ile birlikte verilmektedir. Burada açıklanan protokol, 8 x 8 ızgaralı düzenlemede 60 kayıt elektrodu içeren tek odacıklı MEA'yı kullanır (bkz . Malzeme Tablosu ). Elektrot çapı 30 μm'dir ve elektrotlar arasındaki mesafe 200 μm'dir. Bir referans elektrot da mevcuttur.

1. Çipi deiyonize suyla iyice durulayın.
2. MEA cipsini, otoklavlanabilir cam bir Petri kabına koyun. Çanağı alüminyum folyoya sarın.
3. Fişleri bir laboratuar basınçlı ocakta 6 dakika boyunca sterilize edin. Açmadan önce bulaşıkları soğumaya bırakın.
   NOT: Alternatif olarak, cipsler, oda sıcaklığında 15-30 dakika boyunca 1 mL% 80 (h / h) etanol içine batırmak suretiyle sterilize edilebilir.
4. Fişleri hücre kültürü kaputuna yerleştirin veYüzeyden yaklaşık 30 dakika boyunca UV ışınlarına maruz bırakın.

3. MEA Cipsinin Kaplanması (Şekil 1B ve 1C)

1. Temiz cipsleri standart 10 cm Ø plastik steril Petri kabı içine yerleştirin.
2. Petri kabına 8 mL steril damıtılmış su ekleyin, nemlendirilmiş bir oda oluşturmak için, inkübatöre yerleştirildiğinde çip üzerinde küçük kültür ortamı hacmini önleyecektir.
3. Elektrot dizisinin bulunduğu çipin merkezinde kardiyomiyositlerin kaplanmasını sağlamak için ısmarlama polietilen fluoroetilen (PTFE) halkaları kullanın ( Şekil 1B ). (PTFE halkaları daha önce% 80 etanol içinde depolanmıştır.) Kültür kaputunda, halkaları etanolden çıkarın, bir kap olmadan steril bir Petri kabı içine yerleştirin ve kaputların içinde halkaların kurumasına izin verin.
4. Ateşle sterilize edilmiş cımbız kullanarak bir MEA çipinin içine kuru bir halka yerleştirin ( Şekil 1C ).
   NOT: Cımbızı yıkamak için alternatif olarak% 80 etanol kullanın ve iBunları kullanmadan önce doku kültürü kaputuna.
5. İnsan rekombinant fibronektin stokunun bir kısmını (damıtılmış suda 200 μg / mL) çözündürün ve 40 μg / mL'lik bir çalışma solüsyonu elde etmek için Ca ²⁺ ve Mg ²⁺ ile PBS'de seyreltin. Ring içine 40 μg / mL fibronektin 50 mcL eklemek elektrotlar kaplayın.
   NOT: İnsan rekombinant fibronektini kullanarak kaplama optimal hPSC-CM eklenmesini sağlar. Bununla birlikte, sığır fibronektini veya hücre dışı matris proteinleri karışımları gibi diğer kaplama protein türleri de kullanılabilir.
6. 10 cm Ø plastik Petri kabının kapağını kapatın ve MEA yongasını içeren çanağı inkübatöre dikkatle aktarın. 37 ° C'de en az 1 saat veya 4 ° CO / N'de inkübe edin.
7. MEA çipini içeren çanağı hücre kültür kapağına aktarın. MEA çipini kullanmadan önce PTFE halkasını yerinden oynamadan kaputun içine bir P200 pipet veya bir vakum sistemi kullanarak 50 μL fibronektini aspire edin. Pla kullanBu adım için stic ipuçları. Elektronlara zarar verebileceğinden katı nesnelerin ( örn. Pipet uçları) tabağın içine dokunduğundan emin olun.
   NOT: Bu MEA cipsinin ömrünü uzatacaktır.
8. Nazikçe 950 μL LI-BPEL ortamı ekleyin ( Tablo 1'e ve Malzeme Tablosuna bakın ), eşit dağılıp halkanın yüzdürülmediğinden emin olun. Çanağı inkübatöre geri döndürün.

4. hPSC-CM'nin Ayrılması ve Kaplaması (Şekil 2)

NOT: Burada açıklanan protokol, farklılaşmaya başlamadan ~ 18 gün sonra sitokinler ³⁴ kullanarak tek tabaka kültüründe farklılaşan hPSC-CM'leri kullanır. Bununla birlikte, herhangi bir 2D ve 3D hPSC-CM kültürü için uygun olduğu kanıtlanmıştır. Farklılaşmış kültürleri daha erken veya daha ileri zaman noktalarında kullanırken, ayrışma enziminin inkübasyon süresini ayarlamak (bkz . Malzeme Tablosu ) ne olabiliryapanlara. Aşağıdaki ciltler, 12 oyuklu plaka formatında (3,8 cm2) tekli kuyu için tasarlanmıştır.

1. Ortamı hPSC-CM kültüründen de aspire edin.
2. Bir doku kültürü kaputu altında çalışırken, kültürü yıkamak için Ca ^{2 +} / Mg ^{2 +} olmadan PBS 1-2 mL / kuyucuk ekleyin. PBS'yi aspire.
3. Ayrışma enziminden 500 μL / oyuk ekleyin. 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
4. Enzimi sulandırmak için 1 mL LI-BPEL / kuyu ekleyin. Bir P1000 pipet kullanarak hafifçe çizerek hPSC-CM'lerin tek katmanını hafifçe ayırın. 15 mL tüp içinde hücre süspansiyonu toplayın.
5. Kalan tüm hücreleri ve hücre yığınlarını toplamak için 1 mL LI-BPEL ile çalkalayın.
6. 5-6 mL'lik nihai bir hacme ulaşmak için 2-3 mL'lik bir LI-BPEL ekleyin ve hücre yığınlarını ayırmak için 5 mL'lik pipetle 3-5x'lik dereceli pipetle aşağıya ve aşağıya pipetleyin.
   NOT: Bu noktada tekli hücrelere ayrılma gerekli değildir, çünkü hücre sağkalımını etkileyecektir. Küçük kümelerin varlığıDaha yüksek hücre yaşayabilirliğini sağlayın.
7. Hücreleri oda sıcaklığında 300 x g'de 3 dakika santrifüjleyin.
8. Fazla sıvının çoğunu almaya çalışırken hücrenin peletini çıkarmadan süpernatanı çıkarın.
9. Hücre pelletini 250 mcL LI-BPEL'de (bir P1000 kullanarak ve son derece yavaş pipetleme) tekrar süspanse edin.
10. Elektrot dizisinin üstünde, PTFE halkasının merkezine doğrudan hücre süspansiyonu pipetle konarak, MEA başına ~ 50 μL hücre süspansiyonu dağıtın (en fazla 5 MEA, bir 12 oyuklu plakanın bir kuyusundan hazırlanabilir) dağıtın.
    NOT: Bu aşamada, hücre kümelerinin varlığı nedeniyle hücrelerin sayımı zordur ve kullanılan MMS başına toplam hücre sayısı, kullanılan hPSC-CM kaynağına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir. Kaplama yapılırken ayrışmış hücrelerin bulutunun elektrot alanını kapladığından emin olun.
11. ÇÇ'ları 37 ° C'de inkübatöre dikkatli bir şekilde aktarın ve hücrelerin O / N

5. Zil Kaldırma ve Orta ReTazeleme (Şekil 3)

1. Kaplamadan 1 gün sonra steril cımbız kullanarak halkayı dikkatlice çıkarın ( Şekil 3A-3B ).
2. Yüzeyi% 80 (v / v) etanol içinde durulayın ve taze% 80 (v / v) etanol içeren 50 mL tüp içinde saklayın.
3. MEA çipinden hafifçe 500 μL ortamı çıkarın ve 500 μL taze LI-BPEL ekleyin.
4. ÇÇ'ları inkübatöre 37 ° C'de aktarın.
   NOT: Hücrelerin çıkarılması ve orta derecede değişimden sonra 1-7 gün içerisinde hücrelerin atılması başlamalıdır ( Şekil 3C ).
5. Halka kaldırılmasından 1-7 gün sonra MEA'lardaki hPSC-CM'lerin elektriksel aktivitesini ölçün.

6. Sinyal Kalitesini Kontrol Edin (Şekil 4)

1. Bilgisayarı açın ve MEA kurulumuyla bağlantılı yazılım paketini başlatın: TCX-Control, MC_MEA Select ve MC_Rack. Fizyolojik sıcaklıkta ölçümleri kaydetmek için sıcaklığı TCX-Control'de 37 ° C'ye ayarlayın.
2. MEA yongasını içeren çanağı f çıkarın fKuluçka makinesinde. Kapağı açın, MEA çipini çıkarın ve artık suyu absorbe etmek için bir mendil üzerine koyun.
3. Plakanın harici temas noktalarını bir doku ile silin ve sinyal gürültüsüne neden olabilecek kalan su veya artıkları temizlemek için% 100 (v / v) etanolle nemlendirilmiş pamuklu çubuk kullanarak temizleyin.
4. Spontan aktiviteyi tespit etmek için MEA plakasını ısıtılmış (37 ° C) kayıt başlığına aktarın ( örneğin, donanım: Malzeme Tablosu : yazılım: MC_Rack).
   1. MC_Rack'i açın: Yeni bir protokol oluşturmak için 'Düzenle' → 'MC_Card ekle'yi tıklayın. Protokole farklı Kaydedici ve Görüntü pencereleri eklemek için açılır menüden 'Düzenle'yi kullanın.
      NOT: En az 10 kHz'lik bir örnekleme frekansı önerilir. Kullandığımız protokol, tüm MEA yongasının tam bir düzenine sahip bir Uzun Vadeli Görüntüleme Aracı ve ilaç etkisi i'yi yakalamak için gerekli olan bir Spike Sıralayıcısı içerirGerçek zamanlı değil. Spike Cutout, 20 ms'lik "Ön Tetikleyici", 800 ms'lik "Post Tetikleyici" ve 2 ms'lik "Ölü Zaman" ile ayarlanır. Protokol, '.rck' dosyası olarak kaydedilebilir ve denemelere başlamadan önce yeniden yüklenebilir.
5. Protokolü oynatma modunda 'oynat' düğmesine tıklayarak başlatın.
   NOT: Bu noktada, adım 6.5'te kaydedilen protokolü yeniden yüklemek mümkündür. MC_Rack'te 'Dosya' → 'Aç' düğmesini tıklayarak protokolü (.rck dosya uzantısı) yükleyin.
6. Sinyaller açıkça görülebilen R tepeleri ve T tepeleri sergiliyorsa, uyum aşamasını tamamlamak için 10-15 dakika bekleyin. İyi ve kötü kalite izlerinin örnekleri Şekil 4'te gösterilmektedir.
   NOT: Elektrotlardan herhangi birinde T-pik tespit edilemiyorsa deneyle devam etmeyin. Genellikle bu, hPSC-CM'lerin zayıf elektriksel aktivitesinin veya hücrelere elektrotlara kötü bağlanmanın sonucudur.

7. Ex'yi başlatPeriment ve Kayıt

1. 'Kaydet' ve ardından 'oynat'ı tıklayın ve sabit durumu belirlemek için temel koşullar altında 10 dakika boyunca veri edinin. En iyi sinyali olan elektrotlara dikkat edin, böylece daha kolay tespit edilebilir ve analiz için daha sonra ihraç edilebilir.
2. İlaç yanıtı değerlendirmesi için her 10 dakikada bir artan konsantrasyonda ilaç ekleyin. Örnek olarak, 1 μM'lik bir son konsantrasyonda hERG bloke edici E4031 ekleyin. Bunun için, 100 uL ortamı çıkarın ve ortamda çözülmüş 10 uM E4031'in aynı hacmini ekleyin.
   NOT: Daha önce Cavero ve meslektaşları tarafından gösterildiği üzere, ilaçların yanıt verme eğrisini derinden değiştirebildiğinden, ilaçların eritildiği hacmin bilge bir seçimi önemlidir.
3. İlgilenen tüm diğer ilaç konsantrasyonları için adım 7.2'yi tekrarlayın.
4. Protokolün sonunda kayıtları tamamlamak için 'durdur' düğmesini tıklayın.

8.MEA Yeniden Kullanım İçin Temizleme

1. Deneme kaydı tamamlandıktan sonra, ortamı bir P1000 pipetle hafifçe çıkarın. Elektrodlara zarar verebileceğinden kabın içine dokunmayın. Yerel güvenlik kurallarına göre atın.
2. MEA cipsini deiyonize suyla bir bardak yıkama şişesiyle durulayın ve yıkama adımını 3-4x tekrarlayın.
   NOT: Bu noktada, hücrelerin çipten tamamen ayrılması gerekli değildir.
3. Her bir göz içine 1 mL enzim deterjan çözeltisi% 1 (v / v) ilave edin ve hücre ayrılmasına ve hücre çıkarılmasına izin vermek için 4 ° C'de O / N inkübe edin.
4. Bir gün sonra, enzim deterjanı çözeltisini ve artık hücreleri çıkarmak için MEA cipsini deiyonize su ile iyice durulayın ve 1 mL deiyonize su ekleyin. Temiz MEA cipsi, deiyonize suyun içine batırılmış olarak 4 ° C'de saklanabilir.

9. Veri Dışa Aktarımı

1. MEA kurulumuna bağlı MC_Data Tool yazılımını açın.
2. 'Dosya' → 'Açık MC'yi tıklayınD',.
3. 'Araçlar' → 'MCD'yi ABF'ye Dönüştür'ü tıklayın .
4. Analiz için ihraç edilecek en iyi kayıt sinyalleri ile elektrotları seçin. Dışa aktarılan dosyaları kaydedeceğiniz dizini seçin ve 'Kaydet'i tıklayın. Dışa aktarma işlemi, verilen elektrotların sayısına ve kayıt dosyalarının toplam boyutuna bağlı olarak birkaç dakika sürebilir.

10. Veri Analizi

1. Bir elektrofizyoloji veri toplama ve analiz programını indirin ( örn. PClamp). İşlem tamamlandıktan sonra, analiz yazılımını çalıştırın ( örn. Kelepçe).
2. RR Aralık hesaplaması (Şekil 5).
   1. İz üzerinde ilgili bölgeyi tanımlamak için iki dikey imleç yerleştirin. 'Etkinlik saptama' → 'Eşik Araması' seçeneğini belirleyin. Yatay imleç, Şekil 5A'da gösterildiği gibi, nicelenmesi gereken tüm olayları geçmelidir.
   2. Tıklayın &# 39; Tamam 've sonra' Tüm Kategoriyi Kabul Et '. Yazılım, daha sonra tüm uygun olaylar için izi arayacaktır. Olayların üstünde mavi işaretler olacak.
   3. Ana olay algılama penceresindeki parametreleri ayarlayarak otomatik seçim hassasiyetini ayarlayın.
   4. Tüm olaylar otomatik olarak tespit edildikten sonra sonuç penceresine gidin (Pencere → Sonuçlar) ve frekans verilerini içeren "Müdahale Aralığı" sütununu kopyalayın ( Şekil 5B ).
3. QT Aralık hesaplaması (Şekil 6-9):
   1. Durağan hal durumundayken bir imleci sağa ve arkasından tek bir FP'ye yerleştirin. 'Olay Algılama' → 'Şablon Oluştur'u seçin ( Şekil 6 ) .
   2. FP'nin doğru tanımlandığını kontrol edin ve 'Ekle'yi tıklayın. Şablon alt panele taşınacaktır.
   3. Şablonu '.atf' olarak kaydedindosya. Bu şekilde, yazılım tarafından tüm kayıt boyunca aranacak bir şablon izi oluşturuldu ( Şekil 7 ). Her bir durum için bir şablon oluşturun çünkü bir ilaç etkisi FP'nin şeklini değiştirebilir. Gerekirse izi, iki imleç içinde en fazla 10.000 nokta içerecek şekilde hafifçe filtreleyin.
   4. Şablon '.atf' uzantısıyla kaydedildikten sonra 'Etkinlik Algılama' → 'Şablon Araması' seçeneğini belirleyin ve şablonu yükleyin.
   5. Seçilen aralıktaki tüm FP'leri doğru olarak tanımlamak için "Şablon eşleme eşiğini" ayarlayın.
   6. Tüm olaylar doğru bir şekilde tanımlandıktan sonra, onları yeni bir '.abf' dosyasına kaydedin.
4. Dosyayı analiz yazılımıyla açın ve otomatik olarak Q / R ve T tepeleri için 'Tepenin Süresi' hesaplayın ( Şekil 8, 9 ). İzler çok gürültülü ise, bir filtre uygulayın. QT aralığını çıkarılarak QT aralığını hesaplayın.Seçilen bir elektronik tablo editöründeki T değerinden Q / R değeri.

Sonuçlar

Ayrılma ve kaplamadan bir gün sonra, hPSC-CM tabakası, MEA odasının merkezini kaplayan yoğun ve beyaz bir film olarak görülecektir ( Şekil 3A ). Halkanın çıkarılmasından sonra ( Şekil 3B )   Katman yerinde kalmalı ve hafif bir mikroskopta muayene MEA elektrotlarını (müteahhitlik) hPSC-CM tabakası ile örtüşecek şekilde gösterecektir ( Şekil 3C ). Hücrelerin fiziksel ve elektriksel bağlanması nedeniyle, analiz için yalnızca bir elektrot (altın elektrot) kullanılacaktır.

Alternatif olarak, embriyo gövdeleri veya mikro dokular gibi 3D yapılarla çalışırken, bunlar fiziksel ve elektriksel olarak ayrılmış olacak şekilde plakalanabilir. Mikroskoptaki görsel inceleme, kümeler arasında herhangi bir fiziksel bağlantı olmadığını ve MEA'larda senkronize edilmemiş R dalgalarının elektriksel birleşmeyi onaylamayacağını doğrulamıştır. Bu cAse, çoklu bağımsız elektrotlar analiz edilebilir.

FP izlerinin tipik kayıtları Şekil 4'te gösterilmektedir. Özellikle, iyi kalitede bir iz, Na ⁺ akışı ve membran depolarizasyonuna (R / Q tepe) karşılık gelen açık bir zirve, K ⁺ efflux'a (T tepe) karşılık gelen berrak bir repolarizasyon fazı ve yüksek Sinyal / gürültü oranı ( Şekil 4A , solda: y-ekseni skalasına dikkat edin ve Şekil 4B ). Kötü kalite izleri ( Şekil 4A , orta) hPSC-CM'lerin MEA plakasına veya zayıf hPSC-CM elektriksel aktivitesine bağlanamaması sonucunda olabilir. Daha iyi bağlanmak için 1-3 gün beklemek sinyali artırabilir; Bununla birlikte, hiç sinyal gelişimi gözlenmiyorsa, bu MEA'yı deneylerden hariç tutmak önerilir. Gürültülü izler ( Şekil 4A , sağ) filtreleme yapıldıktan sonra analiz edilebilir.

Şekil 5A, 5B ). Dikey imleçler tarafından tanımlanan zaman aralığında, her tepe noktasına karşılık gelen mavi işaretler bulunmalıdır. Programın bir veya daha fazla zirveyi tanımlamaması durumunda, yatay imleci hareket ettirmeyi ve analizin tekrar yürütülmesini veya algılama ayarlarını yapmayı deneyin. Benzer şekilde, QT aralığının başarılı bir şekilde analizi, FP algılamayı gösteren ekranın görsel denetimi ile tanımlanabilir ( Şekil 7 ). Dikey imleçler tarafından tanımlanan zaman aralığında, her bir FP algılamasına karşılık gelen mavi işaretler bulunmalıdır. Programın bir veya daha fazla FP'yi tanımlamaması durumunda, FP şablonunu yeniden tanımlamaya çalışın ( Şekil 6 ) veya algılama ayarlarını yapın ve analizleri tekrar çalıştırın.

Ayrılmış bireysel FP izleri veya ortalamaları (Şekil.E 8), Şekil 9'daki gibi belirli ayarlarla QT aralığı değerlerini elde etmek için kullanılabilir. Hastalıklı ve WT hPSC hatlarında ( Şekil 10A ) QT-RR ilişkisinin analizi önerilir ve anlamlıdır ve QT aralığı düzeltmelerinin ( Şekil 10B-10D ) gereksinimini ve / veya etkisini değerlendirmek için kullanılır. LQTS'ye neden olan mutasyonları taşıyan hPSC-CM'lerin, WT kontrollerine kıyasla QT aralıklarının uzaması vardır ( Şekil 11A ). Bir hERG bloke edici ile hPSC-CM'lerin tedavisi, QT aralığında uzamaya neden olur ( Şekil 11B ); Buna karşılık, bir hERG aktivatörü ile tedavi QT aralığının kısalmasına neden olur ( Şekil 11C ). Son olarak, hPSC-CM'lerin dayak frekansını etkileyen ilaçlarla tedavi, RR aralığındaki bir değişiklik olarak görünmelidir ( Şekil 11D , RR aralık kısalması).

/>
Şekil 1: MEA Cipslerinin Sterilizasyonu ve Kaplanması. ( A ) MEA çipini bir otoklavlanabilir cam petri kabı içerisine yerleştirmek, alüminyum folyoya sarmak, 6 dakika süreyle buharlaştırmak ve 30 dakika UV'ye maruz bırakılması dahil olmak üzere sterilizasyon işlemini temsil eden şema. ( B ) Özel PTFE halkanın üst (sol panel) ve yan (orta panel) görüntüleri; Halkanın MEA çipinin merkezinde yerini belirleyen 4 kanat dahil olmak üzere 1.2 cm'lik bir dış çapa ve iç çapı 0,4 cm'dir (sağ panel). ( C ) Çipin standart plastik bir Petri kabına yerleştirilmesi, MEA bölmesinin dışına 8 mL deiyonize su ilave edilmesi, PTFE halkasının bölmenin ortasına yerleştirilmesi ve elektrot dizisinin fibronektin ile kaplanması da dahil olmak üzere MEA çipinin hazırlanmasını temsil eden şematik . İnkübasyon süresinden sonra, fibronektin çıkarılır ve kültür ortamı ile değiştirilir.T = "_ blank"> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: hPSC-CM'lerin Ayrılması ve Kaplanması. HPSC-CM'lerin enzimatik ayrışma, santrifüjleme, yeniden süspanse etme ve MEA odasının merkezinde kaplama işlemlerini temsil eden şematik. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: hPSC-CM Katmanlı MEA Cipsleri. ( A ) Halkayı ve hPSC-CM katmanını içeren MEA çipinin üst görüntüleri. ( B ) halkanın sökülmesinden sonra MEA çipinin yandan görünümü. ( C ) hPSC-CMs tabakasının parlak alan görüntüsü,Elektrod dizisi; 4X büyütme. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: hPSC-CM'lerin MEA Kayıtları. ( A ) MEA ile kaydedilen, R / Q ve T tepeleri ile yüksek sinyal / gürültü oranı (solda), net olarak görülebilen R / Q ve T tepeleri olmayan orta kaliteli iz (orta) ile iyi kalitede iz gösteren temsilci izleri, Ve R / Q ve T tepeleri ile açıkça görülebilen ama düşük sinyal / gürültü oranıyla (sağda) gürültülü bir iz. ( B ) HPSC-CM'leri kullanarak MEA deneyleri sırasında kaydedilebilen farklı morfolojilere sahip kaliteli FP izlerinin temsili örnekleri. Gölgeli alan, analiz sırasında ölçülen QT aralığını temsil eder. MEA'daki FP, ilk derivativ'e benzediğindenE, aksiyon potansiyeli ²⁸ , FP noktasının integralini kırmızı noktalı çizgi şeklinde göstererek, tam bir aksiyon potansiyelinin repolarizasyonuna yakın bir T dalgası seçiminin teorik gösterimi olarak hesapladık. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5: RR Aralık Hesaplaması. ( A ) Analiz yazılımını kullanarak otomatik pik saptama (üst) ve veri çıkarma (alt) ile RR aralığı analizi örneği (Bkz. Materyal Tablosu). Dikey imleçler, ilgi alanının zaman aralığını tanımlar ve yatay imleç, algılanan ve mavi işaretlerle tanımlanan tüm olayları geçmektedir. ( B ) Büyütülmüş sütun, RR aralığını hesaplamak için kullanılan çıkarılan verileri gösterir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 6: FP Şablonunun Yaratılması. Tek bir FP öncesi ve sonrasında yerleştirilen dikey imleçleri kullanarak şablon seçimi örneği. Bu şablon FP otomatik tanımlama için kullanılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7: FP Şablon Otomatik Tanımlama. İki dikey imleç tarafından tanımlanan aralık boyunca şablon aramaya örnek. Tespit edilen tüm olaylar mavi işaretlerle tanımlanır ve otomatik olarakY ekte üst üste bindirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 8: FP Parametrelerinin Nicelleştirilmesi. Kaydedilen olayların analizi, ilk iki imleç içinde manuel olarak belirlenen R tepe noktası ve son iki imleç içinde el ile tanımlanan T tepe noktası. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 9: Analiz Penceresi. R pik tespit etmek için İstatistikler penceresinde kullanılan parametreler. T zirve tespiti için imleçleri değiştirin ve (gerekirse) porağbet görürdü. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 10: QT-RR İlişkisi. ( A ) WT (LQT1 ^corr ) ve Uzun QT sendromu tip 1 (LQT1 ^R190Q ) ^hPSC -CM'ler ^arasındaki QT ve RR aralıkları arasındaki farklı ilişki örneği. Gölgeli alanlar, RR aralığındaki aynı kaymanın, LQT1 hasta hattının QT aralığında daha büyük bir kayma meydana getirdiğini ve dolayısıyla aritmiye duyarlılığın arttığını göstermektedir. ( B ) 7 değişik hPSC hattından CM'lerde MEA'da ölçülen düzeltilmemiş QT ve RR aralıkları arasındaki ilişki. Bazett'in ( C ) veya Fridericia'nın ( D ) formüllerine QT düzeltmesinin etkisi gösterilmiş ve içinde QT-RR eğiminde değişiklik olarak görülebilir Terval ilişki. Şekiller referans ^30'dan uyarlanmıştır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 11: Hastalık veya İlaca Bağlı QT ve RR Aralık Varyasyonları. ( A ) Uzun QT Sendromu (LQTS) mutasyonu taşıyan bir hastadan türetilmiş hPSC-CM'deki QT aralığının uzatılması örneği, izogenik WT kontrolüne kıyasla. ( B ) Farmakolojik hERG bloğu üzerine hPSC-CM'deki QT aralığının uzatılması örneği. ( C ) artan dozlarda hERG aktivatörü ile tedavi üzerine QT aralığı kısalması. Ok, kısalmanın yönünü belirtir. ( D ) İlaca bağlı RR aralığı kısalması örneği. Panel (C) referans olarak uyarlanmıştır.> 30. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Düşük insülin, BSA, polivinilalkol, esansiyel lipitler (LI-BPEL) Orta
Bileşen		100 mL için miktar
IMDM		43 mL
F12		43 mL
Askorbik Asit 2-fosfat (damıtılmış suda 5 mg / mL)		1 mL
Hücre kültürü takviyesi (L-glutamin için doğrudan yer değiştirme)		1 mL
Penisilin / Streptomisin		0.5mL
Fenol kırmızısı		1 mg
Proteinsiz Hibridoma Orta-II (PFHMII)		5 mL
BSA (IMDM içinde ağ / hac% 10)		2.5 mL
PVA (damıtılmış su içinde ağ / ağ% 5)		2.5 mL
Kimyasal Tanımlı Lipid Konsantresi (CDLC)		1 mL
İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin (ITS-X) 100X		0.1 mL
Α-Monotiyogliserol (1 mL IMDM içinde 13 uL)		0.3 mL
Reaktifleri birleştirin, 0.22 um gözenekli filtre ile filtre edin ve ortamı 2 ° C'ye kadar 4 ° C'de saklayın.

Tablo 1: Li-BPEL Ortam Bileşimi.

Tartışma

Bu protokol, ÇKA'ları kullanarak FP'yi ölçmek için hPSC-CM'leri nasıl ayrıştırıp hazırlayacağınızı gösterir. HPSC-CM'ler genellikle FP olarak ölçülebilen ve dayak frekansı, QT aralığı süresi ve aritmik olaylar açısından anlamlı veriler sağlayabilen spontan elektriksel aktiviteleri gösterir.

MEA üzerinde dayak katmanın yeniden oluşturulması için 2D kardiyak farklılaşmış kültürlerin ayrışması gereklidir ve kritik bir adımı temsil eder. Tekrarlanan pipetleme ve / veya agresif ayrışma enzim muameleleriyle oluşan mekanik stres, yüksek hücre mortalitesi, MEA plakasına bağlanamaması ve spontan elektriksel aktivitenin olmamasına neden olabilir. Bu protokol tek katmanlı kültürler için optimize edilmiştir. Bununla birlikte, EB'lerin toplanması, bunu takiben PBS yıkaması ve ayrışan enzim ile daha uzun kuluçka süresi gibi küçük değişikliklerle birlikte üç boyutlu (3D) kültürler ( ör., Embriyot gövdeleri veya EB'ler) için de benzer bir yaklaşım kullanılabilir. İthalatAntite, hem 2D hem de 3D diferansiye kültürlerde, daha yaşlı farklılaşmış hücreler, artmış ekstraselüler matriks birikimi nedeniyle hücrelerin ayrılması için daha uzun inkübasyon süresi gerekebilir.

Burada, FP parametrelerinin nicelleştirilmesi için açıklanan protokol, kardiyoaktif ilaçlar için doz yanıt eğrileri oluşturmak için kullanılabilir. Yakın zamanda Cavero ve ark. ³¹ , bir ilacın başlangıç ​​konsantrasyonu, bir MEA ölçümünün sonucunu derinden etkileyebilir. Bu nedenle, sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini arttırmak için aşağıdakileri öneririz: 1) aktive edilemeyen aktivatörler / bloke edicilerde, test edilecek ilacı içeren nispeten geniş hacimde bir ortam kullanın. Daha ayrıntılı olarak orta hacmin% 10-50'sini MEA çipinden çıkarın ve ilacın daha önce uygun konsantrasyonda çözünmüş olduğu eşit hacimde bir ortam ekleyin. Bu durumda, nihai ilaç konsantrasyonunun hesaplanması için,Ortadan kaldırıldıktan sonra konsantrasyon değişimini. 2) Tersinir aktivatörler / bloke edicilerde, 100X stok solüsyondan her bir ilaç dozundan 10 uL ekleyin.

Kardiyak farklılaşma protokollerinin çoğunluğu, nodal benzeri, atriyal benzeri ve ventriküler benzeri kardiyomiyositlerin değişken bir karma popülasyonuyla sonuçlanır ve ventriküler tip en fazla temsil edilir. Bu, kardiyak hastalıkların modellenmesi sırasında belirli bir kardiyomiyosit alt tipini veya kardiyak alt tipe spesifik iyon kanallarına etki eden ilaçları etkilediğinde bir sınırlama oluşturabilir. Birkaç çalışma kalp diferansiasyonu ^{3 , 5 , 37 , 38} sırasında daha kontrollü spesifikasyonu yönlendiren koşulları iyileştirmiş olmasına rağmen, daha geniş uygulanabilirliği halen araştırılmaktadır.

Dahası, farklılaşmanın değişken verimliliği (farklı deneylerde ve diFferent hPSC hatları) görülebilir ^{39 , 40 , 41 , 42 , 43 , 44} . Yüzey protein ekspresyonu ^{35 , 45'e} (floresan yardımlı hücre ayırma veya manyetik boncuk seçimi ^{46 , 47} ) ve metabolik seleksiyon ^{44 , 48'e} dayalı kardiyomiyosit zenginleştirme stratejileri, herhangi bir (genetik olarak modifiye edilmiş veya Değiştirilmemiş) hPSC-CM öncesi, elektrik sinyalini geliştirmek için.

HPSC-CM'ler insan erişkin kardiyomiyositleri ^{4 , 49'a} kıyasla bilinen derecede olgunlaşmamış olsalar da, r^{19 , 20 , 50} spesifik hastalıkla ilişkili değişiklikleri ( örn ., Kanalelopatiler) ve uyuşturucu kaynaklı tepkileri ( örn., Kardiyak iyon kanalı bloke edicileri) tanımlamak ve tanımlamak ^{4 , 51} . Dahası, olgunlaşmamış hücrelerin ayrışması daha kolaydır ve ayrılma ve kaplamadan sonra yetişkin kardiyomiyositlerden daha iyi iyileşir ^{44, bu} nedenle, hPSC-CM immatitesi bu açıdan bir avantaj olarak ödüllendirilebilir. Bununla birlikte, örneğin tekrarını yapabilmek için. Yetişkin kardiyomiyositlerin ilaç yanıtlarını sadakatle üreterek, daha olgun bir mekanik, metabolik ve elektriksel hPSC-CM durumu elde edilmelidir. Bu hücrelerin olgunlaşması için yöntemler, kültürde ⁵² uzatılmış süre, mekanik gerginlik ⁵³ , elektriksel hızlanma ⁵⁴ , küçükMoleküller ⁵⁵ , 3D-kültür ⁵⁶ , diğer hücre tipleri ⁵⁷ ile birlikte kültür ve hatta bu yaklaşımların bir kombinasyonu ⁵⁸ ; Bugüne kadar bu yaklaşımlardan hiçbiri yetişkin benzeri bir fenotipe yol açmamıştır.

Olgunlaşma özelliklerinin bir parçası olarak, hPSC-CM'ler elektriksel otomatikliği gösterir. Burada, QT ve RR aralıklarının doğru bir şekilde nasıl ölçüleceği konusunda ayrıntılar verilmektedir. Spontan elektriksel aktiviteyi ölçmenin bir sınırlaması, hPSC-CM'ler farklı vuruş frekansları gösterdiğinde QT aralıklarının karşılaştırılmasının zor olabileceğidir. Bu durumda Bazett'in veya Fridericia'nın formülleri, frekans için QT aralığını düzeltmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, daha önce bildirildiği gibi, düzeltme yönteminin kendisinden kaynaklanabilecek herhangi bir yanlılığı hariç tutmak için, ham ve düzeltilmiş veriler için QT aralığına karşı RR aralığı çizilerek Major-Axis regresyon analizinin yapılmasını şiddetle tavsiye ederiz.

Burada sunulan protokol, daha önce açıklanan yöntemler ^{59 , 60} ile birlikte, hPSC-CM FP'lerin prosedürlerinin ve analizinin standartlaştırılmasına, verilerin tekrarlanabilirliğinin geliştirilmesine ve laboratuarlar arası sonuçların daha iyi karşılaştırılmasına yardımcı olur.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
Biyolojik güvenlik kabini/laminer akış başlığı	Cleanair
MEA2100 in vitro kayıt sistemi	Çok Kanallı Sistemler
CO2 hücre kültürü inkübatörü	Sanyo	MCO-15A
Santrifüj	Hitachi	himac-CT6EL
Leica stereomikroskop	Leica Microsystems	MS5
El Tipi Pipetleyici (P-10 (10 μ L), P-200 (200 μ L), P-1000 (1.000 μ L))	Gilson International
Filtre uçları (10 μ L, 200μ L, 1.000μ L)	Corning	4807 (10 μ L), 4810 (200μ L), 4809 (1000μ L)
Tek kullanımlık şişe üstü filtre (0.22 & mu; m gözenek boyutu)	Kırlangıç	SCGVU02RE
Steril plastik pipet	Greiner Bio-One	606180 (5 mL), 607180 (10 mL), 760180 (25 mL)
Cımbız	Dumont
Otoklavlanabilir Petri kapları	VWR/ Duran Group	391-0860
MEA çip	Çok Kanallı Sistemler	MEA200/30iR-Ti-gr
Fosfat tamponlu Tuzlu (PBS) kalsiyum, magnezyum	Thermo Fisher Scientific	14040-091
Fosfat Tamponlu Salin (PBS) kalsiyum içermez, magnezyum içermez	Thermo Fisher Scientific	14190-169
İnsan rekombinant fibronektin	Tebu-Bio	J64560
Özel yapım politetrafloroetilen (PTFE) MEA halkaları	LUMC: Enstrüman Geliştirme
BölümüAyrışma enzimi - TrypLE Select 1x	Thermo Fisher Scientific	12563-029
Tergazyme enzim deterjanı	Sigma-Aldrich	Z273287-1EA
Damıtılmış Su	Thermo Fisher Scientific	15230-089
Name	Company	Katalog Numarası	Yorumlar
LI-BPEL ortamı için reaktifler
Iscove'un Modifiye Dulbecco'nun Ortamı (IMDM)	Thermo Fisher Scientific	21056-023
F12 besin karışımı (Jambon)	Thermo Fisher Scientific	31765-027
Askorbik Asit 2-fosfat	Sigma-Aldrich	A8960
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050-038
Penisilin / Streptomisin	Thermo Fisher Scientific	15070-063
Fenol Kırmızı	Sigma-Aldrich	P3532
Proteinsiz Hibridoma Orta-II (PFHMII)	Thermo Fisher Scientific	12040-077
Sığır Serum Albümini (BSA)	Bovogen Biologicals Avustralya	BSAS05
Poli (Vinil Alkol) (PVA)	Sigma-Aldrich	P8136
Kimyasal Olarak Tanımlanmış Lipid Konsantresi (CDLC)	Thermo Fisher Scientific	11905-031
İnsülin-Transferrin-Selenyum-Etanolamin (ITS-X) 100x	Thermo Fisher Scientific	51599-056
& alfa ;-Monotiyokliserol	Sigma-Aldrich	M6145
< güçlü > Adı	Company	Yazılım sürümü	Comments
MC_Rack	Çok Kanallı Sistemler	4.6.2	Alternatif olarak, veriler Cardio2D veya MC_Experimenter (Çok Kanallı Sistemler) kullanılarak kaydedilebilir.
TCX Control	Çok Kanallı Sistemler	1.3.4
MEA Select	Çok Kanallı Sistemler	1.3.0
MC_Data Aracı	Çok Kanallı Sistemler	2.6.15	Alternatif olarak, Çok Kanallı Veri Yöneticisi (Çok Kanallı Sistemler), özel veri aktarımı gerektiğinde kullanılabilir (HDF5, EDF, etc.)
Clampfit	Molecular Devices	7.0.0	Adım 10.1'de tüm verilerin analizi, grafiği ve biçimlendirmesi için kullanılır. Clampfit'i kullanmak için, Moleküler Cihazlar Web Sitesinde bulunan elektrofizyoloji veri toplamayı ve pClam'i (en son sürüm, 10.7.0) indirin ve kurun. Tamamlandığında, Clampfit yazılımını başlatın. Alternatif olarak, veriler Cardio2D (Çok Kanallı Sistemler) veya MatLab özel kodu kullanılarak analiz edilebilir.