Yöntem makalesi

Eyeball Dokusunda Efektif Hafıza T Hücrelerini Artıran Kronik Otoimmün Kuru Göz Fare Modeli

DOI:

10.3791/55592

⸱

7 Haziran 2017

 ,  ,  , 
1Singapore Eye Research Insitute, A Member of SingHealth, 2DUKE-National University of Singapore Medical School, 3Lee Kong Chian School of Medicine, Nanyang Technological University, 4Singapore National Eye Center, 5Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu rapor, sıçan lakrimal bez özütü, ovalbümin ve komple Freund adjuvantının bir emülsiyonu ile bağışıklaştırma yoluyla Lewis sıçanlarında kronik deneysel otoimmün göz kurumasına neden olan bir yöntem ve bunu takiben göz kapağı yumrusu ekstraktı ve ovalbümin forniceal subkonjonktiva ve lakrimal bezlere enjekte edilir. Altı hafta sonra.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuru göz hastalığı morbiditeye ve sağlık yüküne neden olan ve yaşam kalitesini düşüren çok yaygın bir durumdur. Otoimmün kuru göz koşullarını tedavi etmek için yeni terapötik maddeleri test etmek için uygun bir kuru göz hayvan modeline ihtiyaç duyulmaktadır. Bu protokol, kronik otoimmün bir kuru göz sıçan modelini tanımlamaktadır. Lewis sıçanları lakrimal bez özütü, ovalbümin ve komple Freund adjuvanı içeren bir emülsiyonla aşılanmıştır. İki hafta sonra, tamamlanmamış Freund's adjuvantında aynı antijenlerle ikinci bir aşı oluşturuldu. Bu aşılar, kuyruk tabanında subkütan olarak uygulandı. Oküler yüzeydeki ve lakrimal bezlerdeki bağışıklık tepkisini artırmak için lakrimal bez özütü ve ovalbümin forniceal subkonjonktiva ve lakrimal bezlere ilk bağışıklamadan 6 hafta sonra enjekte edildi. Sıçanlar, gözyaşı üretiminde azalma, gözyaşı stabilitesinde azalma ve kornea hasarında artış gibi kuru göz özellikleri geliştirdi. Bağışıklık yanlısıAkış sitometrisi ile yapılan dosyalama, göz küresinde CD3 + efektör bellek T hücrelerinin baskınlığını gösterdi.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kuru göz hastalığı (DED), göz yüzeyine zarar verebilecek rahatsızlık, görme bozukluğu ve gözyaşı filmi dengesizliği semptomlarına yol açan, gözyaşı ve oküler yüzeyin çok faktörlü bir hastalığıdır. Gözyaşı filminin osmolaritesi artar ve oküler yüzeyin inflamasyonu eşlik eder 1 . DED ile ilişkili semptomlar yanma, batma, gritlik, yabancı cisim hissi, yırtılma, göz yorgunluğu ve kuruluk 2 , 3'tür . DED'in iki temel nedeni, gözyaşı salgı bezi ve gözyaşı filminin aşırı buharlaşmasıyla gözyaşı üretiminin azaltılmasıdır. Sjogren sendromu, sistemik lupus eritematosusu ve romatoid artrit gibi otoimmün hastalıkları olan hastalarda, meibom bezlerine bağışıklık hasarı, gözyaşı kararlılığı için gerekli olan lipidlerin ifadesini azaltır. Ayrıca, göz yüzeyine bağışık hasar oluşması ürünü azaltırYüzey ıslanabilirliği için önemli olan müsinlerin açıklanması. Birlikte, bu işlemler kümülatif olarak kronik göz kurumasına neden olur 5 , 6 , 7 .

Gözyaşı replasmanı ve anti-inflamatuar terapi tedavinin temel dayanak noktalarıdır. Bununla birlikte, DED ( yani, kortikosteroidler ve siklosporin) için güncel anti-inflamatuar terapiler , immünsüpresiftir ve ciddi yan etkilere yol açar 8 , 9 , 10 . Otoimmün göz kurumasını engellemek için yeni immünomodülatör ajanların test edilmesi için uygun bir hayvan modeline ihtiyaç duyulmaktadır.

Spesifik genetik defekti olan fareler 11 , 12 , 13 , spesifik genlerden yoksun fareler 14 , 15 ve transjenik fareler aşırı ifade immüno-regülasyonOry genleri otoimmün kuru göz modelleri olarak kullanılmıştır 16,17. Antijen kaynaklı otoimmün hayvan modelleri de farelerde 18 , tavşanlarda 19 ve sıçanlarda 20 , 21 bildirilmiştir. Burada antijene bağlı kronik otoimmün göz kuruması modelini açıkladık. Bu model iki önceki modelin bir modifikasyonudur; Biri lakrimal bez özütleri kullandı ve ikincisi lakrimal bezlerden 20 , 21 bir otoantijeni ( örn., Klklb22) kullandı.

Hastalık, ovalbümin, komple Freund adjuvanı ile 6-8 haftalık kadın Lewis sıçanlara ve Sprague-Dawley sıçanlarından gözyaşı bezi özütleri içeren emülsiyonun subkutanöz immünizasyonu ile indüklendi ( Şekil 1 ). Tamamlanmamış Freund's adjuvantında aynı antijen ile ikinci bir aşılama yapıldı.Iki hafta sonra uygulanır. Anti-spesifik bağışıklık hücrelerinin gözyaşı bezi ve oküler yüzeyine alınması için, göz kapağı bez özütü ve ovalbümin (1 mg / mL) karışımı 6. -7 . Haftada forniceal subkonjonktiva ve lakrimal bezlere enjekte edildi ( Şekil 1 ). Farelerin% 85'inden fazlası ilk aşılamadan 70 gün sonra kuru gözün karakteristik özelliklerini geliştirdi. Bu özellikler azalmış gözyaşı üretimi ( Şekil 2 ), artmış korneal flöresein boyama ( Şekil 3 ) ve gözyaşı kararlılığını azaltmıştır ( Şekil 4 ). T hücrelerinin normal sıçanların gözbebeklerinde, akış sitometrisiyle immün profillemesi, CD3 + efektör bellek T hücrelerinin baskınlığını ortaya çıkarmaktadır ( Şekil 5 ve 6 ). Otoimmün DED'li sıçanlar, CD3 + efektör bellek T hücrelerinde bir artış ve naif ve merkezi bellek T hücrelerinde buna karşılık gelen bir azalma göstermektedir ( Şekil 6 ).

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hayvanlar, kurumsal kılavuz ilkelere ve Oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı için ARVO Bildirisine göre ele alınmıştır. Çalışma protokolü, SingHealth'in Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Lakrimal Bez Hulasası Hazırlanması

NOT: Sıçanlar intraperitoneal ketamin (75 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) enjeksiyonu ile anestezi altına alındı. Doğru anestezi tırnaklanma ve kuyruk sıkıştırması ile doğrulandı. Her prosedürden sonra kuruluğu önlemek için sıçan gözlerine oftalmik jel uygulandı. Anestezi edilmiş sıçanlar hayvanları tamamen iyileşene kadar sıcak tutmak için uzak kızılötesi ışıkların altına yerleştirildi. İşlemler ve iyileşme süresi boyunca, hayvanlar araştırmacılar tarafından yakından takip edildi. Tüm malzemeler ve cerrahi aletler kullanımdan önce sterildir. Deneyin sonunda sıçanlar intraperitoneal pentobarbital (80 mg / kg) enjeksiyonu ile ötenazi yapıldı.Tam ötanazi, göz kağıdına dokunmak suretiyle kardiyak nabız yokluğu ve göz kırpma refleksi olmadığı doğrulandı. Sıçanlar, standart koşullar altında muhafaza edildi: oda sıcaklığı, 21-23 ° C; Bağıl nem,% 30-70; Açık-karanlık döngüsü, 12 saat (7:00 - 7:00) arasında değişme.

  1. Ötenazi yapılmış dişi Sprague-Dawley sıçanlarını (8 haftadan 16 haftaya kadar yaş aralığı) masaya bir kulak ve diğeri yukarı bakacak şekilde düz duracak şekilde yerleştirin. Açığa vurulmuş kulağın altında, bir çift yay makasıyla, 10 mm'lik bir kesi daha üstün bir şekilde yapın. Lakrimal bezin çevresindeki bağ dokusundan ve drenaj kanalından ayrılmasıyla çıkarın.
    1. Gerekli olana kadar bezleri -80 ° C'de saklayın. Bezleri buz üzerinde çözdürün. Makaslı buzda olabildiğince ince kıymalayın. Lakrimal bez başına 1x proteaz inhibitörü ile 150 μL PBS ekleyin.
  2. Sonicatör 10 saniyede,% 10 genlikle 10 s kapalı olarak ayarlanarak 20 kHz'de 5 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri sonikasyon yapın. Oğlu santrifüjleyin13.000 xg'de ve 4 ° C'de 20 dakika bekletildi.
  3. Süpernatanı pipetleyin ve yeni bir tüpe aktarın. Süpernatantı 1.5 mL tüplere bölün ve -80 ° C'de saklayın. Protein konsantrasyonunu, üreticinin talimatlarına göre bir bicinchoninic acid assay 22 ile ölçün.

2. Emülsiyon ve Boğmaca Toksininin Hazırlanması

  1. Emülsiyon
    1. Isı ile öldürülen Mycobacterium tuberculosis H37Ra 40 mg'ını, 1 mg / mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra içeren 10 ml'lik komple Freund'un adjuvantına ilave edin ve iyice karıştırın .
      NOT: Nihai komple Freund adjuvanı, 5 mg / mL Mycobacterium tuberculosis H37Ra içerir.
    2. Ovalbüminyum tartılır, PBS içinde çözülür ve 2 mg / mL ovalbümin ve 10 mg / mL gözyaşı bezi özütü içeren bir antijen karışımı hazırlanır. Her bir hayvan için 200 μL'lik bir enjeksiyon hacmi elde etmeyi amaçlayan bir ana karışım hazırlamak bHayvan sayılarına göre.
    3. Antijen karışımına adjuvan hacminin 1: 1 oranında olmasını sağlayarak, tamamlanmamış Freund'un adjuvantını veya komple Freund'un adjuvanını 50 mL'lik bir tüpe aktarın. Sıçrama ile sonuçlanmayan en yüksek hızda vorteks yaparken antijen karışımını damla damla adjuvana ilave edin. Tüm antijen eklendikten sonra 5 dakika vorteks işlemine devam edin.
    4. Emülsiyonu 5 mL'lik şırıngaya aktarın ve şırınga konektöründen başka bir 5 mL'lik şırıngaya bağlayın. Karıştırmak için emülsiyonu bir şırıngadan diğerine doğru itin.
      NOT: Suya konulduğunda tek bir damla bir küre olarak kalırsa emülsiyon hazırdır. Sadece yeni hazırlanmış emülsiyon veya emülsiyon, gece boyunca 4 ° C'de saklanmalıdır.
  2. Boğmaca toksini
    1. 100 ng / μL'lik bir nihai konsantrasyonu sağlamak için 500 μL suda 50 μg boğmaca toksini yeniden yapılandırın. Tondan 30 saniye süreyle kap koyun.Oksin tamamen çözülür.
      NOT: Filtrasyonla sterilize etmeyin, aksi takdirde malzeme kaybı olur. Donma. Bu çözüm, 4 ° C'de en az 6 ay süreyle aktif kalır.
    2. PBS kullanarak, 100 ng / μL boğmaca toksini 3 ng / μL'ye seyreltin. Seyreltilmiş boğmız toksini 100 mcL'yi, 27 G'lik bir iğne ile 1 mL'lik bir Luer-kilit enjeksiyon şırıngasına aktarın.

3. Lewis Sıçanlarının Aşılanması

  1. 0 gününde, emülsiyon birkaç kez karıştırın. 1 μg lakrimal bez özü ve 200 μg ovalbümin içeren komple Freund adjuvanını içeren 200 μL emülsiyon, 27G iğneli 1 mL Luer-lock şırıngalara dağıtılmalıdır. Emülsiyonu, anestezi olmadan sıçan kuyruklarının tabanında subkutan yoldan enjekte edin.
    NOT: Kuyruk, enjeksiyondan önce önceden ısıtılması gerekmez. Her sıçan, 1 μg lakrimal bez özütü ve 200 μg ovalbümin ile komple Freund adjuvanı ile bağışıklanmıştırH 500 ug Mycobacterium tuberculosis H37Ra .
  2. 14. günde, tamamlanmamış Freund's adjuvanında 1 mg gözyaşı bezi özü ve 200 μg ovalbümin içeren 200 uL emülsiyon, 0 gün ile aynı şekilde enjekte edin. 100 ul PBS içinde intraperitoneal olarak 300 ng boğmaca toksini enjekte edin Aynı gün sıçan başına.

4. Antijene Belli Bağışık Hücrelerin Alımı İçin Forniceal Subkonjonktiva ve Lakrimal Bandı içine Antijen Karışımının Enjekte Edilmesi ve Lokal İnflamasyona Neden Olarak

  1. Deneydeki sıçanların sayısına göre ovalbümin ve gözyaşı salgıları miktarını hesaplayın. İstenen miktarda ovalbümin tartılır ve 1 mg / mL ovalbümin ve 1 mg / mL gözyaşı bezi özütü içeren antijen solüsyonu hazırlanarak, 1. adımda hazırlanan çözülmüş lakrimal bez özütü ile birleştirilir.
  2. Sıçanları, intraperitoneal enjeksiyon yoluyla ketamine (75 mg / kg) ve xylazine (10 mg / kg) ile anestezi altına alınız. To'yu sıkıştırUygun anestezinin sağlandığından emin olmak için sıçanların hepsini ( yani, tutamdan sonra tepkisel hareket gözlemlenmemektedir). Gözün forniceal subkonjonktiva'sına 5 μL antijen enjekte edin. Lakrimal bezin içine 20 uL antijen enjekte edin.

5. Kuru Göz Özelliklerinin Değerlendirilmesi

NOT: Adım 5.1-5.3 için, anestezi uygulanmış sıçanlar, hareket etmemek için eldivenli bir elle düz bir yüzeye dik duran bir şekilde tutturmalıdır.

  1. Gözyaşı hacmini fenol kırmızısı ile ölçün.
    1. İpliği tutmak için bir çift forseps kullanın ve sıçanın alt göz kapağını çekmek için başka bir forseps kullanın. İpliği alt forniksin proksimal köşesine 1 dakika yerleştirin ve sonra ipliği çıkarın.
      NOT: Gözyaşları, ipliğin ıslanan kısmını kırmızı renkte yapar.
    2. Cırtlıın yanındaki ipliğin ıslak kısmının uzunluğunun bir görüntüsünü milimetre işaretlerle alın. Onuncu oya kadar ıslak uzunluğu ölçünFa milimetre görüntü yazılımı ( örn., ImageJ) kullanarak.
  2. Kornea / gözyaşı yumuşaklığını ölçün.
    1. Fareyi bir halka aydınlatıcı ve bir kamera bulunan bir stereomikroskopun altına yerleştirin. Sıçan korneasına 5 uL tuzlu su uygulayın. Salin yaymak için üst ve alt göz kapaklarını eldivenli parmaklarla ~ 5 kez hareket ettirerek pasif olarak yanıp söner.
    2. Koruyucu yüzeyinin ortasındaki halka aydınlatıcıyı 1.6x büyütme altında odaklayın. 10 saniyeden sonra fotoğraf görüntüleri elde edin.
      NOT: Halka aydınlatıcı, hayvanın kornealarındaki iki dairesel nokta görüntüsü çizgilerini yansıtmaktadır. Çarpık noktaların düzenli aralıklarla düzgün bir kornea / gözyaşı tabakası geldiğini düşündürüyor.
  3. Floresein boyaması ile kornea hasarını ölçün.
    1. Sıçan korneasına 2 μL% 0.2 floresein ekleyin. Göz yüzeyinde floresan boya yaymak için eldivenli bir parmakla üç kez parmak göz kapaklarını pasif olarak açın ve kapatın.
    2. 1 dakika sonra, 3 mL'lik şırıngayla (herhangi bir iğne ataşesi olmadan) 1 mL serum fizyolojik çozunur, şırıngayı korneaya yaklaşık 2-3 mm öne getirin ve hafifçe gözün üzerine tuzlu su salın.
    3. Arka plan lambaları kapalı olarak oküler görüntüleme mikroskopunun kobalt mavisi filtresinin ( örn. ~ 400 nm) altında görüntüler elde edin.
      NOT: Daha sonra, görüntüler daha önceki yayımlarda değişiklik yapılmış bir derecelendirme sistemi ile analiz edilmiştir 23 . Görüntüler yeşil lekelerin sayı, alan ve yoğunluğunu 0 ile 2 arasında derecelendirerek analiz edildi; burada 0, yokluğunu, 1'in 50 lekeden az nokta lekelenmesini, ve 2, 50 lekeden fazla nokta lekelenmeyi belirtir.
  4. Sıçanları pentobarbital (80 mg / kg) intraperitonal enjeksiyonu ile inhale edin. Makas kullanarak üst ve alt göz kapaklarını çıkarın. Forseps ile perioküler dokuları aşağı iterek gözbebekleri saptamak ve prolapsus. Dünyayı parçalayarak özgür bırakınEkstraoküler kaslar, optik sinir ve fornikal konjonktiva.
  5. Sıçan göz küresinin konumunu forsepsle düzeltin ve ekvator boyunca çevresel bir kesi ile açın. Merceği ve vitrini çıkarın. Diseke edilmiş gözbebekleri buz üzerinde 1.5 mL tüplere koyun.
  6. Adım 1.1'de açıklandığı gibi gözyaşı bezlerini toplayın. Akış sitometrisi analizine hazırlanmak için derine dağıtılan göz kağıdı dokularını ve gözyaşı bezlerini laboratuara hemen aktarın.
  7. Bağışıklık hücrelerini kollajenaz ve dispase II sindirim yöntemleriyle izole etmek 24 , 25 . Göz dokularındaki T hücresi alt popülasyonunu profillemek için akış sitometrisini kullanmaya devam edin 26 .
    NOT: Antikor paneli anti-CD45APC-Siyanin 7 (OX-1), anti-CD3 BV421 (1F4), anti-CD4 PE-Siyanin7 (OX-35), anti-CD45RC Alexa647 (OX-22) CD62 PE (HRLl), anti-CD44 FITC (OX-50) ve canlı hücre boyası 7-AAD. CD45 + CD3 arasında + 7AD - T hücreleri, naif (CD3 + CD45RC + ), efektör bellek (T EM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - ) ve merkezi bellek (T CM, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + ) T hücreleri kapatıldı .

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Şekil 1 deney tasarımını göstermektedir. Hem 48. günde hem de 70. günde, kuru göz klinik özellikleri aşılanmış sıçanlarda değerlendirilir. Gözyaşı hacmi, fenol kırmızısı ıslak kısmının uzunluğu ile temsil edilir. Şekil 2 , kontrol ve DED sıçanlarından fenol kırmızısı vasıtalarının temsili görüntülerini göstermektedir. DED grubundaki fenol kırmızının uzunluğu kontrol grubundan daha kısadır, bu da gözyaşı hacminin daha az olduğunu gösterir.

Floresein hasarlı kornea epiteline bağlanır. Böylece, kornea hasarı kornea floresan boyaması ile ölçülür. DED sıçanlarının kornea yüzeyindeki floresein lekeleri 0 dan 2'ye derecelendirildi ve kontrol fareleri ile karşılaştırıldı. DED'li sıçanlar, kontrol farelerine göre daha fazla flöresein boyamaya sahiptir ( Şekil 3 ), bu kornea hasarını düşündürmektedir.

Korneanın pürüzsüzlüğüDED ve kontrol farelerinde halka aydınlatıcısı tarafından değerlendirildi. Korneal yüzey pürüzsüz, yüksek yırtılma stabilitesi ile, göz yüzeyindeki aydınlatma halkasının görüntüsü yuvarlak ve mükemmeldir. Görüntünün bozulması korneanın düzgünlüğünün azalması ve dengesiz bir gözyaşı filmi olduğunu gösterir. Halkanın bozulma derecesi 0'dan 2'ye derecelendirildi. DED grubunda daha yüksek bir halka bozulma seviyesi kaydedildi ( Şekil 4 ), bu da daha az gözyaşı kararlılığı gösterdi.

Kuru göz en az iki klinik özelliği anormal olduğunda fareler kuru gözlü olarak tanımlanır. Bağışıklanmış 24 sıçanın 21 sıçanında 48. günde DED gelişti. Sonuç 70. günde değerlendirildiğinde tutarlıydı.

Akış sitometrisi analizi, normal sıçan göz bezindeki baskın T-hücresi alt grubunun efektör hafıza T hücreleri olduğunu göstermektedir ( Şekil 5 ). DED sıçanlarının gözbebeklerinde, CD3'ün ~ 70% 'i+ T hücreleri efektör bellek T hücreleridir, kontrol farelerinde ise bu sayı ~% 50'dir. DED sıçanlarının gözbebekleri, kontrol sıçanlara kıyasla efektör bellek T hücrelerini önemli ölçüde daha yüksektir ( Şekil 6 ).

figure-results-1
Şekil 1: Deneysel Tasarımın Şeması. LG: lakrimal bez; DED: kuru göz hastalığı; CFA: komple Freund adjuvanı; IFA: eksik Freund adjuvanı. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 2: Fenol Kırmızı İplik, gözyaşı hacmini ölçer. Fenol kırmızı ipliği, her iki sıçan gözünün proksimal köşesine 1 dakika boyunca konur ve sonra çıkarılır. MümessilliFenol kırmızısının, cetvelle birlikte hem kontrol hem de DED gruplarından görüntüleri. ImageJ fenol kırmızının ıslak kısmının uzunluğunu ölçmek için kullanıldı. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-3
Şekil 3: Floresein Boyaması ile Ölçülen Korneal Epitelyal Hasarın Temsil Edici Görüntüleri. Her fare korneası, 1 dakika% 0.2 floresein ile boyandı ve en az 1 mL salin ile yıkandı. Görüntüler, kobalt mavisi ile bir göz görüntüleme mikroskopu altında çekildi. İlk sütunda, kontrol kornealarının temsili görüntüleri gösterilir. İkinci sütunda, DED özellikli sıçanlardan alınan kornea boyanmasının temsili görüntüleri bulunur. Yeşil flüoresan lekeleri kornea epitelini gösterir Ben zarar verdim. Tüm görüntüler aynı renk skalasında üretildi. Floresan boyamanın miktarı, yeşil lekelerin alanına ve yoğunluğuna göre gerçekleştirildi. Ölçek çubuğu = 1 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-4
Şekil 4: Halka Işıklandırıcının Yansımasını Gösteren Temsilci Kornea Görüntüleri. Sıçan kornea / gözyaşı yumuşaklığı bir halka aydınlatıcısı ile ölçülmüştür. Yakalanan görüntülerde halkanın bozulma derecesi göreli gözyaşı kararlılığının bir ölçüsüdür. Sol sütunda, kontrol hayvanlarındaki temsili imgeler gösterilir ve sağ sütun kuru göz indüksiyonundan sonra temsili görüntüleri gösterir. Ölçek çubuğu = 1 mm.Ank "> Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-5
Şekil 5: Akış Sitometri Analizinden Elde Edilen Nokta Plotları. Göz küreleri dokularından izole edilen T hücreleri bir antikor paneli ile boyandı. CD45 + CD3 + 7AAD popülasyonunda, CD3 + 7-AAD - T hücreleri kapılandı. CD3 + 7-AAD - T hücreleri arasında naif, merkezi bellek ve efektör bellek T hücresi popülasyonları belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

figure-results-6
Şekil 6: Göz Odasındaki T-Hücre Alt Popülasyon Profili. CD3 + CD45RC+ Naif T hücreleri, CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L - efektör bellek T (T EM ) hücreleri ve CD3 + CD45RC - CD44 + CD62L + merkezi bellek T (T CM ) hücreleri CD3 + T hücrelerinin yüzdesi olarak sunulmuştur. Sonuçlar, 3 kontrol sıçanından ve 6 DED sıçandan elde edilmiştir. Benzer sonuçlar, izole lakrimal bezlerden T hücrelerinin analizinden elde edilmiştir (veriler gösterilmemiştir). İstatistiksel karşılaştırma için Eşleştirilmiş Öğrencinin t-testi kullanılmıştır. Hata çubukları SD'yi temsil eder. * P <0.05, ** p <0.01. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokolün kritik bir adımı, emülsiyonun homojenliğini sağlamaktır. İyi hazırlanmış emülsiyonlarda, antijenler yağ ile tamamen kaplanır, böylece enjekte edilen antijenin yavaş salınması sağlanır ve sürekli bağışıklık uyarımı yapılır. Bu protokolün bir diğer önemli özelliği de Lewis sıçanlarının kullanılmasıdır. Lewis sıçanları otoimmün hastalığın gelişimine diğer suşlardan daha duyarlıdır 27 .

Bu protokol, ya önceden lakrimal bez özütü ya da rekombinant Klk1b22 20 , 21'i kullanan önceden yayınlanmış iki protokolden değiştirildi. Mevcut protokolde ovalbümin artı lakrimal bez özütü antijen olarak kullanılır ve antijen spesifik bağışıklık hücreleri oküler yüzey ve lakrimal bezin içine çekilir ve böylece lokal doku hasarına neden olur. Kuru göz, yavaş yavaş gelişir ve ilk bağışıklamadan 48. gün sonra% 85'e ulaşır. Antijenik meydan okumaGöz ve lakrimal bez 48. günde göz kurumasını artırır ve 70. güne kadar kronikleşmesini sağlar.

Klk-indüklenen DED modelinde rekombinant Klk1b22 ile kıyaslandığında, mevcut modelde kullanılan lakrimal bez özütü ve ovalbümin daha ucuz ve daha kolay elde edilir. Lakrimal bez özütü, aynı zamanda, otoimmünitesi indirebilen, Klk haricindeki diğer proteinleri de ihtiva eder; bu nedenle, bu öz, teorik olarak DED'i indüklemedeki Klk yönteminden daha etkilidir. Ayrıca fareleri sadece gözyaşı bezi özütü ile bağışıklamayı denedik; Bu aşılanmış sıçanlar DED geliştirmiş olsalar da, göz bezi dokularında efektör bellek T hücrelerinin kontrollerden daha fazla belirgin bir artış göstermedi.

Bu tekniğin sınırlandırılması, modelin oluşturulması 70 gün sürmesidir. Efektör bellek T hücreleri normal sıçan gözündeki ana T hücre alt gruplarıdır. Bu modelde, otoimmün DED, göz küresinde CD3 + efektör bellek T hücrelerinde bir artışa neden olur. Bu uyuşturucu prefEtöre sahip hafızayı ertelemek için, Kv1.3 potasyum kanalının seçici inhibitörleri gibi T hücreleri, bu nedenle, otoimmün DED 28 üzerinde terapötik bir fayda sağlayabilir.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların çıkar çatışması yoktur. LT, Alcon, Allergan, Santen, Bausch ve Lomb, Eyelens ve Eyedetec'ten önceden fonlama ve / veya hediye aldı.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar, hayvanların taşınmasıyla ilgili yardımları için Bayan Tin Min Qi ve Dr. Veluchamy Amutha Barathi'ye ve ekibine teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma NHIC-I2D-1409007, SingHealth Vakfı SHF / FG586P / 2014 ve NMRC / CSA / 045/2012 tarafından desteklendi.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Reaktifler< / güçlü >
Proteaz inhibitörü kokteyliSigma-AldrichP2714-1BTL
Pierce BCA Protein Test KitiTermal Bilimsel23227
Mycobacterium tuberculosis H37Ra ve nbsp;Becton, Dickinson ve şirketi231141
Freund'un adjuvanıBecton, Dickinson ve şirket231131
ovalbüminSigma-AldrichA5503-10G
eksik Freund'un adjuvanı Sigma-AldrichF5506-6X10ML
boğmaca toksini Sigma-AldrichP7208-50UG
floresein sodyum çözeltisiBausch & Lomb UK LimitedNA
strong>NameCompanyKatalog NumarasıComments
Equipment
SonicatorSonics Vibra-Hücre
fenol kırmızı iplikTianjin Jingming Yeni Teknolojik gelişme Co., LTD.NA
Stereo mikroskop, halka ışıklı aydınlatıcı ve kameraCarl ZeissNA
Micro IV mikroskop Phoenix Araştırma LaboratuvarlarıNA
<

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. The definition and classification of dry eye disease: report of the Definition and Classification Subcommittee of the International Dry Eye WorkShop (2007). Ocul Surf. 5 (2), 75-92 (2007).
  2. Gayton, J. L. Etiology, prevalence, and treatment of dry eye disease. Clin Ophthalmol. 3, 405-412 (2009).
  3. Tong, L., Tan, J., Thumboo, J., Seow, G. The dry eye. Praxis (Bern 1994). 102 (13), 803-805 (2013).
  4. Messmer, E. M. The pathophysiology, diagnosis, and treatment of dry eye disease. Dtsch Arztebl Int. 112 (5), 71-81 (2015).
  5. Liu, K. C., Huynh, K., Grubbs, J., Davis, R. M. Autoimmunity in the pathogenesis and treatment of keratoconjunctivitis sicca. Curr Allergy Asthma Rep. 14 (1), 403(2014).
  6. Stevenson, W., Chauhan, S. K., Dana, R. Dry eye disease: an immune-mediated ocular surface disorder. Arch Ophthalmol. 130 (1), 90-100 (2012).
  7. Tong, L., Thumboo, J., Tan, Y. K., Wong, T. Y., Albani, S. The eye: a window of opportunity in rheumatoid arthritis. Nat Rev Rheumatol. 10 (9), 552-560 (2014).
  8. Carnahan, M. C., Goldstein, D. A. Ocular complications of topical, peri-ocular, and systemic corticosteroids. Curr Opin Ophthalmol. 11 (6), 478-483 (2000).
  9. Johannsdottir, S., Jansook, P., Stefansson, E., Loftsson, T. Development of a cyclodextrin-based aqueous cyclosporin A eye drop formulations. Int J Pharm. 493 (1-2), 86-95 (2015).
  10. Prabhasawat, P., Tesavibul, N., Karnchanachetanee, C., Kasemson, S. Efficacy of cyclosporine 0.05% eye drops in Stevens Johnson syndrome with chronic dry eye. J Ocul Pharmacol Ther. 29 (3), 372-377 (2013).
  11. Ishimaru, N., et al. Severe destructive autoimmune lesions with aging in murine Sjogren's syndrome through Fas-mediated apoptosis. Am J Pathol. 156 (5), 1557-1564 (2000).
  12. Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Holmdahl, R., Klareskog, L. Sialadenitis in the MRL-l mouse: morphological and immunohistochemical characterization of resident and infiltrating cells. Immunology. 60 (4), 611-616 (1987).
  13. Jonsson, R., Tarkowski, A., Backman, K., Klareskog, L. Immunohistochemical characterization of sialadenitis in NZB X NZW F1 mice. Clin Immunol Immunopathol. 42 (1), 93-101 (1987).
  14. Li, H., Dai, M., Zhuang, Y. A T cell intrinsic role of Id3 in a mouse model for primary Sjogren's syndrome. Immunity. 21 (4), 551-560 (2004).
  15. Shull, M. M., et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease. Nature. 359 (6397), 693-699 (1992).
  16. Green, J. E., Hinrichs, S. H., Vogel, J., Jay, G. Exocrinopathy resembling Sjogren's syndrome in HTLV-1 tax transgenic mice. Nature. 341 (6237), 72-74 (1989).
  17. Shen, L., et al. Development of autoimmunity in IL-14alpha-transgenic mice. J Immunol. 177 (8), 5676-5686 (2006).
  18. Hayashi, Y., Hirokawa, K. Immunopathology of experimental autoallergic sialadenitis in C3H/He mice. Clin Exp Immunol. 75 (3), 471-476 (1989).
  19. Liu, S. H., Zhou, D. H. Experimental autoimmune dacryoadenitis: purification and characterization of a lacrimal gland antigen. Invest Ophthalmol Vis Sci. 33 (6), 2029-2036 (1992).
  20. Liu, S. H., Prendergast, R. A., Silverstein, A. M. Experimental autoimmune dacryoadenitis. I. Lacrimal gland disease in the rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 28 (2), 270-275 (1987).
  21. Jiang, G., et al. A new model of experimental autoimmune keratoconjunctivitis sicca (KCS) induced in Lewis rat by the autoantigen Klk1b22. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (5), 2245-2254 (2009).
  22. Walker, J. M. The bicinchoninic acid (BCA) assay for protein quantitation. Methods Mol Biol. 32, 5-8 (1994).
  23. Lin, Z., et al. A mouse dry eye model induced by topical administration of benzalkonium chloride. Mol Vis. 17, 257-264 (2011).
  24. Cousins, S. W., Streilein, J. W. Flow cytometric detection of lymphocyte proliferation in eyes with immunogenic inflammation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 31 (10), 2111-2122 (1990).
  25. Yawata, N., et al. Dynamic change in natural killer cell type in the human ocular mucosa in situ as means of immune evasion by adenovirus infection. Mucosal Immunol. 9 (1), 159-170 (2016).
  26. Chen, Y., Chauhan, S. K., Lee, H. S., Saban, D. R., Dana, R. Chronic dry eye disease is principally mediated by effector memory Th17 cells. Mucosal Immunol. 7 (1), 38-45 (2014).
  27. Goldmuntz, E. A., et al. The origin of the autoimmune disease-resistant LER rat: an outcross between the buffalo and autoimmune disease-prone Lewis inbred rat strains. J Neuroimmunol. 44 (2), 215-219 (1993).
  28. Cahalan, M. D., Chandy, K. G. The functional network of ion channels in T lymphocytes. Immunol Rev. 231 (1), 59-87 (2009).

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Lakrimal Bez EkstraktAk Sitometrisi AnaliziSubk tan mm nizasyonSubkonjunktival EnjeksiyonKornea Hasar De erlendirmesiG zya Hacmi l mS an G z Modelimm n Profilleme

İlgili makaleler