Method Article

Değerlendirirken birincil patlama efektleri Vitro

DOI:

10.3791/55618

⸱

September 18th, 2017

 ,  , 
1Department of Bioengineering, Imperial College London

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nasıl hücreleri tarafından şok dalgalarıyla modüle anlama gelen patlama olayları tetikleyen yaralanmaları arkasında mekanizmaları belirlemenize yardımcı olabilir. Bu iletişim kuralı özel olarak oluşturulmuş şok tüpü ekipman hücre monolayers için şok dalgaları baskıların bir mesafeden uygulamak ve hücre canlılığı üzerinde sonraki etkileri tanımlamak için kullanır.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Patlama olaylara maruz akciğerler, kulak ve beyin gibi hayati organlara ağır travma neden olabilir. Böyle patlama kaynaklı yaralanmaları arkasında mekanizmaları anlama patlayıcı kullanımı yönünde son eğilim modern warfare ve terörist ile ilgili olaylar dikkate alınarak büyük önem taşıyor. Patlama kaynaklı yaralanma tamamen anlamak için biz ilk tür patlama olaylara tekrarlanabilir bir yöntemle kontrollü bir ortamda çoğaltmak gerekir. 2D olarak yetiştirilen canlı hücreleri üzerinde şok dalgaları baskıların bir mesafeden türetilebilecek şok tüpü donanımları kullanarak bu tekniği ve işaretleri hücre canlılık hemen bir Redoks göstergesi tahlil ve canlı ve ölü hücreleri floresan görüntüleme kullanılarak analiz edilebilir. Bu yöntem en yüksek patlama aşırı basınç 127 kPa için artan önemli bir düşüş ne zaman tedavi edilmezse kontrollere göre hücre canlılığı içinde teşvik edebilirsiniz olduğunu gösterdi. Test örnekleri yapisan hücrelere sınırlı değildir, ancak hücre süspansiyonlar, ekleyebilirsiniz şok tüp kurulum küçük değişiklikler ile tüm vücut ve doku örnekleri. Doku ve hücreleri bir gerçek patlama olayına maruz kaldığında deneyim kesin şartlar çoğaltılıyor zordur. Bu makalede sunulan bir gibi teknikleri hasar eşikler tanımlayabilir ve şok dalgası maruz ortaya hücrelerde transkripsiyon ve epigenetik değişiklikleri belirlemek için yardımcı olabilir.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Modern savaş ve terör eylemleri sivillere doğaçlama patlayıcı cihazların kullanımı doğru son eğilim ile insan vücudunda patlayıcı olaylar etkilerini anlama açısından önemlidir. Patlama olaylara maruz kalma yoluyla elde yaralanmalar ölümcül ve ölümcül yaralanma dört kategoriye bölünmüş fiziksel süreçleri ile olabilir. Yerel olarak vücut ile basınç ve daha sonra geniş bir şekilde etkileşime girer, patlama dalgası doğrudan maruz birincil yaralanmalar sonucu membran ve yumuşak dokular1bozulma neden. İkincil yaralanma künt travma veya nüfuz edici yaralar yüksek hızda patlama dalgası tarafından tahrikli düşük kütle nesnelerle etkisi tarafından neden içerir. Patlama dalgası yüksek kitle ya da bireyler nesneleri karşı nesnelerini atmak için yeterli enerji Tersiyer yaralanmalar meydana gelir. Son olarak, Kuvaterner patlama yaralanmaları flash burns2gibi diğer kategorilere sığmayan diğer çeşitli yaralanma tarafından tanımlanır. Tür patlama olaylara maruz, birincil yaralanmaları dahil travmatik beyin hasarı3,4,5, heterotopik ossifikasyon6,7, patlama akciğer hasarı8, işitme kaybı 9ve diğerleri10.

Yaygın olarak gözlenen bir dalga patlama olaylardan Friedlander dalgadır, ücretsiz alan, bir kapalı alanı, aksine patlama temsil eden. Dalga biçimi pozitif basınç keskin ve hızlı artış olarak tanımlanabilir bir patlama açık oluşur. Bu hemen hava yüksek hız ve basınç atmosferik seviyenin altında azaltır bir yayın dalga hareketli bir patlama rüzgarı izler. Kısmi bir vakum, bölgenin hava yavaş geri tepme sonuç ilk patlamanın yaptı. Dalga (şekil 1A) pozitif ve negatif aşamalarını patlama dalgası1itme-çekme hareketi neden. Arkasında birincil patlama yaralanma mekanizmaları aydınlatmak amacıyla, deneysel modeller gibi hücre ve dokuların gerçek patlama olayına maruz kaldığında karşılaşacağı Friedlander dalga dalga biçimleri üretmek için oluşturulmuştur. Mevcut sistemleri literatürde listelenen şok tüpleri11,12,13,14,15,16,17dahil, barochambers18,19, Kolsky bar20, Gelişmiş patlama simülatörleri21, Split Hopkinson basınç çubuğu22ve kontrollü ortam kullanarak alternatif patlama olayların rekreasyon pentaerythritol tetranitrate23. Çeşitli modeller rağmen patlama dalgaları, uygulanan öncesi stres de dahil olmak üzere ve mekanik özelliklerini, tek hücre türleri veya değerlendirme24altındaki dokuları elde edilen yaralanma fazla değişken etkiler. Çalışma doku veya organ doku deformasyon ve Brüt morfolojik değişiklikler patlama olaylar sonucu olarak sürekli ışık tutabilir iken, hücresel düzeyde analiz şok dalgası tarafından etkilenmiş transkripsiyon ve epigenetik değişikliklerin ortaya çıkarmak.

Bu yöntemleri makalede bir monolayer canlı hücreleri üzerinde baskıların bir mesafeden şok dalgaları yaymak için bir teknik anlatılmaktadır. Bu hücre canlılığı potansiyel hasar eşikleri şok dalgaları üzerinden elucidating, hemen karakterizasyonu için sağlar. Ayrıca, hücrelerin standart kültür koşulları için döndürülebilir ve uzun vadeli biyolojik etkileri patlama olaydan tespit edilebilir. İletişim kuralı aşağıdaki kültüründe hücreleri üzerinde kullanılan iki hücre canlılığı teknikleri açıklar.

figure-introduction-1
Şekil 1: Yaklaşım Friedlander dalgasının. (A) sensör 3 şok tüpü üzerinde gözlenen bir Friedlander dalga yaklaşık. (B) temsilcisi veri farklı basınç profilleri gösterilen sensörler 1, 2 ve 3 şok tüpü üzerinde gözlenen. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. hücre kültürü ve numune hazırlama

  1. elde bir uygun hücre kültürünü (örneğin, dermal papilla hücreleri).
    Not: Geçerli protokol yapışık hücreleri için bir model olarak kullanılan vibrissae dan izole sıçan dermal papilla fibroblastlar tasarlanmıştır.
  2. En az gerekli orta (MEM) α % 10 fetal sığır serum ve % 1 penisilin streptomisin ile desteklenmiş içeren bir T-75 şişesi hücrelerde kültür. Onlar % 80 izdiham ulaşana kadar hücreleri oksijen bir ortamda 37 ° C ve % 5 CO 2 standart kültür koşulları tutun.
  3. Orta Aspire edin ve Dulbecco iki kez hücrelerde yıkama ' s fosfat tamponlu tuz (PBS). Onları tripsin/EDTA, standart kültürüne koşulları 5 dakika süreyle kısaca hücreleri başarıyla ışık/faz kontrast mikroskop (ile 10 X objektif lens kullanarak balonun üzerinden ayrışmış emin olun 2 ml kuluçka şişeye hücrelerden ayırmak ).
  4. Kültür trypsinization reaksiyon nötralize etmek için orta 4 mL ekleyin. Hücre süspansiyon 15 mL santrifüj tüpü transfer.
  5. Santrifüj 200 x g hücreleri cips için 4 dakika için. Yavaş yavaş Pelet çıkarmak değil için dikkat çekici süpernatant, Aspire edin. Pelet 5 mL orta yeniden askıya alma.
  6. 20 µL aliquot hücre süspansiyon için temiz bir hemasitometre aktarmak ve 10 X objektif lens ile donatılmış bir mikroskop kullanarak hücreleri saymak.
  7. Hücreleri için patlama 90 mm çanak içinde üç 35 mm yemekleri koyarak hazırlamak. Onları uygun şekilde etiketleyin. Orta 2 mL her 35 mm çanak ekleyin ve 5 x 10 4 hücre, çanak, hücrelerin eşit etrafında yemek dağıtma başına toplam tohum. Gecede standart kültür koşulları için yeterli hücre eki şok dalgası pozlama önce izin vermek için deneysel örneklerinde kuluçkaya.
    Not: floresan görüntüleme için hücreleri steril cam coverslips numaralı seribaşı gerekir.

2. Boru montaj şok

figure-protocol-1
Şekil 2 : EVOC teçhizat ve şok tüp derleme. (A) görüntü EVOC teçhizat. (B) şeması şok tüpü cihaz. Şok tüp boyutları dahil et 59 mm ve 4.13 m EVOC teçhizat dahil olmak üzere toplam uzunluğu, bir iç çapı. Tahrik tüp ve EVOC teçhizat toplamları 2,71 m. uzunluğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

  1. Derleme yordamları sırasında çelik toe iş ayakkabıları ve laboratuvar ceket giymek.
  2. Ekle iki hizalama çubukları iki cıvata deliklerden Çıkış flanş yatay düzlemde buldum. Çıkış flanş ve ex vivo organ kültür (EVOC) teçhizat arasında oturur sonuna hizalama çubukları üzerinde Nitril kauçuk conta örtü yerleştirin.
    Not: EVOC teçhizat 35 mm Petri yemekler ( şekil 2A) ile kullanılmak üzere özel olarak tasarlanmış bir fikstür mı.
  3. EVOC teçhizat şok tüpü Çıkış flanş petri kabına tutar bölümüne kendi tabanında yer alır böylece düzgün odaklı olduğunu sağlanması hizalama çubukları üzerinde fikstür kaydırarak takın.
  4. Dört M24 civatalar ve contalar kalan deliklere yerleştirin. Flanş dokundukları fındık konumlandırın.
  5. Sıkıca somun ve civata sırayla çapraz olarak simetrik bir şekilde görsel olarak EVOC teçhizat ve şok tüpü başarılı bir şekilde hizalanmış var. kontrol ederken tutturmak.
  6. EVOC teçhizat için bir basınç detektörler eklemek ve bir sensör kablo kullanarak geçerli kaynak bağlayın. Sonra bir BNC kablo kullanarak bağlan geçerli kaynak için osiloskop.
  7. Tüm vanalar yayın ve şok Tube akıșı emin olun kapalı. Yapılı-içinde dış basınçlı hava satırı açın ve el ile basınç regülatörü solenoid 2.5 bara için şarj etmek için saat yönünde çevir
  8. 180 ° saat yönünün tersine çevirerek sıkıştırılmış gaz şişesi üzerinde emniyet valfi açın.
  9. Yavaş yavaş gaz şişesi üzerinde yaklaşık 15 bar basınç artmaya saat yönünde bulunan basınç regülatörü açmak
    Not: Bu regülatör ayar noktası biraz yüksek deneyde kullanılacak en kalın diyafram baskısı patlama olması.
  10. Plastik bir tabaka 0,125 mm kalınlığında 10 cm x 10 cm kareler halinde keserek Diyaframlar hazırlayın.
    Not: Diyafram kalınlığı (daha kalın bir diyafram ile daha büyük bir pik basınç; bir şok dalgası neden olur Yani, şok dalgasının en yüksek basınç değiştirmeyi patlama basınç ile ilişkili Tablo 1).
< masa fo:keep-together.within-sayfa = "1" > Mylar diyafram boyutları (cm) patlama basıncı (bar) sensör 3 basınç aralığı (kPa) 10 x 10 x 0.023 2 ± 0.2 47 ± 7.5 10 x 10 x 0.050 4 ± 0.2 72 ± 7,5 10 x 10 x 0.125 9.5 ± 0.5 127 ± 12,5 < /t mümkün >

Tablo 1: Patlama basınç ilgili diyafram kalınlığı ve en yüksek basınç.

  1. oluşturmak kolları bant dışında onları üst ve alt kısımlarında diyafram saptamak ve onları dikkatle makat odası tarafından diyafram açık küçük flanş yanında konumlandırmak için kullanın. Diyafram makat kapatmadan önce düz ve doğru şekilde yerleştirilmiş olduğundan emin olun.
  2. Bu dört M24 somunlar kullanarak güvenli. Sıkıca somun ve civata sırayla çapraz olarak simetrik bir biçimde tutturmak.

3. Sadece hücreleri şok dalgası pozlama için önceden hazırlanması

  1. hazırla ultraviyole sterilizasyon gerçekleştirerek bir doku laminar akış hood. Dezenfektan bir çözüm ve % 70 etanol ile temizleyin. Tüm öğeleri işleme önceki için/post-shock hücreleri için gerekli dalga pozlama ve yer onları içinde steril hood toplamak.
    Not: Bu taze orta, yapışkanlı gaz geçirgen membranlar, steril makas, Pipetler ve pipet içerir ipuçları.
  2. Bir 90 mm Petri kabına steril hood için kuluçka makinesi üç deneysel örnekleri içeren transfer.
  3. Yapışkan bir gaz geçirgen membran sac (Tablo reçetesi görmek) altı kareler halinde, öyle ki her bir 35 mm Petri kabına üst kapak kadar büyük kesim.
  4. 35 mm Petri kabına ortamından Aspire edin, kapağı bir tarafına yerleştirin ve kapağı membran çanağı kenarı arasındaki sıkı bir mühür olduğunu kontrol ettikten iki yapıştırıcı gaz geçirgen membranlar bölümleri ile.
  5. Örnek EVOC teçhizat için transfer ve çanak üst şok tüpü iç tabanı ile hizalanacak biçimde fikstür tabanına güvenli.

4. Şok tüpü işlem

  1. kulak savunucuları, göz gözlük, Emanet çizme ve laboratuvar ceket giymek ne zaman şok tüp sistemi basınçlandırma.
  2. Akış kontrol düğmesi regülatör üzerinde saat yönünde, gaz basınçlı hava silindir şok tüp bağlama esnek hortum içine akmasına izin çevir.
  3. Kontrol panelinin alt kısmında, ya seçin " Çift Kişilik makat " giriş için bir kısa süreli şok wave veya " sürücü tüp " giriş için bir yüksek dalga süre.
  4. DC güç kaynağı ve osiloskop dalga formu verisini almak için geçiş. Nokta kayıt uzunluğu 1 m s/osiloskop örnekleme hızı 50.0 MS için ayarlanır. 50 aralığını ayarlamak için ateş 2 bar ve 100 mV 4 bara yukarıda için mV
    5. Denetim Masası karşısındaki duvarda anahtarını kullanarak güvenlik ışıkları açmak
  5. .
    Not: Bu şok tüpü şarj ederken odaya girmek için diğer araştırmacılar söyler.
    6. Solenoid kapatmak için solenoid kontrol kutusunu açmak açmak
  6. .
    Not: Bu güvenlik özelliği sistemi tahsil çift makat odası üzerinde bulunan bir vana kapatır.
  7. Kontrol panelinde, yavaş yavaş açık akış denetimi topuzu yavaş yavaş sıkıştırma odası içindeki basıncı artırmak için saat yönünün tersine çevirerek. Denetim Masası görüntü kullanarak basınç izlemek.
    8. Diyafram Basınçı bir kez
  8. ulaşıldığında, diyafram rüptürü ve bir " bang " duymuş olacak. Hızlı Akış denetimi düğmeyi çevirerek kapatın.
    Not: Hücre örnek üzerinde ve tüp sonu dışarı aşağı tüp şok dalgası seyahat edecek.
  9. Bobini solenoid kontrol kutusunu kapama çevirerek açın ve (Denetim Masası'nı karşısında duvardaki anahtarını kullanarak) Emanet ışığı kapatın.
  10. Hücre örnek steril hood transfer, yapışkanlı gaz geçirgen membranlar kaldırmak ve çanak taze büyüme orta 2 mL ile doldurulması. Hücreleri hemen değerlendirme için adım 5'te açıklandığı gibi kullanılabilir veya daha uzun vadeli çalışmalar için kuluçka döndü.

5. Hücre canlılığı

şok dalgası pozlama bir Redoks göstergesi tahlil ve floresan görüntüleme canlı ve ölü hücrelerin birleşimini kullanarak takip
  1. değerlendirin hücre canlılığı.
    Not: floresan görüntüleme için hücreleri steril cam coverslips 1 kısmı sırasında numaralı seribaşı gerekir: hücre kültürü ve örnek hazırlama. Bunlar-ebilmek var olmak konulmak içinde 35-mm petri yemekler.
  2. Transfer 200 µL Redoks indictor reaktif (Tablo reçetesi görmek) doğrudan sonra onları orta sonrası şok 2 mL ile dolum deneysel için her yemeğin dalga pozlama. 4 h için standart kültür koşulları, kuluçkaya
  3. Her yemek için transfer (bir karanlık steril mahallede) 2 x 100 µL aliquots ya da bir siyah veya floresan veya Absorbans viability değerlendirmek için kullanılıp kullanılmayacağı bağlı olarak 96-şey plaka temizleyin.
  4. Ve doğru filtre ile donatılmış bir uygun plaka okuyucu 96-şey plaka transfer floresan veya 570 için uyarma bantları 530ex/590em kullanılarak okunan Absorbans için 600 nm başvuru ile birlikte, nm. İhracat yapmak ve verileri kurtarmak.
    5. Bu hücre canlılığı içinde bir damla göstergesi olabilir gibi
  5. şok dalgası maruz örnekleri ve denetimleri, Sigara maruz arasında herhangi bir fark tanımlamak için veri analiz.
    Not: Bir negatif kontrol de deneysel tasarım dahil edilmelidir. Ayrıca, standart bir eğri ilişkilendirme hücre sayıları hesaplamak için kullanılabilir.
  6. Redoks göstergesi reaktif içeren orta Aspire edin. Eski yerine koymak o ile 2 mL taze orta ve hücreleri 24 h için standart kültür koşulları, kuluçkaya
  7. Gerektiği gibi ikinci bir canlılık süresi noktası elde etmek için yukarıdaki adımları tekrarlayın.
  8. İçin canlı ve ölü hücreleri floresan düşsel, orta Aspire edin ve PBS 1 mL hücrelerde iki kez yıkayın. Transfer 100 µL tam reaktif görüntülemede bulundu (Tablo reçetesi görmek) her örnek için kit ve 15 dakika süreyle ışık korunuyorsunuz oda sıcaklığında kuluçkaya
  9. Reaktif Aspire edin ve 1 mL PBS kullanarak bir kez yıkayın. İyi noktası forseps kullanarak, dikkatle coverslip 35 mm çanak çıkarın ve aşağı doğru bir cam mikroskobu slayt üzerine yerleştirin.
  10. Edinme görüntüler (10 X objektif lens, 0.50 sayısal diyafram) floresan mikroskop kullanarak her örnek için doğru uyarma ve emisyon filtreleri ile donatılmış (ex / em 488 nm/515 nm ve 570 nm/602 nm).
    Not: Canlı hücreleri yoğun, üniforma, yeşil Floresans yayarlar. Ölü ya da ölen hücreleri güvenliği aşılan bir hücresel membran ile will alımını ölü kiti bileşeni, kırmızı Floresans emisyon sonuçlanan, ağırlıklı olarak hücre nükleer bölgede bulundu.
  11. Görüntü analizi yazılımı ya el ile veya otomatik olarak saymak canlı ve ölü hücreleri her görüntüden kullanın.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yukarıda açıklanan yöntemi kullanarak, bir monolayer yetiştirilen hücrelerin nüsha şok şok tüpü (şekil 2B) kullanılarak oluşturulan dalgalarına maruz bırakıldı. İşaretleyicileri hücre canlılık değerlendirildi. Redoks göstergesi tahlil kullanarak, uygulama 127 kPa şok dalgasının canlılığı dermal papilla hücre kültürü (şekil 3) 24 saat sonra kontrollere göre önemli ölçüde azaltmak mümkün bulundu. Bir şok dalgası ≤72 kPa uygulanması canlılığı azaltmak değil. Bu gözlemler desteklemek için bir floresan görüntü tahlil fluorescently kırmızı ya da yeşil fluorophores, canlı veya ölü hücrelerle sırasıyla, etiketleme yetenekli kullanıldı. Biyolojik REPLICATE başına 13 floresan görüntü canlı ve ölü hücrelerden miktar hücre canlılığı o zaman kontrolü (şekil 4) göre 127 kPa şok dalgası maruz bir azalma gösterdi. İstatistiksel analiz Tukey'nın birden fazla karşılaştırma testi, p ile ardından bir tek yönlü ANOVA kullanarak gerçekleştirildiği < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı sayılır. Örnek boyutu grubu başına 9 redox göstergesi tahlil için ve 39 kantitatif floresan görüntüleme analizi için toplamı.

figure-results-1
Şekil 3 : Redoks göstergesi tahlil veriler zaman tabii gösteren hücre canlılığı şok dalgası maruz kaldıktan sonra. Önemli ölçüde daha az sayıda hücre grubunda tedavi edilmezse denetimine göre 127-kPa şok dalgası maruz 24 saat sonra tespit edildi. %2 30-s tedaviyle oluşan negatif kontrol dezenfektan T0 ve 24 h diğer gruplara göre önemli ölçüde daha az hücreleri gösterdi (tablo malzemeleri görmek). Her çubuk 1 ortalama ± standart sapma (SD); temsil eder. biyolojik çoğaltır, N = 3; Teknik çoğaltır, n = 3. p = < 0,0001. * p = < 0,05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

figure-results-2
Şekil 4 : Floresan görüntüleme. (A)nicel veriler 24 saat sonrası şok dalgası pozlama floresan mikroskop kullanarak yakalanan canlı ve ölü hücrelerin floresan görüntülerden toplandı. Önemli ölçüde daha az hücrelerin 127 kPa gözlendi (demek 93.42 =) şok dalgası maruz örnek 47 kPa karşılaştırıldığında (demek 98.18 =), 72 kPa (demek 98.87 =) ve kontrol grupları (yani 99.10 =). Hiçbir hücrelerin negatif kontrol grubu 24 saat sonra tespit edildi (yani = 0). (B) temsilcisi Floresans görüntüler. Kırmızı ölü hücreleri gösterir iken yeşil canlı hücreleri gösterir. Her kutu arsa Tukey bıyık ile alt ve üst Dörttebirlikler gösterir; biyolojik çoğaltır, N = 3; Teknik çoğaltır, n = 13. p = < 0,0001. Ölçek çubuğu 300 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Birincil yaralanmaları patlama olaylara maruz elde henüz tam olarak anlaşılır değil. Belirlenmesi ve travmatik beyin hasarı3,gibi patlama kaynaklı yaralanmaları tetiklemek mekanizmaları anlama4 ve heterotopik ossifikasyon6,7, geliştirmek için önemli ilk adım vardır profilaksi etkili yöntemleri. Bu hedefe ulaşmak yardımcı olmak için deneysel sistemleri bir dizi patlama olay maruz kalma11,12,13,14,18,19 çoğaltmak için geliştirilmiştir . Açıklanan teknik burada şok tüpü donatımı (Şekil 2) şok dalgaları baskıların tüm vücut (Yani, kemirgen), doku veya hücre örnekleri bir mesafeden atış yeteneğine sahip kullanır. Hasar mekanizmaları1,2bir dizi ile aynı anda ortaya çıkabilir gibi tüm dokular yerine tek tek hücre tipleri yüklemek için ayrı hücresel yanıt ayrıştırma yeteneği sağlıyor. Örneğin, travmatik modellemek için beyin hasarı, sinir hücreleri ve astrocytes, tek hücre türleri değerlendirilmesi hücre özgü yaralanma tanımlanması için izin verebilirsiniz. Ayrıca, Bütün organ yanıt beyin dokusu kullanarak tespit edilebilir. Tek hücre türleri ve doku örnekleri değere sahip ve farklı bilgiler verebilir. Çift-yarık veya sürücü-tüp giriş seçerek şok oluşturmak için basınçlı hava miktarını değiştirmek mümkündür. Bu şok dalgası süresi denetler. Diyafram malzeme ve kalınlık en yüksek basınç25değiştirmek için değiştirmek için başka bir olasılık olabilir.

Başka bir faktör dikkate ne zaman örnek konut mevcut sistemi açıklanan EVOC sondaj platformu üzerinde bulduğu gibi şok tüpü çıkış yakınında mevcut olabilir müdahale sonunda etkileri vardır. Chandra vd. sıkıştırma tahrik şok tüpü farklı konumlarda bulunan ve bir yerde içinde şok tüpü15derin Friedlander dalga formu en iyi temsil edildi bulundu patlama dalgası profilleri baktı. Kuriakose vd. Ayrıca ikincil örnek yüklenmesini okudu ve şok tüpü sonunda sonuna plaka yerleşimini istenmeyen yansıyan dalgalar16ortadan kaldırmak mümkün olduğunu fark etti. Verileri dikkate alınarak, bu yayınları15,16' da, bu makalede açıklanan şok tüp sistemi geliştirmek için gelecekteki değişiklikler tahrik tüp içinde daha derin bir yerde EVOC teçhizat yerleşimini dahil bulundu veya, Alternatif olarak, bir bitiş plaka üzerinde şok tüpü dahil. Açıklanan yöntemi sınırlamaları nispeten düşük akış verimi, örnekler içerebilir. Tek bir kullanıcı şok tüp bir çıktısını, güvenli bir şekilde çalışabilir saat başına 6-8 örnek. Şu anda, sistem çapında tek 35-mm petri yemekler kullanılan tasarlanmıştır. Bu nedenle, birden çok grubu ve biyolojik çoğaltır içeren daha büyük deneyler elde etmek zor olabilir.

Bu yöntemleri makale nasıl canlılığı yapisan dermal papilla hücre tek bir şok dalgası maruz etkilendi gösterir. Bir kısa süreli şok dalgası (< 10 ms) ≤72 kPa (şekil 3 ve şekil 4) denetimine göre canlılığı etkilemedi. Buna ek olarak, bir şok dalgası 127 kPa, önemli bir düşüş canlılığı, 24 saat sonrası patlama, içinde bir Redoks göstergesi tahlil (şekil 3) ve floresan görüntü analizi (şekil 4) tarafından gösterildiği gibi teşvik. Miller vd. rapor benzer bir azalma hücre canlılığı sıçan organotypic Hipokampal dilim kültürlerde ne zaman hücreleri bir ya da maruz kaldılar bir 147 kPa veya 278 kPa şok dalgası bir açık uçlu, helyum odaklı şok tüpü14kullanarak. Buna ek olarak, VandeVord ve ark. fare astrocytes için bir kısa süreli aşırı basınç-maruz canlılığı üzerinde bir etkisi olduğunu bildirdiler > 200 kPa, her ne kadar bir barochamber ziyade bir şok tüpü18kullanıldı. Bu karmaşık stres dalgalar bünyesinde, bu nedenle yükleme doğası doku veya hücre mekanik özelliklerini son derece bağımlı hale oluşturur, ancak dış basınç patlama dalgası üzerinde bağımlı olduğunu belirtmek. Hücresel olaylarına yanıt olarak patlama ek karakterizasyon çalışmaları gereklidir. Ayrıca, şok dalgası pozlama hücresel düzeyde Bu teknikte gösterildiği tarafından değerlendirilmesi, biyolojik yanıt yolları veya epigenetik değişiklikleri, sinyal pertürbasyon gibi yaralanmalara karşı tetiklenen olabilir tespit ve daha da araştırdı.

Sonuç olarak, bu iş bir paslanmaz çelik şok tüpü ve birincil hücre kültürleri dahil etmek için değiştirilmiş bir EVOC teçhizat kullanımını açıklar. Şok dalgaları baskıların bir mesafeden oluşturulan ve bir patlama dalgası maruz etkileri çoğaltmak için canlı hücreleri üzerine yayılır. Bu iletişim kuralı hücre canlılığı değerlendirmek gösterilmiştir, ama daha uzun vadeli değişiklikleri tek tek hücre tipleri için de okudu. İleriye, biz karmaşık şok dalgaları, farklı hücre tipleri, birincil yaralanmaları patlama kaynaklı anlayışımızı sürdürmek amacıyla temin fark etkilerini değerlendirmek için plan.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar hiçbir rakip mali ilgi alanlarına sahip.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Royal British Legion Merkezi finansal destek için patlama yaralanma çalışmalar HA ve tıbbi araştırma Konseyi (M01858X/1) kah için finansman için kabul etmek istiyoruz.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
MEM & alpha;, nükleositlerThermoFisher22571020
Fetal Sığır Serumu, sertifikalı, ABD menşeiliThermoFisher16000044Takviyesi ile tam büyüme ortamı oluşturur.
Dulbecco' s Fosfat Tamponlu SalinSigma AldrichD8537
Penisilin-Streptomisin ThermoFisher15070-063Tam büyüme ortamı oluşturmak için takviye
Tripsin-EDTA (% 0.5), fenol kırmızısı yokThermoFisher15400-054Kullanmadan önce 10'da 1 oranında seyreltin.
CytoOne T-75 Şişesi, TC ile Muamele Edilmiş, HavalandırmalıStarlabCC7682-4875
TC Çanak (PS) 35 mm, 8,5 cm2Üçlü KırmızıTCD010035
Petri kabı (PS) 90 x 14,2 mm havalandırmasızVWR UK391-0453 
Gaz Geçirgen Yapışkan Plaka ContalarıThermoFisherAB-0718
CANLI/ÖLÜ Hücre Görüntüleme Kiti (488/570)ThermoFisherR37601
Alamarblue hücre canlılığı reaktifiFisher Scientific13494309
Virkon tabletleriVWR UK115-0020Canlılık kontrol reaktifi olarak %2'lik çözelti oluşturmak için kullanın.
Dumont forsepsSurgicalTools11295-10Petri kabından lamelleri çıkarmak için kullanın.
Kapak camı, kareVWR UK631-0125
Mikroskop slaytlarıVWR UK631-1553
96 Kuyu plakası, katı siyahAppletonWoodsCC760Floresan ölçümleri için kullanılacak plaka.
96 Kuyulu plaka, şeffaf, (PS)VWR UK734-1799Absorbans ölçümleri için kullanılacak plaka.
Leica DMi1 Kamera standı kıyafetiLeica MicrosystemsHücre kültürü için kullanılan optik mikroskop.
Zeiss PALM MicroBeam Lazer Yakalama MikrodiskesiCANLI/ÖLÜ görüntüleme için kullanılan Zeiss Floresan mikroskobu.
EnVision Çok Etiketli OkuyucuPerkinElmer2104-0010AFloresan / absorbans okumaları için kullanılacak plaka okuyucu.
Mylar Elektrik & Kimyasal İzolasyon Filmi, 304 mm x 200 mm x 0.023 mm RS Bileşenleri785-0782Şok tüpü diyaframı oluşturmak için kullanın.
Mylar Elektrik & Kimyasal İzolasyon Filmi, 304 mm x 200 mm x 0,05 mm RS Bileşenleri785-0786Şok tüpü diyaframı oluşturmak için kullanın.
Mylar Elektrik & Kimyasal İzolasyon Filmi, 304 mm x 200 mm x 0.125 mm RS Bileşenleri785-0798Şok tüpü diyaframı oluşturmak için kullanın.
Akım kaynağı güç ünitesiDytran Intruments Inc.2300V1 sensör için 4103C Güç kaynağı.
IEPE Basınç SensörüDytran Intruments Inc.2300V1Şok tüpü üzerinde bulunan basınç sensörü.
Dijital Fosfor OsiloskopuTektronixDPO 4104BSensör 2300V1 verilerini toplamak ve kaydetmek için kullanın.
.

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Proud, W. G. The physical basis of explosion and blast injury processes. J R Army Med Corps. 159, Suppl 1 4-9 (2013).
  2. Born, C. T. Blast Trauma: The Fourth Weapon of Mass Destruction. Scand J of Surg. 94 (4), 279-285 (2005).
  3. Kocsis, J. D., Tessler, A. Pathology of blast-related brain injury. J Rehabil Res Dev. 46 (6), 667-671 (2009).
  4. Bass, C. R., et al. Brain Injuries from Blast. Ann Biomed Eng. 40 (1), 185-202 (2012).
  5. Cernak, I. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. Kobeissy, F. H. , (2015).
  6. Alfieri, K. A., Forsberg, J. A., Potter, B. K. Blast injuries and heterotopic ossification. Bone Joint Res. 1 (8), 174-179 (2012).
  7. Potter, B. K., Burns, T. C., Lacap, A. P., Granville, R. R., Gajewski, D. A. Heterotopic Ossification Following Traumatic and Combat-Related Amputations. Prevalence, Risk Factors, and Preliminary Results of Excision. J Bone Joint Surg Am. 89 (3), 476-486 (2007).
  8. Sasser, S. M., Sattin, R. W., Hunt, R. C., Krohmer, J. Blast Lung Injury. Prehosp Emerg Care. 10 (2), 165-172 (2006).
  9. Cho, S. -I., et al. Mechanisms of Hearing Loss after Blast Injury to the Ear. PLoS ONE. 8 (7), 67618(2013).
  10. Bull, M. A., Clasper, J., Mahoney, P. Blast Injury Science and Engineering: A Guide for Clinicians and Researchers. , Springer. (2016).
  11. Arun, P., et al. Studies on blast traumatic brain injury using in-vitro model with shock tube. Neuroreport. 22 (8), 379-384 (2011).
  12. Ahlers, S. T., et al. Assessment of the effects of acute and repeated exposure to blast overpressure in rodents: toward a greater understanding of blast and the potential ramifications for injury in humans exposed to blast. Front Neurol. 3, 32(2012).
  13. Polfer, E. M., et al. The development of a rat model to investigate the formation of blast-related post-traumatic heterotopic ossification. Bone Joint J. 97 (4), 572-576 (2015).
  14. Miller, A. P., et al. Effects of Blast Overpressure on Neurons and Glial Cells in Rat Organotypic Hippocampal Slice Cultures. Front Neurol. 6, 20(2015).
  15. Chandra, N., et al. Evolution of blast wave profiles in simulated air blasts: experiment and computational modeling. Shock Waves. 22 (5), 403-415 (2012).
  16. Kuriakose, M., et al. Tailoring the Blast Exposure Conditions in the Shock Tube for Generating Pure, Primary Shock Waves: The End Plate Facilitates Elimination of Secondary Loading of the Specimen. PLoS ONE. 11 (9), 0161597(2016).
  17. Reneer, D. V., et al. A Multi-Mode Shock Tube for Investigation of Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 28 (1), 95-104 (2011).
  18. VandeVord, P. J., et al. Up-regulation of reactivity and survival genes in astrocytes after exposure to short duration overpressure. Neurosci Lett. 434 (3), 247-252 (2008).
  19. Kane, M. J., et al. Altered gene expression in cultured microglia in response to simulated blast overpressure: Possible role of pulse duration. Neurosci Lett. 522 (1), 47-51 (2012).
  20. Nienaber, M., Lee, J. S., Feng, R., Lim, J. Y. Impulsive pressurization of neuronal cells for traumatic brain injury study. J Vis Exp. (56), (2011).
  21. Zhang, J., et al. Transcriptional Profiling in Rat Hair Follicles following Simulated Blast Insult: A New Diagnostic Tool for Traumatic Brain Injury. PLoS ONE. 9 (8), 104518(2014).
  22. Bo, C., et al. Cellular characterization of compression-induceddamage in live biological samples. AIP Conf Proc. 1426 (1), 153-156 (2012).
  23. Tannous, O., Griffith, C., O'Toole, R. V., Pellegrini, V. D. Heterotopic ossification after extremity blast amputation in a Sprague-Dawley rat animal model. J Orthop Trauma. 25 (8), 506-510 (2011).
  24. Chen, Y. C., Smith, D. H., Meaney, D. F. In-Vitro Approaches for Studying Blast-Induced Traumatic Brain Injury. J Neurotrauma. 26 (6), 861-876 (2009).
  25. Nguyen, T. T. N., Wilgeroth, J. M., Proud, W. G. Controlling blast wave generation in a shock tube for biological applications. JPCS. 500 (14), 142025(2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Blast EffectsShock TubeCell ViabilityRedox Indicator AssayFluorescent ImagingPrimary CellsShock Wave ExposureCell CulturePressure TransducerOscilloscope

Related Articles