Sinir Sistemi Yeniden Yapılanma, Modülasyon ve Modelleme için Anatomik olarak İlham Almış Üç Boyutlu Mikro-Dokulu Mühendisli Sinir Ağları

Summary

Bu el yazması, mikro-doku ile tasarlanmış sinir ağlarının imalatını ayrıntılarıyla anlatmaktadır: boru biçiminde bir hidrojel içine konan agrega nöronal popülasyon (lar) yı kapsayan uzunlamasına hizalanmış aksonal yollardan oluşan üç boyutlu mikron boyutlu yapılar. Bu canlı iskele, sinirsel devreleri yeniden yapılandırmak veya modüle etmek için fonksiyonel röleler veya gri-beyaz madde nöroanatomisini taklit eden biyofiziksel test yatakları olarak işlev görebilir.

Abstract

Fonksiyonel düzelme nörojenez için inhibe edici ortam ve sınırlı kapasite nedeniyle merkezi sinir sistemi (MSS) içindeki yaralanma veya hastalığa bağlı dejenerasyon sonrasında nadiren oluşur. Hasar gören SSS'de nöronal ve aksonal yol kaybını aynı anda gidermek için bir strateji geliştiriyoruz. Bu el yazması, mikro-doku mühendislik yapmış sinir ağları (mikro-TENN'ler), implante edilebilen nöronlar ve santimetre uzayabilen yüzlerce mikron çapında önceden oluşturulmuş bir hidrojel silindirin hücre dışı matrisi (ECM) lümenine hizalı aksonal yollardan oluşan implantasyon yapım protokolünü sunmaktadır uzunluğunda. Nöronal agregalar üç boyutlu kaplamanın uçlarına sınırlanır ve aksonal projeksiyonlarla yayılır. Micro-TENN'ler CNS yeniden yapılandırması için bir strateji olarak benzersiz bir konumdadır ve beyin bağlantılı sitrik mimarisinin özelliklerini taklit eder ve potansiyel olarak ağ değişimi için araçlar sağlar. NeuRonal agregalar eksik veya hasar görmüş devreyi restore etmek ve / veya modüle etmek için yeni fonksiyonel röleler oluşturmak üzere konakçı doku ile sinapslanabilir. Bu yapılar ayrıca, hücre yenilemesi ve aksonal yol bulma için gelişim mekanizmalarını kullanabilen, rejenerasyon durumuna dayanan sinerjik yapısal ve çözünür ipuçları sağlayan pro-rejeneratif "canlı iskele" olarak da işlev görebilir. Mikro-TENN'ler sıvı hidrojel, uzunlamasına merkezli bir iğne içeren silindirik bir kalıba dökülüp imal edilir. Hidrojel jelleştikten sonra iğne boşaltılarak içi boş bir mikro sütun bırakılarak çıkarılır. Nöronal yapışma ve aksonal gelişim için uygun bir ortam sağlamak için lümene bir ECM çözeltisi eklenir. Ayrışmış nöronlar, mikro sütunun bir veya iki ucunda hassas tohumlama için mekanik olarak toplanır. Bu metodoloji, beyin nöroanatomisinin özelliklerini yineleyebilecek uzun projeksiyonlu aksonal yollar içeren kendi kendine yeten minyatür yapıları güvenilir bir şekilde üretir. Synaptic immEtiketsiz ve genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergeleri, mikro-TENN'lerin kapsamlı sinaptik dağılımına ve elektriksel aktiviteye sahip olduğunu ortaya koymaktadır. Sonuç olarak, mikro-TENN'ler, beyin yolaklarının hedefe yönelik nöroşirürji rekonstrüksiyonu için umut verici bir stratejiyi temsil eder ve nörobiyolojik olayları in vitro olarak incelemek için biyo-fidelik modeller olarak da uygulanabilir.

Introduction

Travmatik beyin hasarı (TBI), omurilik yaralanması (SCI), inme, Alzheimer hastalığı ve Parkinson hastalığı gibi merkezi sinir sistemi hastalıklarının (MSS) ortak bir özelliği, aksonal yolların ve nöronal hücrenin kopukluğudur Kayıp ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Örneğin, iskemik bir inme tedavi edilmezse, aksonların dakikada 7 mil akson hızında kaybolduğu tahmin edilir. Her yıl yaklaşık 1.7 milyon insanın her yıl ABD'de deneyimlediği TBI vakasında, aksonal bozulmalar travmadan s....

Protocol

Hayvanlarla ilgili tüm prosedürler, Pennsylvania Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri ve Michael J. Crescenz Gaziler İşleri Tıp Merkezi tarafından onaylandı ve NIH Kamu Sağlığı Hizmet Politikası'nda yer alan ilkelere uyuldu ve İnsani Bakım ve Laboratuar Kullanımı Hayvanlar (2015).

1. Agaroz Hidrojelinin Geliştirilmesi (mikro-TEN'lerin Uç Faz Komponenti)

1. Agaroz çözeltisi hazırlama
   1. Biyogüvenlik kabininde, iki 10 cm'lik Petri tabağının her birine 20 mL Dulbecco fosfat tamponlu salin (DPBS) aktararak mikro sütun için rezervuar hazırlayın. Sıcak bir boncuk sterili....

Results

Mikro-TENN'ler, sitografi ve aksonal gelişimlerini değerlendirmek için faz-kontrast mikroskobu kullanılarak izlendi ( Şekil 4 ). Tek yönlü, 2 mm uzunluğunda mikro-TENN'lerde, nöronal agregalar mikro kolonun bir ucuyla sınırlandırılmış ve iç çekirdeğin içinden aksonlar demeti öngörülmüştür. Aksonlar, kolonun tüm uzunluğunu in vitro (DIV) 5 gün boyunca uzattı ( Şekil 4A ). Aksonlar, tüm mikro kolonu 3 DIV ile kapladığı için, iki yönlü 2 mm uzunluğ.......

Discussion

CNS yaralanması ve hastalığı tipik olarak, birlikte görülen nöronal dejenerasyon ile veya olmadan, beyin connectome'yu içeren uzun mesafeli aksonal yolların kaybedilmesi veya işlevinde aksama ile sonuçlanır. Bu nörojenez ve yenilenmeyi teşvik etmek için CNS'in sınırlı kapasitesi ile karışıktır. Bireysel veya kombinatoryal yaklaşımlar olarak büyüme faktörü, hücre ve biyomalzeme sunumu gibi onarım stratejilerinin peşinde olmasına rağmen, bu teknikler aynı anda hem nöronal hücrelerin dejenerasyonunu hem de aksonal .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lazer kesici	Üniversal Lazer Sistemleri	PLS4.75	Lazer kesim mikro kanal kalıbını imal etmek için kullanılır.
Lazer kesim mikro kolon imalat cihazı	Ismarlama	--------------	İlgileniyorsanız araştırma grubumuzla iletişime geçin. El yazmasında sağlanan boyutlar ve planlar.
Vidalar	--------------	--------------#	4-40, 3,05 mm diş çapı
Somunlar	--------------	--------------	#4-40, 3,05 mm diş çapı ile
Akupunktur iğnesi (180 & mikro; m çapı)	Lhasa Medical	sj.16X40	Çap, mikro sütun lümeni için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Petri kabı	Fisher	08772B
Dulbecco'nun fosfat tamponlu salin (DPBS)	Invitrogen	14200075
Polistiren tek kullanımlık serolojik pipet	Fisher	13-678-11D
Agaroz	Sigma	A9539-50G
Kılcal tüp (398 & mikro; m çap)	Fisher	21170D	Çap, mikro kolon kabuğu için istenen boyuta göre değiştirilebilir.
Sıcak plaka	Fisher	SP88857200
Manyetik çubuk	Fisher	1451352
Mikropipet	Sigma	Z683884-1EA
25 mm ölçer iğne	Fisher	14-826-49
Mikro Neşter	Roboz Cerrahi	RS-6270
Makas	Güzel Bilim Araçları	14081-09
Forseps	Dünyası Hassas Aletler	501985
Sıcak boncuk sterilizatörü	Sigma	Z378550-1EA
Stereoskop	Nikon	SMZ800N	Tüm diseksiyon adımları ve mikro-TENN üretimi için kullanılır.
Sıçan kuyruğu tip I kollajen	Corning	354236	4 >m'de koruyun; C ve sadece gerektiğinde çıkarın.  Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Mikrosantrifüj tüpü	Fisher	02-681-256
Fare laminin	Corning	354232	4 >m'de koruyun; C ve sadece gerektiğinde çıkarın.  Kullanım sırasında sıcaklığını korumak için buz kullanın.
Nörobazal ortam	Invitrogen	21103049	Doğum öncesi ve embriyonik nöronal hücrelerin kültürü için bazal ortam. 4º'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sodyum hidroksit (NaOH)	Fisher	SS2661
Hidroklorik asit (HCl)	Fisher	SA48-1
Turnusol kağıdı	Fisher	09-876-18
Hank'in dengeli tuz çözeltisi (HBSS)	Invitrojen	14170112	4 ºC'de saklayın.
% 0.25 Tripsin-EDTA	Invitrogen	25200056	-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sığır pankreatik deoksiribonükleaz (DNaz) I	Sigma	10104159001	-20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
B-27 Takviyesi	Invitrojen	12587010	Hipokampal ve kortikal nöronların kültürü için Nörobazal ortama eklenen takviye. -20 >m'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
L-glutamin	Invitrogen	35050061	-20 º'de saklayın; C ve 37 ° C'de sıcak; Kullanmadan önce C.
Sprague Dawley embriyonik gün 18 sıçanlar	Charles River	Strain 001
Pasteur pipet	Fisher	22-042816
15 mL santrifüj tüpü	EMESCO	1194-352099
Vortex	Fisher	02-215-414
Santrifüj	Fisher	05-413-115
Hemositometre	Fisher	02-671-6
Objet30 3D Yazıcı	Stratasys	--------------	Piramidal mikro kuyu kalıplarını imal etmek için kullanılır.
3D baskılı piramidal kuyu kalıbı	Ismarlama	--------------	İlgileniyorsanız araştırma grubumuzla iletişime geçin. El yazmasında sağlanan boyutlar ve planlar.
Polidimetilsiloksan (PDMS) ve sertleştirici	Fisher	NC9285739	Elastomer ve kürleme maddesi içeren kit olarak gelir. Kimyasal davlumbazın içinde kullanın.
Huni	Fisher	10-348C
1 ml pipet ampulü	Sigma	Z509035
Mikro spatula	Fisher	S50821
12 oyuklu kültür plakası	EMESCO	1194-353043
Fırın	Fisher	11-475-154
Kuluçka	Makinası Fisher	13 998 076
AAV1. Syn.GCaMP6f.WPRE.SV40	UPenn Vector Core	36373	-80ºC'de saklayın. GCaMP6f kalsiyum indikatörü ile ticari olarak temin edilebilen adeno-ilişkili virüs (AAV).
Formaldehit %40	Fisher	F77P-4	Formaldehit, kanserojen olduğu bilinen toksik bir bileşiktir ve ayrı bir kapta atılmalıdır.
Triton X-100	Sigma	T8787	Hücre zarlarına nüfuz etmek için kullanılan iyonik olmayan yüzey aktif madde.
At serumu	Gibco	16050-122
Fare anti-Tuj-1 / beta-III tübülin birincil antikoru	Sigma	T8578-200UL	-20ºC'de saklayın.
Tavşan anti-sinapsin 1 primer antikor	Sinaptik Sistemler	106-001	-20ºC'de saklayın.
Eşek anti-fare 568 ikincil antikor	Invitrogen	A10037	4 & ordm; C'de saklayın.
Eşek anti-tavşan 488 ikincil antikor	Invitrogen	A21206	4ºC'de saklayın.
Hoechst 33342, Trihidroklorür	Invitrogen	H3570	4ºC.  Hoechst, kanserojen olarak tedavi edilmesi gereken bilinen bir mutajendir. Bu nedenle ayrı bir kapta atılmalıdır.
A1RSI Lazer Taramalı Konfokal Mikroskop	Nikon	--------------	İmmün etiketli yapıların konfokal rekonstrüksiyonlarını almak için kullanılır.
Eclipse Ti-S Mikroskobu	Nikon	--------------	Faz kontrastlı görüntülerin çekimi için kullanılır. Nikon Elements Basic Research yazılımı (4.10.01) ile arabirim içeren bir QiClick kamera kullanılarak dijital görüntü elde etme ile.
Yüksek Hızlı Floresan Mikroskobu	Nikon	--------------	Nikon Eclipse Ti mikroskobu, kalsiyum görüntüleme için bir ANDOR Neo/Zyla kamera ile eşleştirilmiştir.
NIS Elements AR 4.50.00 Yazılımı	Nikon Instruments	--------------	Yüksek hızlı floresan mikroskobu ile alınan kayıtlardan kalsiyum geçişlerini tanımlamak için kullanılır.