Yöntem makalesi

Fare pankreas diseksiyon histolojik analiz ve metabolik profil oluşturma

39.6K görüntüleme

⸱

DOI:

10.3791/55647

⸱

19 Ağustos 2017

 ,  ,  ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Miami University, 2College of Medicine, Central Michigan University

Bu makalede

Özet

Video bu makalede ayrıntılı bir gösteri diseksiyon histolojik analizi ve metabolik profil oluşturma için başarıyla bir fareden pankreas kaldırmak için gerekli yordamlar sağlar.

Özet

Biz pankreas belirli transkripsiyon faktörü, 1a cre-recombinase soruşturma edilmiştir; füme balığı-dur-lox-Kristen sıçan sarkomu, 12 kodon aspartik asit glisin (Ptf1acre / +; LSL-KrasG12D / +) fare zorlanma insan pankreas kanseri bir model olarak. Bizim mevcut çalışmalar amacı pankreas kanseri ilerleme roman metabolik biyolojik belirlemektir. İdrar, dışkı, kan ve pankreas dokusu özler yanı sıra pankreas kanseri ilerleme yerleştirmeye histolojik analizler metabolik profil oluşturma gerçekleştirdiniz. Fare pankreas insanlar gibi iyi tanımlanmış bir solid organ değil, ama oldukça kolayca bireyler ile fare iç anatomi yabancı veya az veya hiç deneyimi gerçekleştirme sahip bireyler tarafından tanımlanmış değildir havza dağıtılmış bir yumuşak doku fare organ diseksiyonu. Bu makalenin amacı ayrıntılı bir step-wise sağlamaktır diseksiyon tarafından fare pankreas kaldırma yeni başlayanlar Kılavuzu için görsel gösteri. Bu madde öğrenciler ve araştırmacılar yeni özellikle değerli diseksiyon metabolik profil oluşturma veya histolojik analizler için tarafından fare pankreas hasat gerektirir araştırma olmalıdır.

Giriş

Fare insan pankreas kanseri1,2önemli bir hayvan modeli olarak ortaya çıkmıştır. Ptf1a içindecre / +; LSI-KrasG12D / + fare modeli, sıçan sarkomu (K-Ras) onkogen pankreas İntraepitelyal Neoplazi (PanINs), bu ilerleme bilinen pankreasın prekanseröz lezyonlar inisiyasyon sonuçlanan pankreasın sadece aktif Kristen pankreas duktal Adenokanserine için genellikle PDACs3adlandırılır. Bu fare modeli sistemi insan pankreas kanseri4,5, PanINs hayat ve sık sık PDAC içinde ilerleme ilk beş ay içinde ortaya ek avantajı için en iyi mevcut hayvan modellerinden birini sağlayan bir Pankreas kanseri en sık 60-70 yaşın insanlarda ortaya çıkar, ancak yıl4,5, tek.

Pankreas diseksiyon Ptf1a dan tarafından çıkarılmasıcre / +; LSI-KrasG12D / + fareler çeşitli yaş itibariyle sağlar detaylı boyuna histolojik muayene pankreas kanseri gelişimi için en erken PanIN aşamaları ilerleme PDAC3,4 ' e değişen , 5. pankreas yaşları 5 ila 15 ay arasında değişen, hasat da kullanılabilir doku özleri pankreas4 metabolizması sağlıklı hastalıklı doku geçiş sırasında oluşan küresel değişiklikleri tanımlamak için hazırlamak için 6,7.

Bu yazı bir fare pankreas çekimi gerçekleştirmek için gereken adımları, tam bir görsel kılavuzu sunar ve daha fazla çözümleme için bir pankreas depolamak için yönergeler sağlar. Bu kılavuz-ecek var olmak aynı derecede değerli bireyler de dahil olmak üzere diğer pankreas Hastalıkları Araştırma tip ı diyabet ve özellikle öğrenciler ve araştırmacılar fare pankreas kullanarak hasat içeren araştırma için yeni yararlı olmalıdır diseksiyon metabolik profil oluşturma veya histolojik analizler için.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

videoda yürütülen ve aşağıda açıklanan yordamları kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (IACUC) Miami Üniversitesi'nde tarafından onaylanmış olan.

1. hazırlanması ve uyarıcı Test

  1. Ağımdaki iki farklı alanlara cerrahi işlem, ameliyat masasına ve sonrası operasyon Masası için. Her iki alanda tüm malzeme ve gerekli aletleri ile sahne. Bacalı bir başlık altında
    1. sahne işletim tablo. Yordamı sürekli ve engelsiz performansını sağlayan bir şekilde ekipman ile tablo düzenlemek.
    2. Ameliyat sonrası bir tablo aynı odada ve operasyonun ana tablo yakınındaki kurmak. Prosedür boyunca steril ortam olarak her iki tabloları korumak.
  2. Yer şu ameliyat masasında sağlar: bir cam kavanoz kapağı, bir 15 mL tüp, Cerrahi makas, % 70 etanol, iki köpük panoları, iki forseps, iki 1 mL 21 ölçer şırınga, iki 50 mL tüp, bir santrifüj tüpü bir sıkma şişe bir çift ile , bir kriyojenik şişe, dört cerrahi yastıkları, on iğne, sterilize mendil dispenser ve "Sharps" konteyner.
  3. Sonrası işlemi masaya aşağıdaki malzemeleri koyun: bir analitik denge, bir 4 L dewar sıvı azot, sığ geniş ağız dewar, kayan bir microtube raf, bir cerrahi makas çifti, iki forseps, dört kriyojenik şişeleri ve bir dispenser steril mendil.
  4. Doldurmak bir 50 mL ve bir 15 mL tüp % 75 birime formalin ile.
  5. Her köşede bir PIN kullanarak bir cerrahi pedi diseksiyon panosu olarak hizmet etmek bir yaklaşık 30 cm x 30 cm köpük kuruluna yapıştırmayın. Kalan dört pimleri işlem sırasında kullanın. Organları ameliyat sonrası tabloya aktarmak için cerrahi bir yastık ile daha küçük bir köpük tahta hazırlayın.
    Dikkat: Isoflurane (% 99.9) bir toksik kimyasal ve havalandırma mahallede Emanet atık anestezik gaz 8 atma gelen en yüksek düzeyde sağlamak için kullanılmalıdır. Araştırmacılar isoflurane kullanarak açık bırak yöntemi ile ilişkili riskleri hakkında daha fazla bilgi Taylor ve Mook 8 tarafından bir makalede bulunabilir.
  6. Cam kavanoz ve emmek isoflurane (% 99.9) birkaç damla ile bir cerrahi pedi yerleştirin ve fare isoflurane ile doğrudan temas önlemek için üst üzerinde bir kağıt havlu yer. Benzer şekilde, kalan boru hattı ve isoflurane birkaç damla ile ıslatın ve ek bir pad fare ve isoflurane arasında doğrudan temas önlemek için üst üzerinde yer için bir cerrahi pedi kullanın.
  7. Maksimum doldurana kadar hattı dewar ulaşıldığında sığ geniş ağız içine dökün sıvı nitrojen.
  8. Yer diseksiyon anestezi içine seçilmiş fare odası, Cam Kavanoz ile beraber batırılmış bir yastık bırakır ~ 1 dakika süreyle kapak ile örtülü isoflurane (% 99.9), Yani
    Not: Bu süre fare fare değişir. Fare bilinçsiz olduğunda, odasından çıkarın ve çalışma kartı üzerine yerleştirin.
    9. Ventral tarafı yukarı ve onun baş bilim adamı uzak işaret ile yalan söylüyor
  9. fare gelecek şekilde yönlendirin. Kafasının isoflurane (% 99.9) birkaç damla ile batırılmış bir cerrahi pedi ile kaplı tüp içine yerleştirin ve fare uyaranlara yanıt vermeyen olduğundan emin olmak için bir ayak çimdik tarafından bir uyarıcı testi gerçekleştirin.
    1. Bu sınama başarısız olursa ve fare ayak çimdik testine yanıt verir, adımları yineleyin 1.8.

2. İlk kesi, kalp ponksiyon ve ötenazi

  1. cerrahi köpük kartına fare ekstremitelerin Pin ve fare ile % 70 etanol ventral tarafına ıslak.
  2. Kürk/cilt üretral açılış yakınındaki Forseps ile pinch ve biraz yukarı doğru çekin. Bir kesi ile karın boşluğu üretral açılması orta hat üzerinden başlayıp çene Cerrahi makas ile kesme yapmak.
    1. İlk belgili tanımlık kesme başlangıç noktasının yakınını, kürk/deri bir taraftan Forseps ile tut ve başka bir kesi makas ile aşağı ve çapraz olarak doğru arka pençe yapmak.
    2. Bu şekilde karşı tarafta tekrarlayın.
      Not: Kürk/cilt daha geniş bir açıklık oluşturmanızı sıkıştırdık, ancak gerekli değildir.
  3. Kalp bulun ve kesesi çevresinde şırınga iğne tıkanmasını önlemek için kalp, kalp zarını kaldırın.
    1. Kalp zarını Forseps ile kavramak ve makasla kesti. Kalp ponksiyon dikkatli kalbi şırınga iğne ekleyerek gerçekleştirmek ve pistonu geri çekmek yavaş yavaş başlamak.
    2. Kalbin pompalama eylemi taklit ve çok hızlı çizim önlemek için iğne pistonu en uygun kan toplanması için kullanılmasını.
      Not: Genellikle 1 mL kan toplanabilir.
    3. Kan toplama işlemini tamamladıktan sonra kan santrifüj tüpü ve "Sharps" konteyner içine şırınga atmayın içine ortadan kaldırmak.
      4. Kalbi delik gerçekleştirildikten sonra
    4. kalp bağlanma ekleri kaldırarak ötenazi taşımak.
      Not: Bu yordam belirli bu çalışmada serum koleksiyonu için koagüle kan izin vermek için kalbi delik önce şırıngada Heparin, bir anti-koagulant eklenmedi. Araştırmacı plazma toplamak için kan pıhtılaşması önlemek isterseniz, ancak, heparin kalbi delik önce şırınga için eklenebilir.
  4. Çalışma Genotipleme fare gerektirir, bir bölümü Kulak makasla makasla kesme ve yer içine bir santrifüj tüpü genotip doğrulama için.

3. pankreas çıkarma

  1. bulun mide fare sol tarafında. Begin yavaşça (yırtılma önlemek için) pankreas mide ve oniki parmak bağırsağı ayıran iki forseps kullanarak.
    Not: mide ve bağırsak pankreas ayırma, o forseps pankreas dokusu organları uzak yol değil ezmek, veya pankreas Forseps ile gözyaşı hafifçe kullanılır çok önemlidir.
    1. Pankreas ince bağırsak değişir ve ileum bölümlerine ayırmak devam etmek ve son olarak gelen kalın bağırsak caecum.
  2. Caecum, forseps yeniden konumlandırmak ve pankreas boyunca kalan kolon rektum doğru ayrılması devam.
    Not: Bu noktada, bu kesmek ve kolon rektum hemen önceki bölgesine mide bölümü kaldırmak uygundur.
  3. Pankreas bulun ve dalak bağlı. Pankreas fareyi sağ tarafına doğru kaydırın. Pankreas ve göğüs boşluğuna arasında kalan bağlantı Forseps ile tam olarak pankreas ve dalak keşfedemiyoruz ayırmak için ayırmak.
  4. Pankreas kaldırmak ve sınav için dışarı yayılır. Tanıtım amaçlı pankreas bağlı dalak bırakın.
    1. Tümünü Kaldır bağ dokusu, pankreas şişman ve Mezenterik dokudan.
      Not: Bu doku daha beyaz renkte ve böylece kolayca ayırt edici renkte pembe pankreas dokusundan olabilir. Bütün pankreas kaldırılması gerekiyor, bu özellikle önemlidir. Örneğin, pankreas tartılır ve vücut ağırlığı için ya da hayvan grupları arasında karşılaştırıldığında gerekiyor. Ptf1a içinde cre / +; LSI-Kras G12D / + fare modeli, özellikle içinde belgili tanımlık büyük ay, zor fibröz pankreas dokusu mevcut olabilir. Bu durumda, bağırsak tümör dokusunda titreşimli gibi dikkatli pankreas kaldırılması yürütülmelidir. İleri durumlarda, anormal dalak ve karaciğer dokusu de gözlenebilir.
  5. İsterseniz, diğer organlara bu noktada kaldırmak.

4. veri toplama ve depolama

  1. sonra ayıklama organların Ģunları alanının korunmasına ilişkin örnekler taşımak.
  2. Her organ tartmak ve onların anılan sıraya göre kriyojenik şişe koyun.
    Not: zekâh kitle her örnek, daha sonra başvurmak için herhangi bir usulsüzlük kaydedilmelidir.
  3. Bir kez organları tartılır vardır, ek dondurma için sıvı azot içine koyup.
  4. Buz gibi ek sonra-80 ° C'de organları uzun süreli depolama için mağaza.
  5. Yer depolanan formalin örnekleri tezgah üstüne gece ve ertesi sabah değiştirmek onların çözüm formalin % 70 etanol için.
    Not: Bu örnekler uzun süreli depolama için 4 ° C'de muhafaza edilmelidir.
  6. Uzun süreli depolama için kan ve kulak yumruk-80 ° C'de dondurmak. Kan serumu koleksiyonundan için kan koyulaştırmak için 30 dk sonra bu santrifüj kapasitesi izin. Bir pipet kullanarak serum bölümü kaldırmak ve sonra-80 ° C.

5. Clean Up

  1. Sanitize tüm diseksiyon araçları sterilizing mendil ile. Cap isoflurane ile kaplı tüp cerrahi pedi batırılmış. Köpük gemide cerrahi pedi taze bir cerrahi pedi ile değiştirin. Tesisin toplanan değil fare bölümlerini elden ' un hayvan elden çıkarma ilkesinin.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

Şekil 1 çalışma çevre bölgesi özetini gösterir ve Şekil 2 post işlem alanı gösterir. Süre bu ayar donanımları en az miktarda sağlar ve evreleme, bireylerin bu bireysel gereksinimlerinizi en iyi karşılayacak şekilde değiştirmek tercih edebilir. Protokol deneme belirli ihtiyaçlarına göre optimize edilmelidir. Bu yordamı uygun euthanization9gerektiren bir fare hayat sonlandıran bir şekilde yürütülmektedir. Ar...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

Mevcut yöntemler açısından önemi
Fare diseksiyonlarının resmi olmayan diğer videolar var iken, ilk profesyonel kalitede video bu makale sağlar, akran gözden, görsel gösteri tüm çıkış için gerekli ve fare pankreas diseksiyon10 tarafından hasat ayrıntılı adımlar . Metabolik aktivite ve insülin için ana bir organ olan pankreas ile üretim, diseksiyon ve pankreas hasat sağlayan fizyolojik özellikleri11korunması için. Pankreas izole ederek, ilerideki analizler...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

MAK kabul eder bu işten Ulusal Sağlık Enstitüleri için destek / Ulusal Kanser Enstitüsü vermek sayı - 1R15CA152985-01A1. Bu proje aynı zamanda Miami Üniversitesi lisans Araştırma Ödülü programı, Miami Üniversitesi doktora-lisans fırsatları burs programı ve Miami Üniversitesi yaz bilim programı tarafından desteklenmiştir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Cam Kavanoz Corning3140-150Videoda kullanılan cam kavanozun üretimi durdurulmuştur. Bu onun yerine geçiyor.
Cam Kavanoz KapağıCorning9985-150Videoda kullanılan cam kavanoz kapağı kullanımdan kaldırılmıştır. Bu onun yerine geçiyor.
15 mL Falcon TüpleriFisher Scientific339650
Cerrahi MakasFisher Scientific9201
Sıkma şişesi Fisher Scientific03-409-10DD
%100 EtanolFisher Scientific22-032-103
FormalinFisher Scientific245-684
Köpük LevhalarTherapak562908
ForsepsFisher Scientific200205SHN
1 mL 21G ŞırıngalarBD Biosciences309624
50 mL Falcon TüpleriFisher Scientific339652
2.0 mL Mikrosantrifüj Tüpleri Fisher Scientific02-681-258
Cerrahi PedlerFisher ScientificS67011
T-Pimleri Uzunluk:   2 " Ön Mağaza ÜrünleriX32T-05
Sterilizasyon MendilleriProfesyonel Tek Kullanımlık International Inc.Q85084
Keskin Uçlu KonteynerFisher Scientific14-827-122
Analitik TeraziMarshall ScientificME-AE200
4L DewarTaylor-Wharton4LD
Sığ Geniş Ağızlı DewarFisher ScientificF3087-V
Yüzer Mikrotüp RafıVWR60986-100
Kriyojenik Flakon 1.2 mL, SterilFisher Scientific10-500-25
İzotezi (İzofluran) Henry Schein Hayvan Sağlığı050033
Sıvı AzotWright KardeşlerNIT-60-XX
Fare Kras SuşuJackson LaboratuvarıOO8179
Fare Cre SuşuMMRRCOOO435-UNC

Kaynaklar

  1. Fesinmeyer, M. D., Austin, M. A., Li, C. I., De Roos, A. J., Bowen, D. J. Differences in Survival by Histologic Type of Pancreatic Cancer. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev. 14 (7), 1766-1773 (2005).
  2. Jackson-Grusby, L. Modeling cancer in mice. Oncogene. 21 (35), 5504-5514 (2002).
  3. Heid, I., et al. Early requirement of Rac1 in a mouse model of pancreatic cancer. Gastroenterology. 141 (2), 719-730 (2011).
  4. Hingorani, S. R., et al. Preinvasive and invasive ductal pancreatic cancer and its early detection in the mouse. Cancer cell. 4 (6), 437-450 (2003).
  5. Shi, C., et al. KRAS2 Mutations in Human Pancreatic Acinar-Ductal Metaplastic Lesions Are Limited to Those with PanIN Implications for the Human Pancreatic Cancer Cell of Origin. Mol Cancer Res. 7 (2), 230-236 (2009).
  6. LaConti, J. J., et al. Distinct serum metabolomics profiles associated with malignant progression in the KrasG12D mouse model of pancreatic ductal adenocarcinoma. BMC Genomics. 16 (1), 1-10 (2015).
  7. Ludwig, M. R., et al. Surveying the serologic proteome in a tissue-specific kras(G12D) knockin mouse model of pancreatic cancer. Proteomics. 16 (3), 516-531 (2016).
  8. Taylor, D. K., Mook, D. M. Isoflurane Waste Anesthetic Gas Concentrations Associated with the Open-Drop Method. J Am Assoc Lab Anim Sci. 48 (1), 61-64 (2009).
  9. Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. J Pharmacol Pharmacother. 1 (2), 87-93 (2010).
  10. Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nature Protocols. 4 (11), 1649-1652 (2009).
  11. Auer, H., et al. The effects of frozen tissue storage conditions on the integrity of RNA and protein. Biotech Histochem. 89 (7), 518-528 (2014).
  12. Ma, J., Leung, L. S. Limbic System Participates in Mediating the Effects of General Anesthetics. Neuropsychopharmacology. 31, 1177-1192 (2006).
  13. Ijichi, H., et al. Aggressive pancreatic ductal adenocarcinoma in mice caused by pancreas-specific blockade of transforming growth factor-β signaling in cooperation with active Kras expression. Genes Dev. 20 (22), 3147-3160 (2006).
  14. Abiatari, I., et al. Moesin-dependent cytoskeleton remodelling is associated with an anaplastic phenotype of pancreatic cancer. J Cell Mol Med. 14 (5), 1166-1179 (2010).
  15. Goodpaster, A. M., Romick-Rosendale, L. E., Kennedy, M. A. a Statistical significance analysis of nuclear magnetic resonance-based metabonomics data. Analytical biochemistry. 401, 134-143 (2010).
  16. Yadav, D., et al. Idiopathic Tumefactive Chronic Pancreatitis: Clinical Profile, Histology, and Natural History After Resection. Clin Gastroenterol Hepatol. 1 (2), 129-135 (2003).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Fare Pankreas DiseksiyonuTerminal Kan ToplamaKalp Ponksiyon Prosed rOrgan zolasyonuKriyot p SaklamaS v Azot ile ok DondurmaCerrahi K p k Levha ile SabitlemeSteril Mendillerle Sanitasyon

İlgili makaleler