Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

Xavier Gallart-Palau; Aida Serra; Siu Kwan Sze

doi:10.3791/55626

Method Article

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

DOI:

10.3791/55626

⸱

April 9th, 2017

Xavier Gallart-Palau*¹ , Aida Serra*¹ , Siu Kwan Sze¹

¹Division of Structural Biology and Biochemistry, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometresi (LERLIC-MS / MS) yöntemi bir adım adım protokol mevcut. Bu av tüfeği proteomik tarafından glutamin ve asparajin deamidasyon izoformlarının ilk kez ölçümü ve karakterizasyonu için sağlayan bir roman yöntemdir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Protein deamidasyon Karakterizasyonu İnsan patoloji ve diğer biyokimyasal bağlamlarda bu protein dönüşüm sonrası modifikasyonu (PTM) rolü (ler) i ve potansiyeli deşifre zorunludur. Protein deamidasyon karakterizasyonu gerçekleştirmek için, yakın zamanda glutamin (Gln), ve asparajin (Asn) izoformu ayırabilen yeni bir uzun uzunlukta elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi-tandem kütle spektrometrisi (LERLIC-MS / MS) yöntemi geliştirdik son derece karmaşık biyolojik örnekler model bileşiklerinden deamidasyon ürünleri. LERLIC-MS / MS, bu nedenle, bir, Gln, deamidasyon izoform ayrılması ve ölçümü için, ilk tüfek proteomik stratejisi. Ayrıca burada açıklanan örnek işleme protokolü LERLIC-MS / MS ile karakterizasyonu sağlayan süksinimid ara stabilize olduğu, bir yenilik olarak, göstermektedir. Bu video makalede gösterildiği gibi LERLIC-MS / MS uygulanması halen bilinmeyen aydınlatmak için yardımcı olabilirProtein deamidasyon n moleküler diziler. Buna ek olarak, LERLIC-MS / MS belirgin biyolojik kökenden deamidasyonu kapsayan enzimatik reaksiyonların daha iyi anlaşılmasını sağlar.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deamidasyonu bir protein dönüşüm sonrası modifikasyonu asparagin (Asn) ve / veya glutamin (Gln) kalıntıları ¹ modifikasyonu yoluyla protein omurgasına bir negatif yük getirmektedir (PTM) 'dir. ^2: 1 oranında Asn kalıntısının etki ederken bu değişiklik, bir ortak 3 de izomerik ürünleri isoaspartic asit (IsoAsp) ve n -aspartic asit (Asp) oluşturur. Rağmen, bu oran tamir enzimi, L-isoaspartyl metiltransferaz (PIMT) ^{^3,} ⁴ müdahalesi ile değiştirilebilir. Benzer şekilde, Gln kalıntısının deamidasyon beklenen 1 de izomer gama-glutamik asit (γ-Glu) ve alfa-g....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Uzun uzunlukta Anyon değişim ambalaj (lax) Kılcal Sütun

(Not: lax kolon evde bu protokolde tarif olarak paketlenmiş, lax sütunlar da ticari olarak temin edilebilir olmasına rağmen, daha fazla ayrıntı için Materyaller ve Reaktifler: İçindekiler'i bakınız).

Bulamaç hazırlamak üzere tamponu (Tablo 1) ambalaj 3.5 mL zayıf anyon değiştirme ambalaj malzemesi, 50 mg süspanse edin.
bir dişi-dişi bağlantı parçası, bir ferule ve bir dişi somun ile - kılcal sütun (200 um iç çap (ID) boru 50 cm uzunluğunda) ucunu birleştirin. dişi-erkek uydurma içindeki bir ekran 1/16" OD....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gln ve Asn kalıntısının deamidasyonu birçok kronik ve ölümcül hastalıklarda ¹⁴ içine dahil edilen bir dejeneratif protein modifikasyonu (DPM) olarak kabul edilir. PTM insan vücudunun ve benzer biyolojik arka ^{^1,} ^15, antikorlar ve diğer moleküllerin yarı-ömrü ve parçalayıcı durumları tahmin edebilirsiniz gösterilmiştir. Protein deamidasyon önemi, aslında, dolayısıyla bu modifikasyon ^{^16.......}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu video yazıda LERLIC-MS / MS ^3'ün bir adım adım protokol sunmak için bir yöntem derinlemesine karakterizasyonunun ve doğru bir şekilde, protein deamidasyonu ve bu protein modifikasyonu ilgili enzimatik işlemlerin kapsamını tespit etmek. LERLIC-MS / MS elektrostatik itme-hidrofilik interaksiyon kromatografisi (ERLIC) ²⁷ ilkesi altında uzun bir uzunlukta (50 sm) lax kullanımına dayanmaktadır. Çalışmamızda ^3'te gösterildiği gibi uzun uzunlukt.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Singapur (NMRC-OF-IRG-0003-2016) ve NTU-NHG Araştırma Grant Yaşlanma Ulusal Tıbbi Araştırma Konseyi (: Bu çalışma kısmen Eğitim Singapur Bakanlığının (Grant ARC9 / 15 Tier 2) hibe ile desteklenmiştir Grant ARG / 14017). Biz nazik bu çalışma mümkün kılan ambalaj materyalleri sağlayan Dr. Andrew Alpert ve PolyLC ekibine şükranlarımızı ve en içten teşekkürlerimi ifade etmek istiyorum.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number
PolyCAT 3 ve mikro; m 100-&Arama; (dökme malzeme)	PolyLC A.Ş.	Özel sipariş
Uzun uzunlukta iyon değiştirici kılcal kolon 50 cm - 200 &mikro; m Kimlik	PolyLC A.Ş.	Özel sipariş
PEEKsil Boru 1/16 "OD x 200 & m ID x 50 cm uzunluk	Trajan Scientific Australia altında SGE Analitik Bilimi	620050
1/16 "OD boru için dişiden kadına bağlantı parçası	Upchurch Scientific	UPCHF-125
Mikroferule için dişi somun	Upchurch Scientific	UPCHP-416
Microferule	Upchurch Scientific	UPCHF-132
Basınçlı Bomba NanoBaume	Batı Sıvıları Mühendisliği	SP-400
Shimadzu Önemi UFLC sistem	Shimadzu	Prominence UFLC
Bullet Blender	Sonraki İlerleme	BBX24
Güvenli kilit tüpleri	Eppendorf	T9661-1000EA
Paslanmaz çelik boncuklar. 0,9 & ndash; 2,0 mm. 1 lb. Steril olmayan.	Sonraki Advance	SSB14B
Masa üstü santrifüj	Hettich Zentrifugen	Rotina 380 R
Standart Dijital Isıtmalı Sirkülasyon Banyosu, 120VAC	PolyScience 8006 6L	8006A11B
Sep-pack c18 tuz giderme kartuşu 50 mg	Sular	WAT020805
Vacumm yoğunlaştırıcı	Eppendorf	Konsantratör Plus Sistemi
Dionex UltiMate 3000 UHPLC	Dionex	UltiMate 3000 UHPLC
Orbitrap Elite kütle spektrometresi	Thermo Fisher Scientific Inc.	ORBITRAP ELITE
Michrom Termo Esir Sprey	Michrom-Bruker A.Ş.	TCSI-SS2
İnkübatör INCUCELL	MMM Grubu	INCUCELL111
Sıralama dereceli modifiye tripsin	Promega	V5111
Proteaz inhibitörü kokteyl tabletleri	Roche	11836170001 (ROCHE)
Fosfat tampon çözeltisi 10x (1x'e seyreltilmiş)	Sigma-Aldrich	P5493
Amonyum asetat	Sigma-Aldrich	A1542
Sodyum deoksikolat	Sigma-Aldrich	D6750
Dithiothreitol	Sigma-Aldrich	D0632
İyodoasetamid	Sigma-Aldrich	i6125
Formik asit	Sigma-Aldrich	F0507 (HONEYWELL)
Amonyum hidroksit	Sigma-Aldrich	338818 (HONEYWELL)
Asetonitril HPLC sınıfı	Sigma-Aldrich	675415
İzopropanol HPLC sınıfı	Sigma-Aldrich	675431
Su HPLC sınıfı	Sigma-Aldrich	14263

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hao, P., Adav, S. S., Gallart-Palau, X., Sze, S. K. Recent advances in mass spectrometric analysis of protein deamidation. Mass Spectrom Rev. , (2016).
Geiger, T., Clarke, S. Deamidation, isomeri....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Av tüfeği Proteomics derinlemesine Karakterizasyonu için LERLIC-MS / MS ve Glutamin ölçümü ve Asparajin deamidasyonu

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles