Yöntem makalesi

Kas Dokular doğrudan sıvı azot içine girdikleri zaman Artifacts Donma bir çoklu-delikli dondurarak saklamaya uygun vialler ortadan kaldırır

11.3K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55616

⸱

6 Nisan 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1State Key Laboratory for Pig Genetic Improvement and Production Technology, Jiangxi Agricultural University

Bu makalede

Özet

Bu protokol, doğrudan sıvı azot içine sokulup çıkartılarak kas dokuları dondurarak için bir prosedür tarif eder. Bu protokol, aynı zamanda, azot gazı "battaniye etkisi" önlemek yeni cryovial vurguladığında sıvı azot temas bir numunenin doku yüzeyi.

Özet

iskelet kası fizyolojisi üzerinde çalışmalar uygun şekilde açıkça görünür sitoplazmik bölmelerle bölümleri elde etmek için numuneler işleme teknik sorunuyla karşı karşıya. Başka engel çevreleyen dokulara miyofiberlerindeki sıkı appozisyon olduğunu. doku fiksasyon ve parafine işlemidir kas lifleri büzülme yol açtığı için, donma kesit için kas dokusu sertleştirme optimal bir araçtır. Bununla birlikte, sık karşılaşılan bir sorun, buz kristallerinin oluşumu nedeniyle kas yüksek su içeriği Dondurulmuş kesitlerin hazırlanması sırasında meydana gelir. Burada sunulan protokol önce sıvı azot içine daldırılarak, kas dokuları dondurulması için basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. tek başına sıvı azot kullanılarak sorun, aşağıdaki bir yalıtıcı olarak hareket eder ve dokuların soğutma inhibe doku, bir nitrojen gaz bariyeri oluşumuna neden olmasıdır. Bir NE bu "buğu örtüsü" etkisini önlemek içinw dondurarak saklamaya uygun vialler doku yüzeyi çevresinde, sıvı akış hızını arttırmak için tasarlanmıştır. Bu şişe duvarında 14 giriş deliklerinin toplam delme ile elde edilmiştir. Kabarcık dinamiklerine göre, küçük kabarcıklar ve daha az şansa sıvı akış sonuçlarının daha yüksek bir oranı, bir gaz bariyeri oluşturulur. Sıvı azot giriş deliklerinden dondurarak saklama viali içine aktığında, doku etrafında akış hızlı gaz bariyeri ortadan kaldırmak için yeterince hızlıdır. Önceden soğutulmuş izopentan kullanılarak, kas dokuları dondurma yöntemiyle karşılaştırıldığında, bu protokol daha basit ve daha etkili ve bir verimli bir şekilde kas dondurmak için kullanılabilir. Dahası, bu yöntem oda sıcaklığında son derece yanıcı olan izopentan, erişimi yok kurumlar için en uygunudur.

Giriş

İskelet kası bakış beslenme ve işleme noktasından bir et üreten hayvan en değerli bileşenidir. kas büyümesi verimliliği ve ortaya çıkan etin kalitesi: Et endüstrisinde, iki özellikle kritik yönleri vardır. Kas ana bileşen olarak, kas lifleri büyüme performansı ve hayvanlarda 1 taze et kalitesini doğrudan ilişkilidir. Örneğin, Liflerin toplam sayısı (TNF) ve Liflerin çapraz kesit alanı (ÇSAF) daha çok kas kitlesi ve et kalitesini belirler; Ayrıca, Elyaf Tipi Kompozisyon (FTC) kuvvetle taze et kalitesini 2. etkiler. Bu nedenle, hayvanlarda kas lifi özelliklerinin manipülasyon çekirdek karlılık ve çiftliklerin 1 rekabet gücünü artırmak için son derece etkili bir yöntemdir.

Bugüne kadar birçok içsel ve dışsal faktörler kas lifi characterist manipüle etmek tespit edilmiştirICS 1. Bu manipülasyon, domuzlar 5 sığırlarda 3 Miyostatin gen, koyun 4 Callipyge geni ve RyR1'in ve IGF2 genleri gibi spesifik genleri, hayvanların hedef seçimi ile elde edilebilir. Ayrıca, diyet kontrolü ve spesifik hormonlarla tedaviler kas lifi özelliklerine 6 önemli rol oynamaktadır. Böylece, genetik ve beslenme faktörleri birleştiren bir yaklaşım yağsız et içeriğini ve et kalitesini arttırmak mümkün olabilir. kas liflerinin yapısının aydınlatılması hala bir sorun olduğundan, ancak kas liflerinde çalışmalar et endüstrisinde sınırlıdır.

Kas lifi özellikleri, bu miyozin adenosin trifosfat (ATP) deneyi gibi histokimyasal yöntemler kullanılarak tespit edilir. Bu yöntem, dondurulmuş (6-8 um) ince bölümleri içinde yer enzimler gerçeğine dayanırkas lifleri kimyasal bazı ürünleri ile reaksiyona sokulabilir. Bununla birlikte, kas su içeriği ne olursa olsun, bir konumda (yani, sırt, karın veya arka bacak) 7, domuzlar, tavşanlar, fareler ve insanlarda% 75'den daha büyük olduğunu. Daha önce 8, 9 tarif edildiği gibi, cryosections hazırlanması sırasında - eserler dondurma - kas içinde bu ölçüde yüksek nem içeriği, sık görülen bir sorun neden olur. Çoğu durumda, uygun deneyimlerimizi göre, bir mezbaha üretim hattında kas dokularını dondurmak için neredeyse imkansızdır.

Burada sunulan protokol, yüksek verimli bir şekilde cryosectioning için kas dokularını dondurmak için laboratuvarda kullanılan basit ve etkili bir yöntem tarif etmektedir. Bu yöntemin vurgulamak sıvı azot içinde hızlı dondurma kas dokuları için tasarlanmış yeni bir gelmekteydi olup. mevcut iş akışı eşzamanlı olarak doku kolaylaştırabiliraçıkça görülebilir bir sitoplazmik bölüm ve çevredeki dokuya kas liflerine sıkı appozisyon ile mükemmel bir kas cryosection donma ve işlenmesi. Sıvı azot dokularıyla karışmaz Buna ek olarak, bu protokol, doku analizi için geniş bir seçenek dizisine uygulanabilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

Geçerli yöntem kurulmuş ve hasat ve laboratuvarımızda histolojik boyama için 1.000 'den fazla kas örnekleri saklamak için valide edilmiştir. Hayvan bakım ve kullanımını içeren tüm uygulamalar Çin Tarım Bakanlığı tarafından kurulan yönergelere izledi.

Örnek Toplama 1. Ekipmanları

  1. Her bir kriyojenik şişe ile ilgili örnek bir kimlik etiketleyin.
    Not: Derin dondurucudaki şişe özel cryosection prosedür (Şekil 1A) taze doku numuneleri dondurma için tasarlanmıştır. Deney şişeleri, bir kalıp fabrikası (Şekil 1C) polipropilen imal edilmektedir.
  2. uygun bir sıvı azot tankında sıvı azot, gözlükler veya bir yüz kalkanı, derin dondurucu eldiven, 10 cm forseps, 25 cm cımbız, plastik bir soğutucu (iç boyutları: 20 cm uzunluk x 12 cm genişlik x 13.5 cm yüksekliğinde, aşağıdaki malzemelerin temin ; dış boyutları: genişlik x 15 cm yükseklik, 24 cm uzunluk x 16 cm), bir plastik filmin (genişlik x 0.1 mm kalınlığında 2.5 cm uzunluğunda x 0.8 cm),bir bisturi ve A4 PVC bağlayıcı kapaklar (21 cm x 29.5 cm) (Şekil 1B).

Kas Örneklerinde 2. Hazırlık

  1. önde numune ile birlikte, sıvı azot, 5 dakika ile köpük soğutucu doldurun.
    Not: sıvı azot parçası edn ve yeni hazırlanmış numunelerin, dokunma zaman gaz haline geçer, çünkü sıvı azotun büyük bir kolon gerekmektedir. kaybını önlemek için sıvı azot devri sıklığını azaltmak için, uygun boyutta bir köpük soğutucu numune sayısına göre önceden kazanılmış olması gerekir.
  2. Bir örnek alındığında, nazikçe A4 PVC bağlayıcı kapağın bir parçasına koyun ve kas liflerinin yönüne dikkat.
    NOT: Burada, domuzlarda son bel omur birinciden longissimus Doris kasının kesiti kullanılır. Numuneler yaklaşık 12 cm uzunluğunda, 8 cm genişliğinde ve 5 cm yüksekliğinde bulunmaktadır.
  3. numune i ile iki paralel kesiler yapmak için bir neşter kullanınn, kas liflerinin doğrultusu, uzunluk olarak yaklaşık 3 cm, birbirinden 0.6 cm. Yaklaşık 0.6 cm genişliğinde x 0.6 cm x 1.5 x yükseklik cm uzunluğunda bir dikdörtgen kazınmış kas kesin.
    Not: kas liflerinin enine kesit alanı ölçülerek güvenilirliği çok kazıma kas lif oryantasyonuna bağlıdır.
  4. Yavaşça film (Şekil 2A) uzun kenarına kazıma kas paralel uzunlamasına ekseni ile, plastik film bir parça örneği koymak için, 10 cm forseps kullanın.
    Not: kas liflerinin yönelim ve nedeniyle hızlı dondurma numunedeki çatlaklar engelleyen bir yapışma işlevi sabitleme yardımcı olan bir tutma işlevi: plastik film iki işlevi vardır.
  5. Forseps kullanarak, sadece giriş delikleri arasında, etiketlenmiş bir kriyojenik şişe alt ortasına kas dokusunu yerleştirin ve ampul sıkıca (Şekil 2B) kap.

3. Dondurma ve Depolama kas Örneks

  1. 25 cm cımbız kullanarak, hızlı bir şekilde sıvı azot (yaklaşık 10-20 s) kaynatın etmez bekleyerek, önceden soğutulmuş köpük soğutucu sıvı azot içinde bütün kriyojenik şişe daldırın.
    Not: sıvı azot kaynama zaman dondurarak saklamaya uygun vialler dikkatli bir şekilde 10-20 saniye kaynatılarak sıvı azot içinde şişe sokmak, yüzer.
  2. bir sıvı azot depolama tankı ya da uzun süreli depolama için bir -80 ° C dondurucu kas örnekleri aktarın.

4. Slayt Hazırlama

  1. -20 ° C ve -22 ° C arasında bir kriyostat ön soğutma.
  2. Çıkarın ve eski mikrotom bıçak atmak kriyostat bıçak tutucusu ve devrilme önleyici levha aşağı silin, kriyostat, yeni bir mikrotom bıçağı yükleme ve 8 um kesme kalınlığını ayarlamak.
  3. Sıvı azot depolama tankı kriyojenik şişede kas örnek aktarın veya -80 ° C sıcaklıkta dondurucuya kriostada, sıvı azot içinde veya kuru buz üzerinde taşınması.
  4. örnek kriyostatının sıcaklığına dengelenmeye için 30 dakika bekleyin.
    NOT: Bir yüksek sıcaklık numunede buz kristallerinin oluşmasını neden olabilir çünkü örnek dokunmatik olabilecek herhangi ekipman, önceden soğutulması gerekir.
  5. suda çözünür glikoller ve reçineler (OCT) optimum kesme ısısı formülasyon altında numune tutucu örnek monte edin. 8-mikron bölümleri kesilir.
    Not: ÇSAF kas liflerinin kesit alanı olduğu için, kas liflerinin yönelimine dik bir kesme açısı ayarlayın.
  6. Bir oda sıcaklık mikroslayd merkezine doğru bölümlerini monte edin. Derhal bir -80 ° C dondurucu içinde bir slayt kutusu içine slayt yerleştirin. slayt RT'de kurumasına izin vermeyin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Dondurarak saklamaya uygun vialler örnekleme ve dondurulmuş bölümleri hazırlanması sırasında kas dondurma için ortak laboratuar ekipmanları, Şekil 1 'de gösterilmiştir. cryovials bir kalıp fabrikasında polipropilenden yapılmıştır. Her şişe, 14, giriş delikleri toplam vardır: bir açık olduğunu göstermektedir; Başka bir alt olduğu; ve geri kalan 12 formu, dört paralel hat, birbirine 90 ° 'de dört delik her biri. Bu giriş delikleri zaman "buhar battaniye" ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Burada, dondurma ve kas fonksiyonunun histolojik ölçümler yapmak kas dokuları depolamak için yeni, çok delikli cryovial tarif eder. Bu protokol kritik modifiye bir çok delikli cryovial örnek, doğrudan sıvı azot içine daldırılmış olmasıdır. Bildiğimiz kadarıyla, bu mevcut dondurma yöntemleri arasında kas cryosectioning mükemmel donmuş örnekleri (temsili sonuçları görmek) elde etmek için en basit ve rapidest yoludur.

kas araştırmacılar karşılaştığı teknik zorluk buz kristalleri kesit alma kas ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Çıkar çatışması, mali veya başka türlü, yazarlar tarafından bildirilmiştir.

Teşekkürler

Bu proje Çin Ulusal Doğa Bilim Vakfı (NSFC) tarafından desteklenmiştir: 31301950 ve 31671288.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Kriyostat Mikrotom  LeicaLeica CM1950
Dijital Mikroskop NikonNikon DS-U3
  Kriyojenik Şişe    Plastik filmKendimiz tarafından tasarlandı
Sıvı NitrojenKomodor tarafından kullanılan
NeşterKommoly kullanılan
10 cm forsepsKommoly kullanılan
25 cm cımbızTavsiye kullanılan
Güvenlik camıCommly tarafından kullanılan
Dondurucu eldivenleriYaygın olarak kullanılan

Kaynaklar

  1. Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics. Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).
  2. Lefaucheur, L. A second look into fibre typing--relation to meat quality. Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).
  3. Fiems, L. O. Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat. Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).
  4. Cockett, N. E., et al. The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep. Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).
  5. Stinckens, A., et al. The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy. Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).
  6. Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation. Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).
  7. Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. Tissue water content in rats measured by desiccation. J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).
  8. Meng, H., et al. Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease. J Vis Exp. (89), (2014).
  9. Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), e52793(2015).
  10. Meijer, A. E., Vloedman, A. H. The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria. Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).
  11. Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis). Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).
  12. Dubowitz, V., Sewry, C. Muscle Biopsy: A Practical Approach. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).
  13. Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e. , Elsevier. (2008).
  14. Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe. J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).
  15. Fukutomi, K., et al. A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field. Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).
  16. Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation. Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

S v Azotla DondurmaKas Dokusu Haz rlamaBuhar Bariyerinin GiderilmesiDoku KesenmesiKriyostatla KesmeATPase Aktivite Analizizopentan Alternatifiskelet Kas FizyolojisiDoku Dondurma Protokol

İlgili makaleler