Yöntem makalesi

Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

12.9K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55609

⸱

31 Mayıs 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Bioengineering, School of Engineering and Applied Science, University of Pennsylvania, 2Center for Brain Injury & Repair, Department of Neurosurgery, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, 3Center for Neurotrauma, Neurodegeneration & Restoration, Michael J. Crescenz Veterans Affairs Medical Center, 4School of Biomedical Engineering, Drexel University

* These authors contributed equally

Bu makalede

Özet

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Özet

Fonksiyonel düzelme nörojenez için inhibe edici ortam ve sınırlı kapasite nedeniyle merkezi sinir sistemi (MSS) içindeki yaralanma veya hastalığa bağlı dejenerasyon sonrasında nadiren oluşur. Hasar gören SSS'de nöronal ve aksonal yol kaybını aynı anda gidermek için bir strateji geliştiriyoruz. Bu el yazması, mikro-doku mühendislik yapmış sinir ağları (mikro-TENN'ler), implante edilebilen nöronlar ve santimetre uzayabilen yüzlerce mikron çapında önceden oluşturulmuş bir hidrojel silindirin hücre dışı matrisi (ECM) lümenine hizalı aksonal yollardan oluşan implantasyon yapım protokolünü sunmaktadır uzunluğunda. Nöronal agregalar üç boyutlu kaplamanın uçlarına sınırlanır ve aksonal projeksiyonlarla yayılır. Micro-TENN'ler CNS yeniden yapılandırması için bir strateji olarak benzersiz bir konumdadır ve beyin bağlantılı sitrik mimarisinin özelliklerini taklit eder ve potansiyel olarak ağ değişimi için araçlar sağlar. NeuRonal agregalar eksik veya hasar görmüş devreyi restore etmek ve / veya modüle etmek için yeni fonksiyonel röleler oluşturmak üzere konakçı doku ile sinapslanabilir. Bu yapılar ayrıca, hücre yenilemesi ve aksonal yol bulma için gelişim mekanizmalarını kullanabilen, rejenerasyon durumuna dayanan sinerjik yapısal ve çözünür ipuçları sağlayan pro-rejeneratif "canlı iskele" olarak da işlev görebilir. Mikro-TENN'ler sıvı hidrojel, uzunlamasına merkezli bir iğne içeren silindirik bir kalıba dökülüp imal edilir. Hidrojel jelleştikten sonra iğne boşaltılarak içi boş bir mikro sütun bırakılarak çıkarılır. Nöronal yapışma ve aksonal gelişim için uygun bir ortam sağlamak için lümene bir ECM çözeltisi eklenir. Ayrışmış nöronlar, mikro sütunun bir veya iki ucunda hassas tohumlama için mekanik olarak toplanır. Bu metodoloji, beyin nöroanatomisinin özelliklerini yineleyebilecek uzun projeksiyonlu aksonal yollar içeren kendi kendine yeten minyatür yapıları güvenilir bir şekilde üretir. Synaptic immEtiketsiz ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, mikro-TENN'lerin kapsamlı sinaptik dağılımına ve elektriksel aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, mikro-TENN'ler, beyin yolaklarının hedefe yönelik nöroşirürji rekonstrüksiyonu için umut verici bir stratejiyi temsil eder ve nörobiyolojik olayları in vitro olarak incelemek için biyo-fidelik modeller olarak da uygulanabilir.

Giriş

Travmatik beyin hasarı (TBI), omurilik yaralanması (SCI), inme, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının (MSS) ortak bir özelliği, aksonal yolların ve nöronal hücrenin kopukluğudur Kayıp 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Örneğin, iskemik bir inme tedavi edilmezse, aksonların dakikada 7 mil akson hızında kaybolduğu tahmin edilir. Her yıl yaklaşık 1.7 milyon insanın her yıl ABD'de deneyimlediği TBI vakasında, aksonal bozulmalar travmadan sonra yıllar sonra devam edebilir, çünkü ilk hasar uzun vadede nörodejeneratif bir duruma neden olur 4 . Bu zararlı etkileri ağırlaştıran MSS ciddi ölçüde sınırlı bir kapaa sahiptirRejenerasyon için şehir 1 , 7 , 8 , 9 . Yaralanmadan sonra, uzak hedeflere yöneltilen rehberlik eksikliği, nörit büyümesini engelleyen miyelin ile ilişkili inhibitörlerin varlığı ve reaktif astrositler 8 , 10 , 11 , 12 tarafından bir glial skar oluşumu ile karakterize bir inhibitör ortam gelişir. Glial skar, yenilenmeye karşı biyokimyasal ve fiziksel bir bariyer görevi görür ve kondroitin sülfat proteoglikanlar gibi akson büyümesini engelleyen moleküller bulunur 8 , 11 . Dahası, yetişkin MSS'de sinir kök hücreleri bulunsa da, yeni nöronların üretimi sınırlıdır çünkü tutarlı nevrojenez bulgusu yalnızca koku alma ampulünde, hipokampalde bulunurSubgranular bölge, periventriküler alan ve omuriliğin merkezi kanalı 13 , 14 . Bu engeller, yaralanma ya da hastalığın ardından kayıp nöronların ve beyaz cevher mimarisinin işlevsel olarak iyileştirilmesini önler ve bu durumların yaşamı değişen ve uzayan etkileriyle sonuçlanır.

Yetişkin MSS'de rejeneratif kapasitenin olmamasına rağmen, konakçı nöronlarına 15 , 16 , 17 , 18 yeterli çevresel ipuçları verildiğinde aksonal rejenerasyonun mümkün olduğu gösterilmiştir. Araştırmacılar, büyüme faktörlerini ( örn., Sinir büyüme faktörü, epidermal büyüme faktörü, glial bağımlı büyüme faktörü ve nörotrofik faktör-3) ve diğer rehberlik moleküllerini, plastisite ve akson rejenerasyonunu uyarmak için sunmaya ve bunları manipüle etmeye teşebbüs ettiler14 ,/ Sup> 18 , 19 . Bu çalışmalar yetişkin aksonların büyüme faktörlerine cevap verebildiklerini doğrulasa da, bu stratejiler, kan-beyin bariyerinin düşük permeabilitesi ve rejenerasyonu teşvik etmek için gereken spesifik uzaysal ve zamansal gradyanlar ile sınırlandırılmıştır 14,18,19. Diğer yaklaşımlar, CNS nöronlarında rejenerasyona bağlı transkripsiyon faktörlerinin hiperaktivasyonuna dayanmaktadır. Örneğin, Stat3 transkripsiyon faktörünün aşırı ekspresyonu optik sinir 20'de aksonal rejenerasyonu uyardı. Bununla birlikte, hem biyomolekülün verilmesi hem de transkripsiyon faktörlerinin aşırı ekspresyonu kayıp nöronal popülasyonların yerini alamaz. Hücre temelli stratejiler esas olarak merkezi sinir sistemi kök hücrelerine (CNS nöronları) yer değiştirme kapasitelerinden yararlanarak merkezi sinir sistemi kök hücrelerine (NSC) nakledilmeyi, trofik faktörleri serbest bırakmayı,Ve yaralanma sonrası meydana gelen nörojenez girişimlerini desteklemek 17 . Buna rağmen, transplante nöral hücrelerin hayatta kalma, konakçıya entegre olma ve fiziksel olarak yaralı bölgeye 6 , 14 , 17 , 21 ile sınırlı kalma gibi engellenmiş yetenekleri de içeren bu yaklaşımı engelleyen zorlayıcı zorluklar hala var. Buna ek olarak, hücre iletiminin tek başına hasar görmüş ya da kaybolmuş aksonal yolların sitrik mimarisini eski haline getirememesi mümkündür. Hücre ve ilaç / kimyasal dağıtım stratejilerinin karşılaştığı problemleri ele alan alternatif bir yaklaşım, bu yaklaşımları biyomalzemelerin 14 , 22 , 23 kullanımı ile birleştirmektir. Hidrojenler gibi biyomalzemeler, hücre dışına matrisin (ECM) biyokimyasal ve fiziksel özelliklerini öykünme yeteneğine sahiptir ve hücre dağıtımına yardımcı olur veD sakat bölgede tutulması ve kontrollü salınımlı büyüme faktörleri ve diğer biyoaktif moleküller sağlanması 22 . Bu biyo materyal temelli stratejilerin çekici özellikleri, iskeleleri lezyon alanına 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29 , 30 nakledildikten sonra in vivo aksonal rejenerasyon kanıtıyla sonuçlanmıştır. Bununla birlikte, hücresel olmayan biyomalzeme stratejileri kayıp nöronal popülasyonların yerini tutmaz; Nöronal, glial veya nöronal öncü hücreler için iletim araçları olarak kullanıldığında, biyomalzemeler uzun mesafeli aksonal ağları yeniden yapılandıramazlar. Hem aksonal patikada bozulma, hem de MSS hasarı ve hastalığına bağlı nöronal kaybı ele alan bir yaklaşım geliştirmenin zorluğu 31.

Araştırma grubumuz, bir agaroz hidrojel-ECM mikro sütununun bir veya her iki ucuyla sınırlandırılmış nöronal hücre cisimciklerinden oluşan bir "canlı iskelet" türü olan implante edilebilir mikro doku mühendislik sinir ağlarının (mikro-TENN'lerin) gelişimini daha önce rapor etmiştir , Bu üç boyutlu (3D) kaplamanın 1 , 10 , 31 , 32 iç kısmı boyunca uzanan hizalı aksonal yollarla birlikte. Bu teknik ile daha önceki yaklaşımlar arasındaki temel farklardan biri, mikro-TENN'lerin sitolojisinin in vitro olarak tamamen oluşturulduğu ve daha sonra 33 , 34 , 35 , 36 , 37 , 38 ,Sup class = "xref"> 39 , 40 , 41 . In vitro üretim, hücre iskeletinin ve oryantasyonunun, mekanik / fiziksel özelliklerin, biyokimyasal ipuçlarının ve eksojen faktörlerin kapsamlı mekansal ve zamansal kontrolünü sağlar ve implantasyon sonrası konakçıya bu iskeletlerin entegrasyonunu sağlar 41,42. Mikro-TEN'ler anatomik olarak esinlenmiştir, çünkü beyin nöroanatomisini taklit ederler, beyindeki farklı işlevsel bölgelere köprü yapanlara benzer aksonal yollar görüntüler ( Şekil 1A ) 1 . Bu nedenle, bu strateji lezyonlu bir bölgeye implantasyon sonrası kaybedilen beyaz cevher yollarını ve nöronları fiziksel olarak değiştirebilir. Bu teknik aynı zamanda radyal glial hücreler ve öncü aksonlar tarafından oluşturulan "doğal canlı iskele" nin hücre için yol bulma kılavuzları rolündeki gelişim mekanizmalarından esinlenmiştir.Subventriküler bölgeden göç ve aksonal büyüme, sırasıyla 43 . Bu mekanizmalar, akson aracılı aksonal büyümeyle ( Şekil 1C ) nöral hücre göçü ve aksonal rejenerasyon için canlı yollar sunabilen mikro-TENN'lerin hizalı aksonal yollarında tekrarlar. Dahası, bu strateji, mikro-TENN nöronları ve doğal devre arasındaki sinaptik bütünleşmeden yararlanarak işlevsel toparlanmaya katkıda bulunabilecek yeni röleler oluşturur ( Şekil 1B ) 43 . Sinaps oluşumu kapasitesi, bu yaklaşıma, MSS'yi modüle etme ve ağ geri bildirimine göre ev sahibi dokuya yanıt verme becerisi de verebilir. Örneğin canlı iskele içindeki optogenetik olarak aktif nöronlar, sinaptik etkileşimler yoluyla konakçı nöronlarını modüle etmek için uyarılabilir ( Şekil 1D ).

Buna ek olarak, biyomalzeme esaslı boru şekilli konstrüksiyonMikro-TENN'lerin kullanılması yapıların minyatür boyutları, minimal invaziv implantasyona izin verir ve kademeli olarak beyne entegrasyon için kısmen kenetlenmiş bir mikro ortam sağlarken hücre yapışması, büyüme, nevrit ekspansiyonu ve sinyalizasyon için uygun bir ortam sunar. Nitekim, son yayınlar sıçan beynine yerleştirildikten sonra mikro-TEN'lerin sinir yollarını taklit etme potansiyeli olduğunu göstermiştir. Stereotaksik mikroenjeksiyon sonrasında daha önce, mikro-TENN nöronal sağkalımı, aksonal bölge mimarisi bakımından ve konakçı kortekse in vivo 10 , 31 en az 1 ay boyunca nörit uzatmanın kanıtlarını bildirdik. Dahası, synapsin ile etiketleme, doğal doku 10,31 ile sinaptik entegrasyonun histolojik kanıtı sağladı. Genel olarak, mikro-TENN'ler, hasarın yeniden yapılandırılması ve modülasyonu için benzersiz şekilde uygun olabilirKaybedilmiş nöronları değiştirerek, ana devre ile sinaptik olarak bütünleşerek, kaybedilen aksonal sitolojiyi geri yükleyerek ve bazı durumlarda uygun yol bulma ipuçlarını içeren yenilenen aksonları sağlayarak MSS.

figure-introduction-1
Şekil 1: Mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağı (mikro-TEN) gelişimi arkasındaki ilkeler ve ilham. ( A ) Mikro-TENN'ler işlevsel olarak farklı bölgelerin tek yönlü (kırmızı, yeşil) veya iki yönlü (mavi) şekilde uzun, hizalanmış aksonal yollarla bağlandığı beynin bağlanmasını (mor) simüle eder. Örnek olarak, mikro-TENN'ler, kortikotalamik ve nigrostriatal yollarda veya entorinal korteksten hipokampusa (struzyna ve diğerleri, 2015'den adapte edilmiş) perforant yolda kaybedilen bağlantıları yeniden oluşturabilir 1 . ( B ) Tek yönlü bir diyagramL ve her lezyonun her iki ucu arasında fonksiyonel bir röle olarak görev yapmak üzere ana devre (mor) ile sinaptik olarak entegre olan çift yönlü mikro-TENN (sırasıyla kırmızı ve mavi). ( C ) Mikro-TENN'in etkileşimde bulunduğu bir hedefe doğru ana aksonların (mor) akson kolaylaştırılmış rejenerasyonu için bir kılavuz olarak hizmet eden, tek yönlü bir mikro-TENN'in (yeşil) aksonal yollarının şeması. ( D ) Neşredici veya inhibe edici nöronlar (alt) ile sinaptik entegrasyon yararlanarak, nöromodülatörler olarak optogenetik olarak aktif mikro-TENNS kullanımı kavramsal diyagram. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Mevcut el yazması, embriyonik olarak türetilen serebral kortikal nöronları kullanarak mikro-TEN'lerin imalinde kullanılan metodolojiyi ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Özellikle, mikro-TEN'ler diğer nöral hücreler türleriyle birlikte üretilebilir. Eski içinBaşarılı, mikro-TENN gelişiminin ilk raporlarında sırt kök gangliyon (DRG) nöronları 32 bulunmaktadır. Hidrojel mikro sütunları, sıvı ile şekillendirilmiş, lazerle kesilmiş bir silindirik kanal dizisine veya kılcal tüplere, her ikisi de hizalı akupunktur iğnelerini içeren sıvı agaroz eklenerek üretilebilir ( Şekil 2A ). İğne lümeni oluşturur ve mikro-kolonun iç çapını (ID) belirler; buna karşın kılcal tüp ID'si ve lazer kesme cihazındaki silindirlerin çapı yapıların dış çapını (OD) belirler. OD ve ID, sırasıyla, cihaz / kılcal tüpler ve akupunktur iğneleri için farklı çaplar seçerek istenen uygulamaya göre seçilebilir. Mikro kolonların uzunluğu da değiştirilebilir; Bugüne kadar, uzunluğu 20 mm'ye kadar olan mikro-TEN'lerin yapımını bildirdik ve aktif olarak daha uzun uzunluklarda ilerliyoruz. Agaroz jellerinden ve akupunkturdan sonra nEedles kaldırılır, genellikle tip I kollajen ve laminin içeren bir ECM çözeltisi yapıların lümenine eklenir ( Şekil 2C ). ECM çekirdeği, nöronal hücre yapışmasını ve aksonal gelişimini desteklemek için bir iskelet sağlar. Başlangıçta, primer sıçan kortikal nöronları, ayrılmış hücre süspansiyonları 10 , 31 , 32 kullanılarak mikro-kolonlara kaplandı. Bununla birlikte, bu yaklaşım, merkezi lümen saf hizalanmış aksonal yollardan oluşan, mikro kolonların uçlarıyla sınırlı nöronal hücre cisimcikleri olarak tanımlanan her durumda hedef cyto mimari yapı oluşturmadı. O günden bu yana, (Ungrin ve arkadaşlarının uyarladığı protokollere dayalı olarak) zorlanmış bir nöronal toplama yönteminin kullanılması, ideal yapı ( Şekil 2B ) 44 ile daha güvenilir ve tutarlı bir mikro-TENN imalatı sağlamıştır. Mevcut durumu tanımlamanın yanı sıraMetodoloji ile bu makalede zamanla aksonal yolların oluşumunu gösteren mikro-TENN'lerin temsili faz kontrastı ve konfokal görüntülerinin yanı sıra sonuçlandırılmış hedef hücre mimarisi de gösterilecektir. Bu el yazması, protokolün kayda değer yönleri ve kalan teknolojilerin ve gelecekteki mikro-TENN teknolojisinin yöneliminde de genişleyecektir.

figure-introduction-2
Şekil 2: Üç aşamalı mikro-TENN imalat sürecinin şematik diyagramı. ( A ) Agaroz hidrojelinin gelişimi: (i) Başlangıçta, küçük bir akupunktur iğnesi ( örn. , 180-350 μm çapında), ısmarlama lazerle kesilmiş kalıp veya kılcal borunun silindirik kanallarına yerleştirilir ( örn. , 380-700 μm çapında). Bir sonraki adımda, DPBS içindeki sıvı agaroz silindirik kanallara veya kılcal tüplere sokulur. (Ii) Agaroz jellerinden sonra, iğne çıkarılır veKalıp boşaltılmış agaroz mikro sütunları elde etmek için söküldü. (Iii) Bu yapılar daha sonra sterilize edilir ve DPBS'de saklanır. ( B ) Primer nöron kültürü ve agrega yöntemi: (i) Nöronal agregasyon, 12-çukurlu bir kültür plakasının oyuklarına uyan 3D baskılı kalıplardan dökülen piramidal mikro-kuyu dizilerinde gerçekleştirilir. (Ii) Mikro-TENN'ler, embriyonik-gün-18 sıçanların fetal beyinlerinden ayrılan birincil sıçan nöronlarını içerir. Tripsin-EDTA ve DNaz I ile doku ayrışmasının ardından, 1.0-2.0 x 106 hücre / mL yoğunluğa sahip bir hücre çözeltisi hazırlanır. (Iii) Bu çözeltiden 12 uL, piramidal mikro-kuyu dizisindeki her kuyuya aktarılır. Bu mikro kuyuları içeren plaka, hücre agregaları üretmek üzere santrifüje tabi tutulur. (Iv) Bunlar daha sonra mikro-kolonlara kaplamadan önce gece boyunca inkübe edilir. ( C ) ECM çekirdek imalatı ve hücre tohumlaması: (i) Hücre tohumlamadan önce, 1 mg / mL tip I kollajen ve 1 mg / mLLaminin, mikro-TENNlerin içine aktarılır ve polimerize olmasına izin verilir. (Ii) Tek yönlü veya çift yönlü mikro-TEN'lerin imal edilip edilmediklerine bağlı olarak, bir agrega sırasıyla mikro-kolonun bir veya her iki ucuna yerleştirilir. (Iii) Yapışma kabiliyetini arttırmak için inkübasyon süresinin ardından, mikro-TENN'ler eklenmiş embriyonik nöronal bazal ortam ile sızdırılmış Petri kaplarında kültürlenir. (Iv) Kültürde 3-5 gün sonra nihai mikro-TENN yapısı, akson kanallarının uzunluğunu uzatarak mikro kolonun uçlarında hücre agregalarını göstermelidir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri ve Michael J. Crescenz Gaziler İşleri Tıp Merkezi tarafından onaylandı ve NIH Kamu Sağlığı Hizmet Politikası'nda yer alan ilkelere uyuldu ve İnsani Bakım ve Laboratuar Kullanımı Hayvanlar (2015).

1. Agaroz Hidrojelinin Geliştirilmesi (mikro-TEN'lerin Uç Faz Komponenti)

  1. Agaroz çözeltisi hazırlama
    1. Biyogüvenlik kabininde, iki 10 cm'lik Petri tabağının her birine 20 mL Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) aktararak mikro sütun için rezervuar hazırlayın. Sıcak bir boncuk sterilizatörü ile ince forsepsleri ve mikroskopları steril edin.
    2. 3 g agaroz tartın ve biyogüvenlik kabini içindeki steril bir behere aktarın. % 3 ağırlık / hacim (w / v) nihai konsantrasyonu için 100 mL DPBS ekleyin. Temiz bir manyetik çubuk yerleştirin ve alüviyeyle kap sağlayınNum folyo.
    3. Sıcak plakalı / karıştırıcıda, beheri 100 ° C'de ısıtın ve agarozu tamamen çözmek için 120-200 rpm'de karıştırın (solüsyon bulutludan berrak hale gelecektir). Jelleşmeyi önlemek için ısıtıp karıştırın ve agarozun yakılmasını önlemek için ısıtma sıcaklığını gerektiği gibi değiştirin.
      NOT: Hem lazer kesme cihazı hem de kılcal borular ile yapılan üretim aşağıda sırasıyla alt bölüm 1.2 ve 1.3'de sunulmuştur. Her iki alt bölümde açıklanan adımları tamamladıktan sonra 1.4 alt bölümüne geçin. Hem mikro kolon üretim yöntemleri için, agaroz soğuyunca hızla katılaştığından, sıvı agarozu çabucak ekleyin. Aşağıdaki adımlardan herhangi birinde bir otoklav ile sterilize edildiğinde, cam eşyalara uygulanan standart koşulları kullanın.
  2. Lazerle kesilmiş bir cihaz kullanarak mikro-kolon hazırlığı
    NOT: Lazerle kesilen cihaz, ticari bir CO 2 lazer kesici kullanarak şeffaf akrilikten kesilir. FabriYapıların ve cihazların lazerle kesme katyonu bir dizi mühendislik ve araştırma uygulaması için iyi belgelenmiştir 45 , 46 , 47 . Bu kalıp ( Şekil 3 ), her biri 398 μm çapında ve 6,35 mm uzunluğa sahip beş silindirik kanal dizisinden oluşur. Bu silindirik diziler, iki parça halinde oluşur: bir alt yarı (uzunluk: 25.4 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 6.0 mm) ve bir üst yarım (uzunluk: 31.5 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 12.7 mm ), Sırasıyla Şekil 3A ve 3B'de gösterildiği gibi. İki yarım, Şekil 3C'de (uzunluk: 31.5 mm, genişlik: 6.35 mm, yükseklik: 12.7 mm) gözlenen ön ve arka kapaklarla birbirine kenetlenebilir, bu üst ve altta iki delik ile çakışan dört hizalama deliği içerir Parçalarıyla birleştirildiğinde ve vidalanmış haldeyken tüm parçaların birbirine sabitlenmesine yardımcı olur. Bu kapaklar da incMikro kolonların lümenini oluşturmak için akupunktur iğnelerinin sokulabileceği silindirik kanallara konsantrik beş delik.
    1. Şekil 3'te gösterilen cihazı alüminyum folyo ile kaplayarak ve otoklavla sterilize edin. Cihazı Şekil 3D'de gösterildiği gibi ön ve arka kapakları sadece alt yarım parçayla hizalayarak ve üç parçayı iki adet # 4-40 vida ve somun (diş çapı: 3.05 mm) ile alt hizalama deliklerine sabitleyerek monte edin.
    2. Cihazın anterior veya arka kapağı üzerindeki iğne deliklerine tam olarak bir akupunktur iğnesi (çap: 180 μm, uzunluk: 30 mm) ekleyin ( Şekil 3D ). Bir mikropipet ile, silindirik kanal yarılarının her birini tamamen doldurmak için alt yarım parçaya yeterli sıvı agaroz (beş kanal için ~ 1 mL) dökün.
    3. Cihazın üst yarısını derhal alt yarımın üzerine yerleştirin ve sıkıca yerine oturana kadar basıncı uygulayınSilindirik kanalları tamamlamak için yerleştirin (kapaklar ile üst parça arasındaki sürtünme, ikinci parçayı tutacaktır). Cihazın kanalları içindeki jelasyonuna izin vermek için agaroz ilavesinden sonra oda sıcaklığında ~ 5 dakika bekleyin.
    4. İğneyi cihazın kapaklarının her birinden elle çekin. Vidaları çıkarın ve iki kapağı ve alt yarım parçadan hidrojen mikro sütunları tutacak olan üst yarıyı manuel olarak ayırın.
    5. Mikro kolonları alt yarım parçadaki kanallardan nazikçe çıkarmak için ince forseps kullanın ve daha önceden hazırlanmış DPBS içeren Petri kabına yerleştirin (adım 1.1.1). Cihazı başka bir mikro sütun imalatı yuvarlak rutini tekrar kullanın. 1.4 alt bölümüne geçin.
  3. Kılcal tüpler kullanarak mikro sütun üretimi
    1. Cam kılcal boruları (çap: 398,78 μm, uzunluk: 32 mm) biyogüvenlik kabininin içine aktarın. El ile kırmakUzun boruları 2.0-2.5 cm'lik fragmanlara yerleştirin ve her bir parçaya bir akupunktur iğnesi (çap: 180 μm, uzunluk: 30 mm) tam olarak yerleştirin ( Şekil 2A ).
    2. Beherden boş bir Petri kabının yüzeyine 1 mL sıvı agaroz aktarın. Kılcal tüpü ve girilen iğneyi tutarak, kılcal eylemle doldurmak için borunun bir ucunu sıvı agaroz havuzu ile temas halinde bırakın. Kılcal yükselişi desteklemek için tüpü çalkalayın.
      NOT: Kılcal damarları, kılcal etki izin verdiği kadar yüksek sıvı agarozla doldurun; Daha sonra, bu mikro sütunlar istenen uzunluğa bağlı olarak daha küçük yapılar halinde kesilebilir. 1 mL'lik agaroz havuzu, sadece bir tüp için kullanılır, zira agaroz soğur ve hızla jeller, böylece daha fazla kılcal damar etkisi önlenir.
    3. Sıvı yükselmeye son verdiğinde, kılcal boruyu havuzdan çıkarın ve bir Petri kabının yüzeyine yatay olarak yerleştirin. Tüplerin içinde agaroz jelinin bırakması için 5 dakika bekleyin.
    4. Başparmak ve işaret parmağını tübün her iki yanına yerleştirin ve bastırın. Mikro sütunun kendisinin tüpün dışına kaymasını önlemek için başparmağını ve işaret parmağını kullanırken iğneyi hızlı bir şekilde çekmek için diğer eli kullanın. Mikro kolonu yavaşça DPBS içeren bir çanağa (adım 1.1.1) itmek için kılcal boruya 30 gauge iğne yerleştirin.
  4. Mikro sütun düzeltme ve sterilizasyon
    1. İnce forseps kullanarak bir mikro sütunu DPBS'den ince bir forseps kullanarak boş bir tabağa aktarın. Kurumayı önlemek için bir mikropipet ile mikro kolonun tepesine 10 uL DBPS ekleyin. Görsel rehberlik için ikinci bir çanağı bir stereoskopun altına yerleştirin.
      NOT: Protokol boyunca mikro sütun kurutulması veya dehidrasyonu, bu yapıların tipik, hidrasyon görünümünden görsel olarak ayırt edilebilen buruşuk bir yapının edinilmesine değinmektedir. Kurutulmuş mikro sütunlar Petri kaplarının yüzeyine sıkıca bağlanır ve cAncak, hidratlı yapılar, forseps ile manipüle edildikten sonra yüzey boyunca kayma eğilimi gösterirler. Tamamen kurutulmuş bir mikro sütunun bir faz kontrastlı görüntüsü Şekil 8A'da gösterilmiştir.
    2. İstenilen uzunluğa (burada, 2-5 mm) kısaltmak için mikro-kolonu bir mikroskopik pleytle kesin. Kesilmiş mikro sütunu, adım 1.1.1'de hazırlanan diğer DPBS Petri kabına ince forsepsle nakletin.
    3. Üretilen her bir mikro sütun için 1.4.1 ve 1.4.2 adımlarını tekrarlayın.
    4. DPBS içeren petri kaplarındaki mikro sütunları ultraviyole (UV) ışık altında 1 saat süreyle sterilize edin. Petri kaplarını ECM ilavesi ve hücre kaplamasından önce 4 ° C'de saklayın.

2. Birincil Nöron Kültürü ve Zorla Hücre Toplama Yöntemi

  1. Piramidal mikro-kuyu dizisinin hazırlanması
    NOT: Bu bölüm, silindirik bir taban (çap 2.2 cm, yükseklik 7.0 mm) veŞekil 3E'de gösterildiği gibi, üstte dokuz kare piramit (yan uzunluk: 4.0 mm, eğik açı: 60 °), 3 x 3 dizi halinde düzenlenmiştir. Ticari olarak bulunan 3B yazıcıları kullanan katkı maddesi üretim süreci iyi belgelenmiştir. Kalıbı tasarlamak için bilgisayar destekli tasarım yazılımı kullanılabilir. Elde edilen tasarım dosyası daha sonra dijital olarak bir 3B yazıcı için bir takım yolu haline dönüştürülebilir. Her yazıcının farklı özellikleri vardır ve bir 3B yazıcının kurulması ve çalıştırılması ile ilgili talimatlar buna göre değişir.
    1. 10 cm'lik bir Petri kabının kapağında ortalanmış 4 x 4'lük bir dizide (yan uzunluk: 4 cm, delik ayırma: 1 cm) 16 delik delmek için 3/32 "matkap ucu kullanın. 27 g polidimetilsiloksan (PDMS) ve 3 g sertleştirici ajan (1:10 oranında) tartmak için Petri kabının alt parçasını, ajanı eşit şekilde dağıtmak için bir mikro spatula ile karıştırın.
    2. Delinmiş kapaklı PDMS / kür ajanı örtün. Bir hortumun bir ucunu vakuma bağlayın(Ağız çapı: 10 cm, gövde uzunluğu: 3 cm, gövde çapı: 1,5 cm) yerleştirin.
    3. 1 mL pipet ampulün üst kısmında 3/32 "matkap ucu ile bir delik açın ve deliğe (sivri uc yukarı doğru gelecek şekilde) bir 1000 mcL mikropipet ucu yerleştirin ve ampulü ve ucu hortumun içine yerleştirin ve çekin Hortumu, huniyi huni sapına sızdırmaz hale getirene kadar yukarıya doğru itin.
    4. Huniyi delinmiş çanak kapağına yerleştirin ve hortumun sağlam ve sağlam bir destek ile sabitlenmesini sağlayın. Vakum valfini emmek için 5 dakika açın ve hava kabarcıklarını yüzeye getirin.
    5. Kalan hava kabarcıklarını patlatmak için valfi kapatın, huniyi çıkarın ve Petri kabını duman kapağının yüzeyine 3 kez vurarak vurun.
    6. Piramitleri yukarı bakacak şekilde, 12 kuyucuklu bir kültür plakasındaki kuyuların her birine piramidal-iyi 3D baskılı bir kalıp yerleştirin. Kalıpların her bir tarafına kadar PDMS / sertleştirici ajan dökünO plaka doldu. 12 oyuklu plakayı kapağı ile kapatın ve 60 ° C'de 1 saat süreyle fırında kurutun.
    7. Her bir PDMS mikro-kuyu dizisini ( Şekil 3F ) plakadan bir mikro-spatula ile dikkatlice çıkarın. Alüminyum folyo ile PDMS dizilerini örtün ve otoklavla sterilize edin. Biyogüvenlik kabininde, 12 delikli bir plakanın her kuyucuğuna bir mikro kuyucuk dizisi yerleştirin ( Şekil 2B ).
  2. Sıçan fetüslerinden kortikal nöron izolasyonu
    1. Bir biyogüvenlik kabini içinde dört ila altı adet 10 cm'lik Petri kaplarının her biri (her disseke doku için birer tane) ~ 20 mL Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) ekleyin. Bu yemekleri bir diseksiyon kapağına aktarın ve buz üzerinde bırakın. Mikroalpeller, makas ve forseps gibi diseksiyon aletlerini sıcak bir boncuk sterilizatörüyle sterilize edin.
    2. Pre-warm embriyonik nöron bazal orta +% 2 serum-ücretsiz destek + 0.4 mM L-glutamin ("kültür ortamı" olarak anılacaktır)R) ve% 0.25 tripsin + 1 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile 37 ° C'de inkübe edildi. Deoksiribonükleaz (DNase) I'i oda sıcaklığına yerleştirerek çözün. HBSS içinde 0.15 mg / mL DNAse I solüsyonunun 1.5 mL'si hazırlayın ve çözeltiyi buz üzerinde muhafaza edin.
    3. Kararsız hamile bir embriyonik-gün-18 sıçanı karbondioksit inhalasyonuyla euthanize edin ve kesilme ile ölüme teyit edin. Karkası steril bir diseksiyon kaputuna aktarın ve ventral yüz yukarı gelecek şekilde yerleştirin. Karnımı% 70 etanol ile iyice durulayın.
    4. Uterus açın ve fetüsleri (genellikle ~ 11) makasla amniyotik keselerden alın ve açıklanan şekilde soğuk HBSS içeren bir Petri kabına forseps ile aktarın. Stereoskopun altına soğutulmuş bir (-20 ° C) granit blok yerleştirin. Diseksiyon işlemi boyunca HBSS'nin düşük sıcaklığını korumak için Petri kabını bu soğuk bloğun yüzeyine yerleştirin.
    5. Çevredeki HBSS'yi yutarak yavruları durulayın ve bir sonraki temiz çanağa aktarın.Içeren HBSS. Stereoskop ve diseksiyon aletlerinin yardımı ile, fetüslerin başlarını, serebral hemisferlerini ve kortekslerini sırayla çıkarın ve her diseksiyon sonrasında yeni bir HBSS-dolu tabağa forseps ile her dokuyu aktarın 48 .
    6. Sadece pastil pipet ile korteksleri aspire edin ve dokuyu steril bir 15 mL santrifüj tüpüne yerleştirin. Diğer disseke dokuları atın. Serolojik bir pipet ile ~ 5 mL HBSS'yi sırayla ekleyip çıkararak kortekste üç kez durulayın. Tüpü kullanmadığınız zamanlarda buz üzerinde bırakın.
    7. Korteksleri bir Pasteur pipetiyle, önceden ısıtılmış tripsin-EDTA (5 mL tripsin-EDTA için 4-6 korteks) içeren 15 mL tüp içine aktarın. Boruyu elle çalkalayın ve 37 ° C'ye yerleştirin. Doku kapanmasını önlemek için tüp 3 dakikada bir ters çevirin.
    8. Dokuyu bir Pasteur pipetiyle çıkarıp temiz bir 15 mL santrifüje aktararak yaklaşık 10 dakika sonra tripsin maruziyetini durduruntüp. 0.15 mg / mL DNase I çözeltisini (1.5 mL) bir pipet yardımıyla tüpün içine ekleyin.
    9. Çözünürlük homojen görünene ve sıvı içinde kalan doku parçaları olmadan doku kümelerini elle parçalamak için bir Pasteur pipet kullanın ve daha sonra girdap (~ 30 s) vorteksleyin. Çözeltiyi tamamen homojenize etmek mümkün değilse, çözünmeyen parçaları bir Pasteur pipetinin ucuna çekerek çıkarın.
    10. Adım 2.2.9'da elde edilen homojen hücre çözeltisini 200 xg'de 3 dakika boyunca santrifüjleyin. Peletlenmiş hücreleri rahatsız etmemeye dikkat ederek süpernatanı bir Pasteur pipetiyle çıkarın. Serolojik bir pipetle 2 mL kültür ortamı ekleyin ve hücreleri tekrar süspanse etmek için girdap ekleyin.
    11. Hemocytometer kullanarak adım 2.2.10'da hazırlanan çözeltideki hücre sayısını sayın; Beklenen verim 3.0-5.0 x 106 hücre / kortikal yarı küre şeklindedir. 1.0-2.0 x 10 6 hücre / mL yoğunluğunda, kültür ortamında 1 mL veya daha fazla hücre süspansiyonu hazırlayın.
  3. Nöronal hücre agregatlarının oluşumu
    1. Bir mikropipet ile, PDMS dizisinin her mikro-kuyusuna (adım 2.1.7'deki plakaya yerleştirilen), 12 uL 1.0-2.0 x 10 6 / mL hücre süspansiyonu ekleyin.
      NOT: Yüksek konsantrasyonlar daha büyük agrega üretebileceğinden, hücre konsantrasyonu, mikro-kolon ID'ye ve arzu edilen hücre agrega boyutuna bağlı olarak ayarlanabilir.
    2. Mikro kuyuların ( Şekil 2B ) altındaki hücrelerin birikmesini zorlamak için plakayı 200 xg'de 5 dakika santrifüjleyin. Agregalı hücreleri rahatsız etmemeye özen göstererek tüm tohumlanmış mikro-kuyucuları kaplayacak şekilde her PDMS dizisinin üstüne ~ 2 mL kültür ortamı ekleyin.
    3. Eğer hücreler bir viral vektör ile transforme edilmezlerse, plakayı 12-24 saat boyunca 37 ° C'de ve% 5 C02'de inkübe edin ve daha sonra 3. bölüme geçin. Agregalar transdüser hale getirilirse inkübasyonu atlayın ve Bölüm 2.4'e geçin .
  4. TranKalsiyum sinyalini gözlemlemek için bir viral vektörle sindirim
    Not: Bu adımlar, genetik olarak kodlanmış bir kalsiyum göstergesi (GECI) içeren viral bir vektörle nöronları dönüştürmek için yapılır. Bu makalede gösterilen sonuçlar, yeşil flüoresan proteini (GFP), kalmodulin (CaM) ve M13 peptidinden oluşan hızlı kinetik olan bir GECI olan GCaMP6f ile piyasada bulunan bir adeno-ilişkili virüs (AAV) (serotip 1) Insan Synapsin I destekleyicisi tarafından yönlendirilir. Viral vektör çözeltisi, stok çözeltisinin konsantrasyonuna bağlı olarak, dönüştürmeden önce steril DPBS'de seyreltme gerektirebilir. Bir dizi vektör konsantrasyonu için zamanla hücre sağlığı / morfolojisi ve GCaMP6f sinyal gücü gözlemlenmelidir. Bu optimizasyon prosedürü, kendi hücre kültürleri için uygun titreyi belirlemek için her araştırıcı tarafından gerçekleştirilmelidir. Tipik GCaMP6f ekspresyon zamanı, st içinde yapılan inkübasyon sırasında ortaya çıkan transdüksiyonun ardından 7-8 günlüktirEp 2.4.2.
    1. Bir mikropipet ile agregaları kaplayan kültür ortamına viral vektör çözümünün hacmini (agrega başına ~ 3.0 x 10 9 genomik kopyanın nihai bir konsantrasyonu için) ekleyin. Vektör çözeltisinin kültür ortamı boyunca homojen bir şekilde dağıtıldığından emin olmak için yavaş yavaş pipetle aşağı yukarı pipetleyin.
    2. Plakayı tohumlanmış piramidal mikro-kuyucuklar ile 37 ° C'de ve% 5 C02'de 24 saat boyunca GCaMP6f'nin viral transdüksiyonuna izin vermek için kuluçkalayın.

3. Mikro-TEN'lerin Hücresel Bileşeninin Geliştirilmesi

  1. ECM temel imalat
    1. Agrega inkübasyondan sonra, ECM solüsyonunu hazırlamak için mikrosantrifüj tüpünde kültür ortamına (her biri 1 mg / mL konsantrasyonda) tip I kollajen ve laminin ekleyin. 3.1.2-3.1.4 adımlarını oda sıcaklığında uygulayın, ancak erken jelasyon önlemek için kullanılmadığında tüp ECM ile buzda muhafaza edilmelidir.
      NOT: Tipik harcama, her mikro sütun için 4 μL ECM çözeltisidir (uzunluk: 5 mm, ID: 180 μm).
    2. ECM çözeltisinin pH'sını, ilk pH'ı doğrulamak için ECM'ye 1 μL 1 N sodyum hidroksit (NaOH) ve / veya 1 N hidroklorik asit (HC1) ilave ederek 1-2 μL litmus kağıda aktararak gerektiği gibi ayarlayın, Ve pH değeri 7.2-7.4 olana kadar tekrarlayın. Hava kabarcığı oluşumunu önlerken, ECM solüsyonunun homojenize edilmesini sağlayın ve pipetleme yapın.
    3. Mikro kolonları sterilize edilmiş forsepsle adımlar 1.4.3'deki bulaşıklardan boş 35- veya 60-mm Petri kaplarına aktarın. Dehidrasyonu önlemek için her seferinde 4-5 mikro sütun üzerinde çalışın. 1000-μL'lik bir uca bağlı bir 10 μL'lik ucu bir mikropipe ekleyin. Stereoskopu görsel kılavuz olarak kullanmak için ucu, mikro sütunların bir ucuna yerleştirin ve lümenden artık DPBS ve hava kabarcığı çıkarmak için emme yapın.
    4. Bir mikropipette 4-5 μL ECM'yi hızla çizin. Bir gözlem altında gözlemlemeMikroskopun ucunu mikro kolonların uçlarından birine yerleştirin ve lümeni dolduracak kadar ECM'yi boşaltın. ECM yoluyla aksonal gelişimini inhibe edebileceğinden, lümende hava kabarcığı olmamasını onaylayın. Hava kabarcıkları varsa, adım 3.1.3'te açıklandığı gibi ECM'yi çıkarın ve ECM'yi tekrar ekleyin.
    5. Dehidrasyonu önlemek için, her mikro sütunda yaklaşık 2 μL ECM ekleyin. 37 ° C'de ve% 5 C02'de Petri kabındaki hidrojel / ECM mikro sütunlarını 25 dakika inkübe edin. İnkübasyondan hemen sonra hücre ekimine devam edin.
      NOT: Adım 3.1.5'deki kuluçka süresi, mikro kolonların içindeki kollajen ve laminin polimerizasyonu için zaman tanıyacak şekilde tasarlanmıştır.
  2. Mikro sütunlarda nöronal hücre tohumlaması
    NOT: Dönüştürülmüş agregaların kültür ortamını değiştirmek için plakayı eğin, kuyunun duvarı üzerinde toplanan ortamı çıkarmak için bir mikropipet kullanın ve sonra yavaş yavaş ~ 1 mL ekleyin.(Piramidal mikro kuyularda agrega rahatsızlığından kaçınmak için). Bu orta değişikliği ikinci kez tekrarlayın.
    1. Adım 3.1.5'te inkübasyon süresinin ardından yaklaşık 10-20 μL kültür ortamı, mikro sütunları tutan Petri kaplarındaki iki boş alana aktarın. Agregaları, yapıları içeren Petri kabına tek tek aktarmak ve hücre sağlığını korumak için kültür ortamının küçük havuzlarından birine forsepsle taşımak için bir mikropipet kullanın.
    2. Bir stereoskop altında gözlem yaparken, çift yönlü mikro-TEN'ler için mikro sütunların her iki ucuna bir arada veya bir ucunda forseps kullanarak tek yönlü bir mimari için (arzu edildiği gibi) bir agrega yerleştirin. Mikroskoplardaki agregatların stereoskop kullanılarak yerleştirilmesini onaylayın. Dehidrasyonu önlemek ve toplam sağlığı korumak için, tohumlanmış mikro sütunları kültür ortamının diğer küçük havuzuna taşımak için forseps kullanın.
    3. 37 ° C'de ve% 5 C02'de 45 dakika inkübe edin.Toplulukları ECM'ye uyacak şekilde genişletin. Agregaların stereoskop kullanılarak mikro sütunların ucunda kaldıklarını doğrulayın; Hücre agregalarını tekrar sunun ve gerektiğinde kuluçka adımını tekrarlayın.
    4. Serolojik bir pipet kullanarak kültür ortamı (sırasıyla 35 veya 60 mm'lik bir Petri kabı için 3 veya 6 mL) ile mikro-TEN'leri içeren Petri kaplarını dikkatlice selleyin. Uzun vadeli kültür için 37 ° C'de ve% 5 CO 2'de inkübatöre yerleştirin.
    5. Kültür ortamı ile her 2 günde bir yarım medya değişiklikleri yapın. Eski medyanın yarısını bir pipetle dikkatli bir şekilde çıkarın ve mikro-TEN'lerin emilmesinden kaçınmak için stereoskopu görsel kılavuz olarak kullanın. Pipetle yavaşça taze, önceden ısıtılmış ortam ilave ederek değiştirin.
    6. PDMS mikro-kuyulu dizileri yeniden kullanmak için, kültür ortamı çıkarın, 30 dakika boyunca deiyonize su dizileri kaynatın ve agregat oluşumu ve kültür başka bir tur için bir otoklav sterilize edin.
      NOT: İstenilen zaman noktalarındaMikro-TEN'lerin sitolojisi, faz-kontrast mikroskobu kullanılarak doğrulanabilir. Burada, faz-kontrast görüntüleri yakalamak için 5-8 ms ve 10X (0.64 um / piksel) ve 20X (0.32 um / piksel) hedeflerden bir maruz kalma süresi kullanıldı. Viral olarak iletilen mikro-TENN'lerdeki kalsiyum konsantrasyonu değişiklikleri ile ilişkili floresans, 50 ms'lik maruz kalma süresi, 10X'lik bir objektif (0.64 μm / piksel) ve ~ 480 bant geçiren filtrelerle katı hal ışığı ile yüksek hızlı bir floresan mikroskop kullanılarak yakalandı Nm ve ~ 510 nm, uyarma ve emisyon için, sırasıyla, GCaMP6f floresan sinyalini görselleştirmek için kullanıldı.

4. İn Vitro Çalışmalarda İmmünositokimya

Not: Burada gösterilen görüntüler için aşağıdaki birincil antikorlar kullanılmıştır: aksonların etiketlenmesi için pre-fare anti-Tuj-1 / beta-III tübulin (1: 500) ve tavşan anti-synapsin-1 (1: 500) -Sinaptik boutons, sırasıyla. İkincil antikorlar eşek anti-mouse 568 (1: 500) ve eşek anti-tavşan 488 (1: 500). Hazırlanan primer ve sekonder antikor solüsyonlarının gerekli hacimleri, ayrıca formaldehit hacmi, at serumu ve deterjan solüsyonları, yapıları tamamen kaplaması için gereken hacme bağlıdır. Bu hacimler, her bir mikro sütunun çevresini sınırlamak için bir hidrofobik bariyer kalemi kullanarak minimize edilebilir.

DİKKAT: Bu bölüm formaldehit ve Hoechst kullanmaktadır. Formaldehit, kanserojen olduğu bilinen toksik bir bileşiktir ve Hoechst bilinen bir mutajendir. Bu nedenle, bu bileşikler uygun bir atık kabına atılmalıdır. Laboratuar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve eldivenler gibi uygun kişisel koruma ekipmanlarını kullanırken bunları daima bir kimyasal duman bacasında tutun.

  1. Kimyasal duman davlumbazının içine 1x fosfat tamponlu salin (PBS) içinde% 4.0 hacim / hacim (v / v) formaldehit solüsyonu hazırlayın.
  2. Petri kaplarının içerdiği kültür ortamını çıkarınMikro-TEN'leri bir mikropipet ile incelemek. Mikro-TENN'leri tamamen örtmek için, yemeklere yeterli miktarda formaldehit solüsyonu ekleyin. Mikro-sütunlar içindeki hücreleri sabitlemek için 18-24 ° C'de 35 dakika süreyle formaldehit solüsyonundaki mikro-TENN'leri bekletin.
  3. Bir pipetle Petri kaplarından% 4.0 formaldehit solüsyonu alın ve uygun tehlikeli madde atma kurallarına uymadan atın.
  4. Sabit mikro-TENN'leri tamamen kaplayacak ve ardından bir pipetle PBS'yi çıkarmak için yeterli PBS ekleyerek iki hızlı durulama gerçekleştirin. 10 dakika boyunca PBS yapıları ıslatarak üçüncü bir uzun durulama yapın.
    DİKKAT: Durulamak için kullanılan PBS'yi muhtemelen formaldehit izleri içeren olarak atın.
  5. PBS içinde% 4 v / v at serumu içinde iyonik olmayan bir deterjanın% 0.3 v / v çözeltisi hazırlayın. Sabit mikro-TENN'leri içeren Petri kaplarından PBS'yi çıkarın ve yapıları örtmek için yeterli miktarda% 0.3 deterjan çözeltisi ilave edin. 18-24'te 60 dk bekleyin ve #176 C hücreleri permeabilize etmek.
  6. Deterjan solüsyonunu bir pipetle çıkarın. PBS'yi ekleyip sonradan çıkartarak iki hızlı durulama yapın. Ardından, yapıları her durulama işlemi sırasında 5 dakika boyunca PBS'ye batırarak üç kez daha durulama gerçekleştirin.
  7. Birincil antikorları% 4 at serumu içinde seyreltin. PBS'yi, sabit ve permeabilize edilmiş mikro-TEN'leri içeren Petri kaplarından çıkarın. Mikro kolonlara, bunları tamamen örtecek kadar birincil antikor çözeltisi ekleyin. Buharlaşmayı önlemek için parafilm ile Petri yemeklerini kapatın ve gece boyunca (12-16 saat) 4 ° C'de inkübe edin.
  8. Birinci antikor çözeltisini tabaklardan çıkarın ve adım 4.6'da açıklandığı gibi durulayın. Karanlıkta,% 4.0 at serumu içinde ikincil antikor çözeltisi hazırlayın. Yapıları tamamen kaplayacak kadar yalın ikincil antikor çözeltisi ekleyin, bulguları alüminyum folyo ile örtün ve 18-24 ° C'de 2 saat inkübe edin.
  9. Çekirdeği leke yapmak için Hoechst çözeltisini (1: 10,000) PBS'de hazırlayın.
  10. İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve 18 saat-24 ° C'de 10 dakika süreyle Hoechst çözeltisindeki mikro-TENNS'i inkübe edin. 5-10 dakika boyunca her biri PBS ile beş kez durulama yapın. Petri kabını lekelenmiş mikro-TENN'leri kaplayacak şekilde PBS ile yıkayın, çanağı alüminyum folyoya sarın ve görüntüleme tamamlanıncaya kadar 4 ° C'de saklayın.
    NOT: İmmün işaretli mikro-TENN'ler için görüntüler 2048 (~ 8 s / çerçeve) çözünürlük, 10X hedef (0.64 μm / piksel), 487 nm uyarılma ve ~ 525 nm emisyon dalga boyları ile lazer konfokal mikroskop ile çekilmiştir Kırmızı fluoresans için 561 nm uyarım ve ~ 595 nm emisyon dalga boyları ve z-yığınları için ~ 60 dilimlik ~ 3.22 um / dilim.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Mikro-TENN'ler, sitografi ve aksonal gelişimlerini değerlendirmek için faz-kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi ( Şekil 4 ). Tek yönlü, 2 mm uzunluğunda mikro-TENN'lerde, nöronal agregalar mikro kolonun bir ucuyla sınırlandırılmış ve iç çekirdeğin içinden aksonlar demeti öngörülmüştür. Aksonlar, kolonun tüm uzunluğunu in vitro (DIV) 5 gün boyunca uzattı ( Şekil 4A ). Aksonlar, tüm mikro kolonu 3 DIV ile kapladığı için, iki yönlü 2 mm...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

CNS yaralanması ve hastalığı tipik olarak, birlikte görülen nöronal dejenerasyon ile veya olmadan, beyin connectome'yu içeren uzun mesafeli aksonal yolların kaybedilmesi veya işlevinde aksama ile sonuçlanır. Bu nörojenez ve yenilenmeyi teşvik etmek için CNS'in sınırlı kapasitesi ile karışıktır. Bireysel veya kombinatoryal yaklaşımlar olarak büyüme faktörü, hücre ve biyomalzeme sunumu gibi onarım stratejilerinin peşinde olmasına rağmen, bu teknikler aynı anda hem nöronal hücrelerin dejenerasyonunu hem de aksonal ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Mali destek, Michael J. Fox Vakfı (Terapötik Boru Hattı Programı # 9998 (Cullen)), Ulusal Sağlık Enstitüleri U01-NS094340 (Cullen), T32-NS043126 (Harris) ve F31-NS090746 (Katiyar)) tarafından sağlandı. (Cullen), Penn Sciences Neuroscience Merkezi Pilot Ödülü (Cullen), Ulusal Bilim Vakfı (Yüksek Lisans Araştırma Bursu DGE-1321851 (Struzyna ve Adewole)), Gazi İşleri Departmanı (RR & D Merit İncelemesi # B1097-I (Cullen)), Amerikan Derneği Nörolojik Cerrahlar Kongresi ve Nörolojik Cerrahlar Kongresi (2015-2016 Nörotravma ve Kritik Bakımda Kod Adam Bursu (Petrov)) ve ABD Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (# W81XWH-13-207004 (Cullen) ve W81XWH-15-1- 0466 (Cullen)).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Lazer kesiciÜniversal Lazer SistemleriPLS4.75Lazer kesim mikro kanal kalıbını imal etmek için kullanılır.
Lazer kesim mikro kolon imalat cihazıIsmarlama--------------İlgileniyorsanız araştırma grubumuzla iletişime geçin. El yazmasında sağlanan boyutlar ve planlar.
Vidalar----------------------------#4-40, 3,05 mm diş çapı
Somunlar----------------------------#4-40, 3,05 mm diş çapı ile
Akupunktur iğnesi (180 & mikro; m çapı)Lhasa Medicalsj.16X40Çap, mikro sütun lümeni için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Petri kabıFisher08772B
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)Invitrogen14200075
Polistiren tek kullanımlık serolojik pipetFisher13-678-11D
AgarozSigmaA9539-50G
Kılcal tüp (398 & mikro; m çap)Fisher21170DÇap, mikro kolon kabuğu için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Sıcak plakaFisherSP88857200
Manyetik çubukFisher1451352
MikropipetSigmaZ683884-1EA
25 mm ölçer iğneFisher14-826-49
Mikro NeşterRoboz CerrahiRS-6270
MakasGüzel Bilim Araçları14081-09
ForsepsDünyası Hassas Aletler501985
Sıcak boncuk sterilizatörüSigmaZ378550-1EA
StereoskopNikonSMZ800NTüm diseksiyon adımları ve mikro-TENN üretimi için kullanılır.
Sıçan kuyruğu tip I kollajenCorning3542364 >m'de koruyun; C ve sadece gerektiğinde çıkarın.  Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Mikrosantrifüj tüpüFisher02-681-256
Fare lamininCorning3542324 >m'de koruyun; C ve sadece gerektiğinde çıkarın.  Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Nörobazal ortamInvitrogen21103049Doğum öncesi ve embriyonik nöronal hücrelerin kültürü için bazal ortam. 4º'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sodyum hidroksit (NaOH)FisherSS2661
Hidroklorik asit (HCl)FisherSA48-1
Turnusol kağıdıFisher09-876-18
Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)Invitrojen141701124 ºC'de saklayın.
% 0.25 Tripsin-EDTAInvitrogen25200056-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sığır pankreatik deoksiribonükleaz (DNaz) ISigma10104159001-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
B-27 TakviyesiInvitrojen12587010Hipokampal ve kortikal nöronların kültürü için Nörobazal ortama eklenen takviye. -20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
L-glutamin Invitrogen35050061-20 º'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sprague Dawley embriyonik gün 18 sıçanlarCharles RiverStrain 001
Pasteur pipetFisher22-042816
15 mL santrifüj tüpüEMESCO1194-352099
VortexFisher02-215-414
SantrifüjFisher05-413-115
HemositometreFisher02-671-6
Objet30 3D YazıcıStratasys --------------Piramidal mikro kuyu kalıplarını imal etmek için kullanılır.
3D baskılı piramidal kuyu kalıbıIsmarlama--------------İlgileniyorsanız araştırma grubumuzla iletişime geçin. El yazmasında sağlanan boyutlar ve planlar.
Polidimetilsiloksan (PDMS) ve sertleştiriciFisherNC9285739Elastomer ve kürleme maddesi içeren kit olarak gelir. Kimyasal davlumbazın içinde kullanın.
HuniFisher10-348C
1 ml pipet ampulüSigmaZ509035
Mikro spatulaFisherS50821
12 oyuklu kültür plakasıEMESCO1194-353043
FırınFisher11-475-154
KuluçkaMakinası Fisher13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40UPenn Vector Core36373-80ºC'de saklayın. GCaMP6f kalsiyum indikatörü ile ticari olarak temin edilebilen adeno-ilişkili virüs (AAV).
Formaldehit %40FisherF77P-4Formaldehit, kanserojen olduğu bilinen toksik bir bileşiktir ve ayrı bir kapta atılmalıdır.
Triton X-100SigmaT8787Hücre zarlarına nüfuz etmek için kullanılan iyonik olmayan yüzey aktif madde.
At serumuGibco16050-122
Fare anti-Tuj-1 / beta-III tübülin birincil antikoruSigmaT8578-200UL-20ºC'de saklayın.
Tavşan anti-sinapsin 1 primer antikorSinaptik Sistemler106-001-20ºC'de saklayın.
Eşek anti-fare 568 ikincil antikorInvitrogenA100374 & ordm; C'de saklayın.
Eşek anti-tavşan 488 ikincil antikorInvitrogenA212064ºC'de saklayın.
Hoechst 33342, TrihidroklorürInvitrogenH35704ºC.  Hoechst, kanserojen olarak tedavi edilmesi gereken bilinen bir mutajendir. Bu nedenle ayrı bir kapta atılmalıdır.
A1RSI Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop Nikon--------------İmmün etiketli yapıların konfokal rekonstrüksiyonlarını almak için kullanılır.
Eclipse Ti-S Mikroskobu Nikon--------------Faz kontrastlı görüntülerin çekimi için kullanılır. Nikon Elements Basic Research yazılımı (4.10.01) ile arabirim içeren bir QiClick kamera kullanılarak dijital görüntü elde etme ile.
Yüksek Hızlı Floresan MikroskobuNikon--------------Nikon Eclipse Ti mikroskobu, kalsiyum görüntüleme için bir ANDOR Neo/Zyla kamera ile eşleştirilmiştir.
NIS Elements AR 4.50.00 YazılımıNikon Instruments--------------Yüksek hızlı floresan mikroskobu ile alınan kayıtlardan kalsiyum geçişlerini tanımlamak için kullanılır.
ile

Kaynaklar

  1. Struzyna, L. A., Harris, J. P., Katiyar, K. S., Chen, H. I., Cullen, D. K. Restoring nervous system structure and function using tissue engineered living scaffolds. Neural Regen. Res. 10 (5), 679-685 (2015).
  2. Tallantyre, E. C., Bø, L., et al. Clinico-pathological evidence that axonal loss underlies disability in progressive multiple sclerosis. Mult. Scler. 16 (4), 406-411 (2010).
  3. Cheng, H. C., Ulane, C. M., Burke, R. E. Clinical Progression in Parkinson Disease and the Neurobiology of Axons. Ann. Neurol. 67 (6), 715-725 (2010).
  4. Johnson, V. E., Stewart, W., Smith, D. H. Axonal pathology in traumatic brain injury. Exp. Neurol. 246, 35-43 (2013).
  5. Hinman, J. D. The back and forth of axonal injury and repair after stroke. Curr. Opin. Neurol. 27 (6), 615-623 (2014).
  6. Li, X., Katsanevakis, E., Liu, X., Zhang, N., Wen, X. Engineering neural stem cell fates with hydrogel design for central nervous system regeneration. Prog. Polym. Sci. 37 (8), 1105-1129 (2012).
  7. Horner, P. J., Gage, F. H. Regenerating the damaged central nervous system. Nature. 407 (6807), 963-970 (2000).
  8. Yiu, G., He, Z. Glial inhibition of CNS axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 7 (8), 617-627 (2006).
  9. Montani, L., Petrinovic, M. M. Targeting Axonal Regeneration: The Growth Cone Takes the Lead. J. Neurosci. 34 (13), 4443-4444 (2014).
  10. Struzyna, L. A., Wolf, J. A., et al. Rebuilding Brain Circuitry with Living Micro-Tissue Engineered Neural Networks. Tissue Eng. Part A. 21 (21-22), 2744-2756 (2015).
  11. Huebner, E. a, Strittmatter, S. M. Axon Regeneration in the Peripheral and Central Nervous Systems. Results Probl. Cell Differ. 48, 339-351 (2009).
  12. Benowitz, L. I., Yin, Y. Combinatorial Treatments for Promoting Axon Regeneration in the CNS: Strategies for Overcoming Inhibitory Signals and Activating Neurons' Intrinsic Growth State. Dev. Neurobiol. 67 (9), 1148-1165 (2007).
  13. Lie, D. C., Song, H., Colamarino, S. A., Ming, G., Gage, F. H. Neurogenesis in the Adult Brain: New Strategies for Central Nervous System Diseases. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44, 399-421 (2004).
  14. Gao, Y., Yang, Z., Li, X. Regeneration strategies after the adult mammalian central nervous system injury-biomaterials. Regen. Biomater. 3 (2), 115-122 (2016).
  15. Benfey, M., Aguayo, A. J. Extensive elongation of axons from rat brain into peripheral nerve grafts. Nature. 296 (11), 150-152 (1982).
  16. David, S., Aguayo, A. J. Axonal Elongation into Peripheral Nervous System "Bridges" after Central Nervous System Injury in Adult Rats. Science. 214 (4523), 931-933 (1981).
  17. Shoichet, M. S., Tate, C. C., Baumann, M. D., LaPlaca, M. C. Strategies for Regeneration and Repair in the Injured Central Nervous System. Indwelling Neural Implant. Strateg. Contend. with Vivo Environ. , at http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK3941/ (2008).
  18. Lu, P., Tuszynski, M. H. Growth factors and combinatorial therapies for CNS regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 313-320 (2008).
  19. Curinga, G., Smith, G. M. Molecular/genetic manipulation of extrinsic axon guidance factors for CNS repair and regeneration. Exp. Neurol. 209 (2), 333-342 (2008).
  20. Mehta, S. T., Luo, X., Park, K. K., Bixby, J. L., Lemmon, V. P. Hyperactivated Stat3 boosts axon regeneration in the CNS. Exp. Neurol. 280, 115-120 (2016).
  21. Elliott Donaghue, I., Tam, R., Sefton, M. V., Shoichet, M. S. Cell and biomolecule delivery for tissue repair and regeneration in the central nervous system. J. Control. Release. 190, 219-227 (2014).
  22. Tam, R. Y., Fuehrmann, T., Mitrousis, N., Shoichet, M. S. Regenerative therapies for central nervous system diseases: a biomaterials approach. Neuropsychopharmacology. 39 (1), 169-188 (2014).
  23. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H., Pfister, B. J. Neural Tissue Engineering for Neuroregeneration and Biohybridized Interface Microsystems In vivo (Part 2). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 243-262 (2011).
  24. Han, Q., Jin, W., et al. The promotion of neural regeneration in an extreme rat spinal cord injury model using a collagen scaffold containing a collagen binding neuroprotective protein and an EGFR neutralizing antibody. Biomaterials. 31 (35), 9212-9220 (2010).
  25. Suzuki, H., Kanchiku, T., et al. Artificial collagen-filament scaffold promotes axon regeneration and long tract reconstruction in a rat model of spinal cord transection. Med. Mol. Morphol. 48 (4), 214-224 (2015).
  26. Silva, N. A., Salgado, A. J., et al. Development and Characterization of a Novel Hybrid Tissue Engineering-Based Scaffold for Spinal Cord Injury Repair. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 45-54 (2009).
  27. Moore, M. J., Friedman, J. A., et al. Multiple-channel scaffolds to promote spinal cord axon regeneration. Biomaterials. 27 (3), 419-429 (2006).
  28. Tsai, E. C., Dalton, P. D., Shoichet, M. S., Tator, C. H. Synthetic hydrogel guidance channels facilitate regeneration of adult rat brainstem motor axons after complete spinal cord transection. J. Neurotrauma. 21 (6), 789-804 (2004).
  29. Chen, B. K., Knight, A. M., et al. Axon regeneration through scaffold into distal spinal cord after transection. J. Neurotrauma. 26 (10), 1759-1771 (2009).
  30. Jain, A., Kim, Y. -T., McKeon, R. J., Bellamkonda, R. V. In situ gelling hydrogels for conformal repair of spinal cord defects, and local delivery of BDNF after spinal cord injury. Biomaterials. 27 (3), 497-504 (2006).
  31. Harris, J. P., Struzyna, L. A., Murphy, P. L., Adewole, D. O., Kuo, E., Cullen, D. K. Advanced biomaterial strategies to transplant preformed micro-tissue engineered neural networks into the brain. J. Neural Eng. 13 (1), 16019-16037 (2016).
  32. Cullen, D. K., Tang-Schomer, M. D., et al. Microtissue engineered constructs with living axons for targeted nervous system reconstruction. Tissue Eng. Part A. 18 (21-22), 2280-2289 (2012).
  33. Tate, M. C., Shear, D. A., Hoffman, S. W., Stein, D. G., Archer, D. R., LaPlaca, M. C. Fibronectin promotes survival and migration of primary neural stem cells transplanted into the traumatically injured mouse brain. Cell Transplant. 11 (3), 283-295 (2002).
  34. Denham, M., Parish, C. L., et al. Neurons derived from human embryonic stem cells extend long-distance axonal projections through growth along host white matter tracts after intra-cerebral transplantation. Front. Cell. Neurosci. 6 (11), (2012).
  35. Fawcett, J. W., Barker, R. A., Dunnet, S. B. Dopaminergic neuronal survival and the effects of bFGF in explant, three dimensional and monolayer cultures of embryonic rat ventral mesencephalon. Exp. Brain Res. 106 (2), 275-282 (1995).
  36. Mine, Y., Tatarishvili, J., Oki, K., Monni, E., Kokaia, Z., Lindvall, O. Grafted human neural stem cells enhance several steps of endogenous neurogenesis and improve behavioral recovery after middle cerebral artery occlusion in rats. Neurobiol. Dis. 52, 191-203 (2013).
  37. Ren, H., Chen, J., Wang, Y., Zhang, S., Zhang, B. Intracerebral neural stem cell transplantation improved the auditory of mice with presbycusis. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 6 (2), 230-241 (2013).
  38. Sinclair, S. R., Fawcett, J. W., Dunnett, S. B. Dopamine cells in nigral grafts differentiate prior to implantation. Eur. J. Neurosci. 11 (12), 4341-4348 (1999).
  39. Tate, C. C., Shear, D. A., Stein, D. G., Tate, M., LaPlaca, M. C., Archer, D. R. Laminin and fibronectin scaffolds enhance neural stem cell transplantation into the injured brain. J. Tissue Eng. Regen. Med. 3 (3), 208-217 (2009).
  40. Yoo, S. J., Kim, J., Lee, C. -S., Nam, Y. Simple and novel three dimensional neuronal cell culture using a micro mesh scaffold. Exp. Neurobiol. 20 (2), 110-115 (2011).
  41. Chen, H. I., Jgamadze, D., Serruya, M. D., Cullen, D. K., Wolf, J. A., Smith, D. H. Neural Substrate Expansion for the Restoration of Brain Function. Front. Syst. Neurosci. 10, (2016).
  42. Cullen, D. K., Wolf, J. A., Vernekar, V. N., Vukasinovic, J., LaPlaca, M. C. Neural tissue engineering and biohybridized microsystems for neurobiological investigation in vitro (Part 1). Crit. Rev. Biomed. Eng. 39 (3), 201-240 (2011).
  43. Struzyna, L. A., Katiyar, K., Cullen, D. K. Living scaffolds for neuroregeneration. Curr. Opin. Solid State Mater. Sci. 18 (6), 308-318 (2014).
  44. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS One. 3 (2), (2008).
  45. Dahotre, N. B., Harimkar, S. Laser fabrication and machining of materials. , Springer Science & Business Media. (2008).
  46. Kutter, J. P., Klank, H., Snakenborg, D. Microstructure fabrication with a CO2 laser system. J. Micromechanics Microengineering. 14 (2), (2004).
  47. Spicar-Mihalic, P., Houghtaling, J., Fu, E., Yager, P., Liang, T., Toley, B. CO2 laser cutting and ablative etching for the fabrication of paper-based devices. J. Micromechanics Microengineering. 23 (6), (2013).
  48. Pacifici, M., Peruzzi, F. Isolation and culture of rat embryonic neural cells: a quick protocol. J. Vis. Exp. (63), (2012).
  49. Cullen, D. K., Gilroy, M. E., Irons, H. R., Laplaca, M. C. Synapse-to-neuron ratio is inversely related to neuronal density in mature neuronal cultures. Brain Res. 1359, 44-55 (2010).
  50. Huang, J. H., Cullen, D. K., et al. Long-Term Survival and Integration of Transplanted Engineered Nervous Tissue Constructs Promotes Peripheral Nerve Regeneration. Tissue Eng. Part A. 15 (7), 1677-1685 (2009).
  51. Katiyar, K. S., Winter, C. C., Struzyna, L., Harris, J. P., Cullen, D. K. Mechanical elongation of astrocyte processes to create living scaffolds for nervous system regeneration. J. Tissue Eng. Regan. Med. , (2016).
  52. Howard, M. A., Baraban, S. C. Synaptic integration of transplanted interneuron progenitor cells into native cortical networks. J. Neurophysiol. 116 (2), 472-478 (2016).
  53. Wernig, M., Benninger, F., et al. Functional Integration of Embryonic Stem Cell-Derived Neurons In Vivo. J. Neurosci. 24 (22), 5258-5268 (2004).
  54. Ganguly, K., Poo, M. Activity-dependent neural plasticity from bench to bedside. Neuron. 80 (3), 729-741 (2013).
  55. Dancause, N. Extensive Cortical Rewiring after Brain Injury. J. Neurosci. 25 (44), 10167-10179 (2005).
  56. Winter, C. C., Katiyar, K. S., et al. Transplantable living scaffolds comprised of micro-tissue engineered aligned astrocyte networks to facilitate central nervous system regeneration. Acta Biomater. 38, 44-58 (2016).
  57. Adewole, D. O., Serruya, M. D., et al. The Evolution of Neuroprosthetic Interfaces. Crit. Rev. Biomed. Eng. 44 (1-2), 123-152 (2016).
  58. Cullen, D. K., Patel, A., Doorish, J. F., Smith, D. H., Pfister, B. J. Developing a tissue-engineered neural-electrical relay using encapsulated neuronal constructs on conducting polymer fibers. J. Neural Eng. 5 (4), 374-384 (2008).
  59. Cullen, D. K., Stabenfeldt, S. E., Simon, C. M., Tate, C. C., LaPlaca, M. C. In Vitro Neural Injury Model for Optimization of Tissue-Engineered Constructs. J. Neurosci. Res. 85, 3642-3651 (2007).
  60. Irons, H. R., Cullen, D. K., Shapiro, N. P., Lambert, N. A., Lee, R. H., Laplaca, M. C. Three-dimensional neural constructs: a novel platform for neurophysiological investigation. J. Neural Eng. 5 (3), 333-341 (2008).
  61. Morrison, B. I., Cullen, D. K., LaPlaca, M. In Vitro Models for Biomechanical Studies of Neural Tissues. Stud. Mechanobiol. Tissue Eng. Biomater. 3, 247-285 (2011).
  62. Vukasinovic, J., Cullen, D. K., Laplaca, M. C., Glezer, A. A microperfused incubator for tissue mimetic 3D cultures. Biomed. Microdevices. 11 (6), 1155-1165 (2009).
  63. Cullen, D. K., Lessing, M. C., Laplaca, M. C. Collagen-dependent neurite outgrowth and response to dynamic deformation in three-dimensional neuronal cultures. Ann. Biomed. Eng. 35 (5), 835-846 (2007).
  64. LaPlaca, M. C., Vernekar, V. N., Shoemaker, J. T., Cullen, D. K. Three-dimensional neuronal cultures. Methods Bioeng. 3D Tissue Eng. , (2010).
  65. Chwalek, K., Tang-Schomer, M. D., Omenetto, F. G., Kaplan, D. L. In vitro bioengineered model of cortical brain. Nat. Protoc. 10 (9), 1362-1373 (2015).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikro TENN lerSinir A Rekonstr ksiyonuAksonal Yolak M hendisli iHidrojel Mikro S tunlarN ronal AgregatlarBeyin Konnektom ModellemesiAksonal Yolak Onar mH cre MigrasyonuSinaptik mm nboyamaBoyutlu Sinir A lar

İlgili makaleler