Method Article

Embriyonik Anjiyojenezin Görselleştirilmesi ve Nicel Analizi

DOI:

10.3791/55652

⸱

May 25th, 2017

 , 
1Brain Korea 21 PLUS Project for Medical Science, Yonsei University College of Medicine, 2Department of Anatomy, Brain Research Institute, Yonsei University College of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, vaskülatürü görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını niceleştirmek için flüorüre dayalı bir yöntemi göstermektedir . İn vivo kardiyovasküler gelişimi incelemek için genetik ve / veya farmakolojik manipülasyonlardan sonra bir embriyonun kalp atımına floresan bir boya enjekte edildikten birkaç dakika sonra kan damarları görüntülenebilir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kan damarları vücuda oksijen ve besin sağlarlar ve vasküler ağ oluşumu sıkı gelişim kontrolü altındadır. Kan damarlarının etkili in vivo görselleştirilmesi ve karmaşıklığının güvenilir bir şekilde ölçülmesi, damar şebekesinin biyolojisi ve hastalığını anlamanın anahtarıdır. Burada, piyasada bulunan bir flüoresan boya, insan plazması asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein DiI kompleksi (DiI-AcLDL) ile kan damarlarını görselleştirmek ve Xenopus tropicalis'deki karmaşıklığını ölçmek için ayrıntılı bir yöntem sunuyoruz . Kan damarları, bir embriyonun atan kalbine basit bir DiI-AcLDL enjeksiyonuyla etiketlenebilir ve tüm embriyo içindeki kan damarları canlı veya sabit embriyolarda görüntülenebilir. Nükleik asitlerin hedeflenen mikroenjeksiyonu ve / veya farmakolojik reaktiflerin banyo uygulaması ile gen pertürbasyonuyla kombine edildiğinde, bir genin veya sinyal yolunun vasküler gelişim üzerindeki rolleri inve edilebilirSofistike genetik mühendisliğe tabi tutulmuş hayvanlara başvurmadan bir hafta içinde denendi. Xenopus'un iyi tanımlanmış venöz sistemi ve stereotipik anjiyojenezinden dolayı, var olan damarların filizlenmesi, karmaşıklık, pertürbasyon deneylerinden sonra verimli bir şekilde nicelleştirilebilir. Bu nispeten basit protokol, çeşitli kardiyovasküler araştırmalarda kolay erişilebilir bir araç olarak kullanılmalıdır.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Vaskülojenez, yeni doğan endotel hücrelerinden yeni kan damarlarının oluşumu ve önceden var olan damarlardan yeni damarların oluşumu olan anjiyogenez, embriyonik vaskülatürü şekillendiren iki ayrı süreçtir 1 . Bu işlemlerdeki herhangi bir düzensizlik, çeşitli kalp hastalıklarına ve damarların yapısal anormalliklerine neden olur. Dahası, tümör büyümesi, kontrolsüz damar büyümesi ile ilişkilidir. Bu nedenle, vaskülojenezin ve anjiyogenezinin altında yatan moleküler mekanizmalar yoğun araştırma konusudır 2 .

Xenopus ve zebra balığı çeşitli nedenlerle vaskülogenez ve anjiyogenez çalışmaları için cazip omurgalı modelleridir. Birincisi, embriyoları küçüktür; Bu nedenle, tüm vaskülatürün görüntüsünü görmek nispeten kolaydır. İkincisi, embriyonik gelişme hızlıdır; Tüm vaskülatürün gelişmesi yalnızca birkaç gün alır, bu süre boyunca gelişmekte olan vaskül Resimlenebilir. Üçüncü olarak, gelişmekte olan embriyoya antisens morfolino nükleotidlerinin (MO'lar) mikroenjeksiyon veya ilaçlar 3 , 4 , 5'in banyo uygulaması yoluyla uygulanması gibi, damar oluşumu öncesi ve sırasında genetik ve farmakolojik müdahalelerin gerçekleştirilmesi kolaydır.

Xenopus'un zebra balığı üzerindeki benzersiz avantajı, Xenopus'un stereotipik holoblastik bölünmeleri izlemesi ve embriyonik kader haritasının iyi tanımlanmış olması nedeniyle 6 embriyolojik manipülasyonların gerçekleştirilebilmesidir. Örneğin, iki hücreli evredeki bir hücrede bir antisense MO enjekte edilerek yalnızca bir yanal bölgenin genetik olarak manipüle edildiği bir embriyo üretmek mümkündür. Kalbin primordiumun bir embriyodan diğerine nakledilmesi, genin işlevini hücre içi veya ekstrensek mekanizma ile uygulayıp uygulamadığını belirlemek de mümkündürAss = "xref"> 7. Bu teknikler çoğunlukla allotetraploid olan ve bu nedenle genetik araştırmalar için ideal olmayan Xenopus laevis'de geliştirilmiş olmakla birlikte , yakından ilişkili bir diploid tür olan Xenopus tropikalis'e doğrudan uygulanabilirler8 .

Canlı bir Xenopus embriyosunda vaskülatürün görselleştirilmesinin bir yolu, kan damarlarını etiketlemek için bir flüoresan boya enjekte etmektir. DiI gibi bir floresan molekülü ile etiketlenmiş asetillenmiş düşük yoğunluklu lipoprotein (AcLDL) çok yararlı bir probdur. Asetilasid LDL'nin aksine, AcLDL LDL reseptörüne 9 bağlamaz, ancak makrofajlar ve endotel hücreleri tarafından endositize edilir. Canlı bir hayvanın kalbine DiI-AcLDL enjeksiyonu, endotel hücrelerinin spesifik flüoresan etiketlenişiyle sonuçlanır ve tüm vaskülatür, canlı veya sabit embriyoların flüoresan mikroskopisi ile görüntülenebilir.

İşte biz presXenopus tropikalis'teki DiI -AcLDL'yi kullanarak kan damarlarının görüntülenmesi ve nicelenmesi için ayrıntılı protokoller ( Şekil 1 ). Başarılı ve başarısız deney örnekleri ile önemli pratik noktalar sağlarız. Buna ek olarak, vasküler ağın şekillendirilmesinde genetik ve çevresel faktörlerin etkilerini değerlendirmede yararlı olabilecek, vasküler kompleksitenin kantitatif analizi için basit bir yöntem sunuyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, Yonsei Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komiteleri tarafından onaylanan protokollerle uyumludur.

1. Xenopus tropicalis Embriyolarının Hazırlanması

NOT: Xenopus tropicalis embriyoları daha önce tarif edildiği gibi 10 hafif bir değişiklikle üretilmiştir. Xenopus tropicalis embriyoları , Nieuwkoop ve Faber 11'in tablolarına göre sahnelendi.

  1. Yumurtlamayı indüksiyon
    1. Eşleştirme gününden önceki gün bir çift kurbağanın (bir erkek ve bir bayan) dorsal lenf kesesine insan koryonik gonadotropin (hCG) enjekte etmek için pre-prime uygulayın. Dişi kurbağa başına 20 birim ve erkek başına 10 birim enjekte edin. Evde bir erkek ve bir kadın aynı tankta gece boyunca (18 saatten fazla süreyle) evde bırakın.
    2. Ertesi gün, ön-astarlanmış dişi 200 ünite hCG ve ön-astarlanmış 100 ünite hCG enjekte edinerkek; Astarlanan kadın yaklaşık 3 saat içinde yumurta bırakmaya başlayacak ve gün boyunca bunu yapmaya devam edecektir. Erkek ve dişi çiftleri doğal çiftleşme için veya in vitro fertilizasyon için ayrı tanklarda (adım 1.2) tutun.
  2. dölleme
    NOT: Yumurtalar doğal çiftleşme veya in vitro fertilizasyon ile döllenir. Doğal çiftleşmede, yumurtalar serildikçe döllenir ve bu nedenle döllenme zamanlaması kontrol edilemez. Alternatif olarak, astarlanmış bir dişi kurbağa ayrı bir depoda barındırabilir ve aynı zamanda döllenmiş yüzlerce embriyo üreten in vitro fertilizasyon için verimsiz yumurta toplanabilir. Bu yaklaşım, blastomer hedefli mikroenjeksiyon damar etiketlemeden önce gerçekleştirildiğinde yararlıdır. Ancak bu yaklaşımda bir erkek kurban edilir.
    1. Doğal çiftleşme
      1. Astarlanmış dişi ve erkek çifti aynı tankta bırakın. Erkek fEmale, bırakılan yumurtaların derhal döllenmesine yol açar. Yumurtaları bir cam veya plastik pipetle toplayın ve bir Petri kabına aktarın. Yumurtaların pipete yapışmasını önlemek için, pipetin iç yüzeyini% 0.5 sığır serumu albumin (BSA) ile kaplayın.
    2. In vitro fertilizasyon (IVF)
      1. Astarlandıktan sonra astarlanmış dişi erkeğinden ayrılmalıdır. Kadın yaklaşık 3 saat içinde kendiliğinden yumurta bırakmaya başlar. BSA kaplı bir pipet kullanarak birer tane koyulmuş yumurtayı bir Petri kabına aktarın ve mikroskop altında kalitelerini kontrol edin. Sağlıklı yumurtalar (berrak pigment, elastik top şeklinde) atılırsa, astarlı erkekten testisleri ayırmaya hazır olun.
      2. Ötenazi için% 0.4 Tricaine metansülfonat (MS222) yapın ve astarlı erkek dorsal lenf bezi içine 300 μL enjekte edin. Yaklaşık 10 dakika sonra erkek denge duygusunu kaybedecek ve ayakta kalacaktır; Erkeklerin bir arka bacağını bir tutarak euthanize olduklarını onaylayınKünt forseps çifti ve yanıt gözlemlemek.
      3. İki testisin parçalarını temizleyin, tüysüz kağıda hızlı bir şekilde dokundurarak temizleyin ve 1 mL% 60 Leibovitz'in L-15 Medium (% 60) içeren% 10 fetal sığır serumu (FBS) ile birlikte bir mikro tüp içine aktarın; Ayrıntılı bir prosedür, başka yerde 10'da anlatılmıştır.
      4. Testisleri sperm elde etmek için yavaş yavaş bir havanla kestirin. Bu konsantrasyonda ( yani, % 60 L-15'de 1 mL% 10 FBS'de 2 testis) birkaç damla testis solüsyonu (0.1 mL) yaklaşık üç yüz yumurta dölleyebilmektedir. Kalan sperm sıkıca kapatılmış bir tüp içerisinde 4 ° C'de saklanabilir ve ertesi gün IVF için kullanılabilir.
      5. Dişi yumurtaları küçük bir Petri kabına sıkıştırın. Dişi üst kısmını avuç içine ters olarak tutun ve işaret parmağını arka ayakları arasına koyun. Arka bacaklarını işaret parmağı ile, diğer elinizle yayarak ortaya çıkın. Petri kabına girmek için dokunun. Coat tO IVF sırasında yumurta tek bir kat olarak eşit dağıtmak için% 0.5 BSA ile Petri tabağı.
      6. Yumurtalara birkaç damla (0.1 mL) sperm içeren L-15 ortam ekleyin. Eşzamanlı dölleme için, sperm solüsyonunu çanakta hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında 4 dakika sonra, Petri kabını 0.01x Modifiye Barth's Saline (MBS) ile doldurun, 10 dakika inkübe edin ve çözeltiyi 0.1x MBS ile değiştirin. Döllenmiş yumurtalar oda sıcaklığında yaklaşık 1 saat içinde ilk bölünmeye uğrayacaklardır. 1x MBS, 88 mM NaCl, 1 mM KC1, 2.5 mM NaHC03, 5 mM HEPES, 1 mM MgS04 ve 0.7 mM CaCl2, pH 7.5'tir.
  3. (İsteğe bağlı) Antisens morfolino oligonükleotidleri (MO'lar) ve / veya mRNA'ların enjeksiyonu
    1. İlgili bir genin damar oluşumu üzerine etkisini araştırmak için antisense MO ve / veya mRNA'ların mikroenjeksiyonunu gerçekleştirin.
    2. Bu tür deneyler için, yumurtaları 1x MBS'de (pH 7.5-7.8)% 2 L-sistein ile de jölleyin.1x MBS'de% 2 L-sistein ile döllenmiş embriyoları içeren çanakta 0.1x MBS'yi değiştirin. Çözümü karıştırmak için çanağı yavaşça döndürün.
      NOT: Embriyoların jel haline getirilmesi genellikle yaklaşık 5 dakika alır. Bu adım esnasında, yumurtaları çözeltiye aşırı maruz kalmamalarını sağlamak için sık sık izleyin. Yumurtalara aşırı maruz kaldıklarında elastikiyetlerini kaybederler ve yassılaşırlar ve bu da anormal gelişim ve ölümcüllük yaratır.
    3. Jöle silinmiş yumurtaları 0.1x MBS ile beş kez yıkayın. 0.1x MBS'de çözünmüş% 4 Ficoll içinde mikroenjeksiyon uygulayın. Tipik olarak, iki hücreli evrede blastom başına 4 ng MO ve 600 pg mRNA enjekte edin. Embriyonun sadece bir tarafında gen ekspresyonunu manipüle etmek için bir hücreye enjekte edin. Kontrol olarak aynı embriyonun enjekte edilmemiş tarafını kullanın.
    4. Gen manipülasyonunun özgüllüğü için bir başka kontrol olarak, aynı miktarda bir kontrol MO (CoMO) veya kontrol mRNA'yı ( örneğin, beta-galaktosidaz mRNA) enjekte edin. CoMO aynı m'ye sahip olmalıdırOleole ağırlık olarak gen-spesifik MO'dır ve Xenopus genomundaki herhangi bir geni hedef almamalıdır. Enjekte edilen tarafın kolay görselleştirilmesi için floresan etiketli MO kullanın veya bir izleyici birlikte uygulayın ( ör. EGFP mRNA).
    5. Enjekte edilen embriyoları 2 saat boyunca% 4 Ficoll'a bırakın ve sonra bunları 0.1x MBS ile dolu yeni bir 60 mm Petri kabına aktarın.
  4. Yükselen
    1. Embriyoları 23 ° C'de kaldırın. Gelişme hızı sırasıyla 23 ° C'nin (aralık: 16-26 ° C) altındaki sıcaklıklarda veya yavaşlatıldığında hızlanabilirken, 23 ° C sıcaklıkta yükseltilmesi önerilir.
  5. (İsteğe bağlı) Farmakolojik reaktiflerle işleme
    1. Farmakolojik manipülasyonlar için, gelişen embriyolara banyo uygulamasıyla ilaçlar verin.

2. DiI-AcLDL Enjeksiyonunun Hazırlanması

  1. Standart mikr kullanarak inceltici bir cam pipet yapınOpipet çektirme makinesi. Mikro pipet çekiciye bir borosilikat cam tüp yerleştirin ve aşağıdaki ayarları kullanın: basınç, 200; Isı, 30; Çekin, 30; Hız, 120; Zaman, 200.
  2. DiI-AcLDL stok solüsyonunu 4 ° C'de saklayın. Enjeksiyon çözeltisinin üst kısmını temizleyin, ancak tüpün altındaki çökelmiş partikülleri atmayın. Cam pipet içindeki herhangi bir pislik çözeltinin doğru bir şekilde boşaltılmasına engel olacaktır.
  3. Hazırlanan cam pipeti, bir mikro yükleyici kullanarak uygun miktarda DiI-AcLDL çözeltisi (~ 5 μL) ile doldurun.
  4. İnce bir forseps çifti (numara 55) kullanarak cam pipetin ucundan kük çıkartın. Basınç kontrollü enjeksiyon sistemini bir seferde yaklaşık 5 nL solüsyonun atılması için ayarlayın; 50-60 nL DiI-AcLDL çözeltisi bir embriyo damarlarını lekelemek için yeterlidir.
  5. Kurumayı önlemek için DiI-AcLDL yüklü pipetini havaya uzun süre bırakmayınız. Pipetin ucunu% 0,04'lük MS'ye batırın222 0.1X MBS çözümü. Embriyonun içine enjekte etmeden önce (adım 4.2.1), aynı miktarda boya çıkıp çıkmadığını kontrol edin.

3. Enjeksiyon Ayarı

  1. Sylgard kalıp
    1. Küçük bir Sylgard kalıbı hazırlamak için, Sylgard tabanı ve sertleştirici ajanı 10 ila 1 ağırlık oranında karıştırın. Karışık çözeltiyle küçük bir Petri kabının (35 mm veya 60 mm bulaşıklık) yaklaşık yarısını doldurun ve yaklaşık olarak katılaşması için bırakın 48 saat oda sıcaklığında.
  2. Anestezi
    1. Anestezi için 1x MBS'de (pH 7.5-8.0) 0.04% MS222 kullanın. Uzun anestezi gerektiğinde ( örneğin canlı görüntüleme sırasında), ozmotik dengesizliği azaltmak için 0.1x MBS'de% 0.04 MS222 kullanın. PH'ı ayarlamak için birkaç damla NaOH (~ 20 μL) ilave edin ve pH kağıdını kullanarak pH değerini kontrol edin.
    2. Aktarılan embriyoların hareketi durana kadar bekleyin. Embriyoların dorsal yüzgeçlerine dokunun ve bunların tamamlandığını onaylamak için yanıt verip vermediğini kontrol edinnesthesia.
  3. Enjeksiyonluk embriyoların konumlandırılması
    1. Sertleştirilmiş Sylgard kalıbın yüzeyini ince ve keskin bir bıçakla girinti yapın. Embriyoların yerleştirileceği V-şeklinde içbükey girinti yapın (bkz. Şekil 2D ). Anestezi uygulanmış bir embriyo, ventral yüz yukarı eğik olarak (yaklaşık 30 °) yerleştirin ( Şekil 2D ).
    2. Kalıbı MS222 solüsyonuyla doldurun ve embriyoları kalıba yerleştirin.

4. DiI-ACLDL Enjeksiyonu

  1. Kalbin üstünde cilt insizyonu
    1. Kalbi çevreleyen cildi kesmek için iki iğne hazırlayın (Minutiens, 0.10 mm). Her iğneyi bir iğ tutucuya sıkıca sabitleyin; Titreşirken kalp kolayca tanınabilir olmalıdır ( Şekil 2A-2C , pembe).
    2. Bir iğne ile bir embriyo cildi delin. İğneyi, kalp ve cilt arasındaki boşluğun deliğinden geçirin ( Şekil 2C , katı ok). Kalbi delmeyin. Bu iğnenin yerleştirilen kısmını, insizyon yapılacak bölgede konumlandırın.
    3. Deri dışına tutulan diğer pimi, sokulan pime nazikçe ovarak doğrusal bir kesik açın. Bu kesiyi iki pimle hafifçe genişletin, kalbi ortaya çıkarın ( Şekil 2B ' ve 2D' , ok). DiI-AcLDL ile yüklenen pipet doğrudan kalbe yaklaşabilir ( Şekil 2D ' ).
  2. Enjeksiyon
    1. Yüklenen cam pipetin ucunu kalbe yerleştirin ve yaklaşık 10 emisyon atımında 50-60 nL DiI-AcLDL solüsyonu enjekte edin. Aşırı miktarda solüsyonu enjekte etmeyin, çünkü kalp rüptürüne neden olur. Enjeksiyondan sonra kalbin atmaya devam edip etmediğini kontrol edin. Her enjeksiyondan sonra, aynı miktarda DiI-AcLDL'nin atılıp çıkarılmadığını kontrol edin; Aksi halde, pipetin ucu bloke olabilir (bkz. Adım 2.5).
  3. Kurtarma ve görsel tarama
    1. Enjekte edilen embriyoları toparlanma için 0.1x MBS ile dolu yeni bir Petri kabına aktarın. 5-10 dakika sonra tadpoles bilinç kazanmalı ve hareket etmeye başlamalıdır. Şu anda, etiketli gemiler görüntülenebilir. Embriyoların floresan mikroskop altında başarıyla etiketlendiği görsel olarak taranması önerilir ( Şekil 3A ve 3B ). Bir embriyoya yeterli miktarda DiI-AcLDL enjekte edilmezse tekrar enjekte edilebilir ( Şekil 3C ).
    2. Etiketli diğer organları olan tadpoles'u atın ( Şekil 3D ). Gereken sayıda embriyo elde edilene kadar devam edin.
  4. (İsteğe bağlı) Embriyoların fiksasyonu
    1. Kan damarlarının daha ayrıntılı olarak görüntülenmesi için, konfokal mikroskopi kullanın; Konfokal mikroskopi için işaretlenmiş embriyoları düzeltmek daha kolay olabilir. İlk önce 1x MB'de% 0.04'lük MS222'de işaretlenmiş embriyoları anestezi edinS (pH 7.5-8.0) ile yıkayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca 1X fosfat tamponlu salin (PBS) içerisinde% 4 paraformaldehid içinde sabitleyin. Sabit embriyolar birkaç gün boyunca 4 ° C'de saklanabilir; Enjekte edilen numuneleri, DiI'in ışığa maruz kalmamak için ışığa karşı koruyun.

5. DiI-AcLDL'nin görüntülenmesi

  1. Stereoskopik görüntüleme
    1. Vasculature genel morfolojisini değerlendirmek için bir fluoresans stereoskopik mikroskop ( Şekil 3 ) altında fotoğraf çekin.
    2. Sabit embriyolar için 1x PBS'de% 1 agaroz eritin veya canlı görüntüleme için 1x MBS'de eritin. Bir Petri kabına eritilmiş agaroz dökün ve katılaşıncaya kadar bekleyin. Agaroz jelinin yan tarafında yatarken imgelenecek embriyonun sığacağı sığ bir girinti yapın. Çanağı tamponla doldurun (anestezi uygulanmış embriyolar için MS222 çözeltisi veya sabit embriyolar için 1x PBS).
  2. Floresan mikroskobu (Rhodamine filtresit);
    1. DiI, rodamin veya spektral ilgili fluoroforlar için standart bir filtre seti kullanarak (maksimum 554 nm'de uyarma ve 571 nm'de emisyon) yeşil-uyarılan ve kırmızı yayan bir boya görüntüsüdür. Enjekte edilen embriyoları agaroz kalıbındaki girintilere yerleştirin ve fotoğraf çekin ( Şekil 3 ).
  3. Konfokal mikroskobi
    NOT: Vasküler mimariyi daha yakından incelemek için konfokal mikroskopi kullanın.
    1. Ters bir mikroskop kullanılıyorsa, embriyoları cam altı bir tabağa yerleştirin. Birkaç damla 1x PBS ekleyin ve üstüne bir kapak kayışı yerleştirerek onları hareketsiz hale getirin. Fazla PBS'yi çıkarın. Canlı embriyolar görüntülenecekse, anestezi uygulanmış embriyolar kullanın ve PBS yerine 0.1x MBS'de% 0.015 MS222 kullanın.
    2. Düşük büyütmeli görüntüleme için ilgi alanını bulmak için 4X - 10X arasında bir hedef kullanın; Posterior Kardinal Ven'in (PCV) rostral kısmı, gelişimsel anjiyogenezi araştırmak için yararlı bir bölge (Şekil 4, kesiklikutular).
      1. Kırmızı bir emisyon floroforu (Rhodamine gibi) için edinme ayarı kullanın.
      2. Bir embriyonun yanal yarısını görüntüleyerek z-yığılmış görüntüler yapın. Önce, objektifin yan tarafındaki PCV'ye odaklanın ve objektifin en yakınındaki kapların odaklandığı konumdaki odakın alt sınırını ayarlayın. Üst sınırı, PCV'nin görüntüleneceği medial bölümünün odaklanabileceği konuma ayarlayın. Embriyonun tüm yan yarısını görüntüleyin. Gemi uzunluklarını hesaplamak için gerekli olduğu gibi x, y ve z ölçekleri gibi satın alma ayarlarındaki meta verilerini depolayan yazılımları kullanın.
      3. Gerekirse, bir embriyonun tüm damar yapısını görüntülemek için karo tarama modunu kullanın. Ampirik olarak yatay ve dikey döşeme sayısını belirler.
    3. Yüksek büyütmeli görüntüleme için, PCV'nin rostral bölümünü ve 4 rostral en intersomitik venleri (ISV'ler) imge için yukarıdaki prosedürleri izleyin ( Şekil 4 ,Kesikli kutu). İstiflerin sayısını (z yığını) ve fayansları (fayans tarama) uygun şekilde ayarlayın.

6. DiI-etiketli gemilerin miktarının tespiti

NOT: DiI etiketli kaplar el ile veya yazılım kullanılarak izlenebilir. Kan damarları ve nevritler gibi tüp benzeri yapıların yarı otomatik olarak izlenmesine izin veren ücretsiz bir ImageJ (NIH) eklentisi olan "Basit nevrit tracer" kullanıyoruz 12 . Bu özgür yazılım kullanılarak aşağıdaki parametreler hesaplanabilir. Bu yazılımın kullanımı için ayrıntılı bir prosedür, başka yerlerde (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer) açıklanmıştır 12 . Aşağıda, Tie2 sinyalinin inhibe edildiği veya çoğaltıldığı embriyoların vaskülatür örneklerini kullanıyoruz ( Şekil 4A-4C ). Antisens Tie2MO enjekte edilen embriyolar, anjiyogenezi düşürür ve ISV'leri kısaltır ( Şekil 4B ), oysa yapısal olarak aktif Tie2'nin birlikte enjeksiyonuMutant mRNA (caTie2 mRNA), bu fenotipi kurtararak aşırı derecede ISV dalları oluşturur ( Şekil 4C ).

  1. ISV uzunlukları
    1. Basit nevrit tracer'ı kullanarak, izlenen her gemi uzunluğunu hesaplayın. 4 rostral en ISV'lerin uzunluklarını hesaplayın.
  2. ISV şubeleri
    NOT: Vahşi embriyolarda, sahnede 42 rostral en ISV'lerden sadece birkaç kısa dallar filizlenir.
    1. Basit nevrit tracer'da, bu küçük damarları, birincil dalı oluşturduğu ISV'yi yaptıktan sonra izleyin. Bu dalların ISV'lerden kaynaklanan aşağıdaki parametrelerini hesaplayın.
    2. Toplam şube sayısı
      1. Tüm ISV'ler ve ilişkili dallar izlandıktan sonra toplam dal sayısını hesaplayın ( Şekil 5B-5D ).
    3. Şube siparişi
      1. Simple neurite tracer, her dalın sırasını kaydettiğinden ( Şekil 5A ), calculatE her sipariş için şube sayısı. Vahşi tipli embriyolardaki damarların çoğunluğu birincil dallar olmalıdır ( yani ISV'ler).
    4. Damar kompleksite indeksi (VCI)
      1. VCI, yüksek dereceli dallara daha fazla ağırlık veren, karmaşıklık için yararlı bir parametredir, Şekil 5A'daki formülü kullanarak her embriyo için VCI'yi hesaplayın. Örneğin, Tie2MO enjekte edilen embriyolar, kontrol ( Şekil 5B ve 5C ) ile karşılaştırıldığında daha düşük bir VCI'ye sahiptir ve caTie2 mRNA enjekte edilen embriyoların daha yüksek bir VCI'ye sahiptir ( Şekil 5D ).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Deneylerin zaman çizelgesi (Şekiller 1 ve 2)

Döllenmeden kısa bir süre sonra, gen ekspresyonunu modüle etmek için hedeflenmiş mikroenjeksiyon yapılabilir. Örneğin, endojen Tie2 mRNA'nın başlatma kodonuna spesifik olarak bağlanan bir antisense MO, enjekte edilebilmekte ve Tie2 hedef mRNA'sının translasyonunu sterik engelleyerek inhibe edebilmektedir. Bir MO, başarıyla enjekte edilen embriyoların kolay görsel taramaları için fluore...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada sunulan protokol ilk olarak Xenopus laevis 4'te vasküler oluşum sırasında gelişme olaylarını araştırmak için Ali H. Brivanlou ve arkadaşları tarafından geliştirildi, ancak bu el yazmasında gösterildiği gibi diğer küçük hayvanlara uygulanabilir. Kalbe boya enjeksiyonu gerçekleştirmek kolaydır ve tüm vasküler ağ, bir floresan diseksiyon mikroskopu altında bir konfokal mikroskop altında görüntülenebilir. Boya damar gelişiminde kalbe enjekte edilirse, damar büyümesinin ve dallanma...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma Levine ve ark.'nın eserlerinden esinlenmiştir. , Bu deneysel yöntemi açıkladı ve Xenopus laevis'teki vasküler gelişimin kapsamlı bir tanımını sağladı . Girişleri için laboratuvarımızın üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, 2015 Yonsei Üniversitesi'nin Geleceğin Öncü Araştırma Girişimi (2015-22- 0095) ve Bilim, BİT ve Gelecek Planlama Bakanlığı tarafından finanse edilen Ulusal Araştırma Vakfı'nın (NRF) Biyo ve Tıbbi Teknoloji Geliştirme Programı tarafından desteklenmektedir ( NMK-2013M3A9D5072551)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
35 mm Petri kabıSPL10035Sylgard kalıp çerçevesi
60 mm Petri kabıSPL10060Embriyo büyütme tepsisi
Borosilikat CamSutter aletiB100-50-10Enjeksiyon için iğne
BSASigmaA3059-10GKaplama reaktifi
CaCl2D.S.P.GR Reaktif0.1x MBS Bileşen
CoverslipSuperiorHSU-0111520Konfokal görüntüleme için
DiI-AcLDLThermo Fisher ScientificL3484Damar boyama çözümü
FBSHycloneSH.30919.02Testis depolanması için
Fiber Optik AydınlatıcıDünya Hassas AletlerZ-LITE-ZIşık
FicollSigmaF4375Enjeksiyon tamponu
Alevli/Kahverengi Mikropipet ÇektirmeSutter aletiP-97Enjeksiyon iğnesi çektirme
ForcepGüzel Bilim Aracı11255-20Embriyo kuluçka ve
iğne ucu kesimi için
Cam Alt çanakSPL100350Konfokal görüntüleme için
hCGMNS KoreKurbağaların astarlanması için
HEPESSigmaH3375Tamponlama ajanı
İnkübatörLab. RefakatçiILP-02Embriyoları büyütmek için
KClDAEJUNG6566-4400MBS bileşeni
L15 ortaGibco11415-114Testis
L-sisteininSigma168149-100GJöle giderme reaktifi
MgSO4SigmaM7506MBS bileşeni
Testisin saklanması içinMicrotubeAxygenMCT-175-C-S
MS222SigmaE10521Anestezik toz
NaClDAEJUNG7647-14-5MBS bileşeni
NaOHSigmaS-0899pH ayarlama reaktifi
ParaformaldehitSigmaP6148Fiksatifler
PBSBIOSESANGP2007görüntülemek için tampon
SigmaP4536-100EApH
PICO-LITRE ENJEKTÖRÜonaylamak içinWaner aletleriPLI-100A
PimiPinservice26002-10İnsizyon
için PinholderScitech Korea26016-12İnsizyon için
Hassas Stereo Zoom Binoküler MikroskopDünyası Hassas AletlerPZMIIIGörsel tarama için
Standart Manuel Kontrol Mikromanipülatör Waner aletleriW4 64-0056Mikroenjeksiyon için
SYLGARD 184 KitiDow CorningDiI enjeksiyonu için
Transfer pipetiKore Ace Scientific Co.Ym. B78-400Yumurta ve
embriyo toplama için
saklanması için pH kağıdını Enjeksiyon için

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (9), 551-564 (2011).
  2. Augustin, H. G., Koh, G. Y., Thurston, G., Alitalo, K. Control of vascular morphogenesis and homeostasis through the angiopoietin-Tie system. Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (3), 165-177 (2009).
  3. Lawson, N. D., Weinstein, B. M. Arteries and veins: making a difference with zebrafish. Nat Rev Genet. 3 (9), 674-682 (2002).
  4. Levine, A. J., Munoz-Sanjuan, I., Bell, E., North, A. J., Brivanlou, A. H. Fluorescent labeling of endothelial cells allows in vivo, continuous characterization of the vascular development of Xenopus laevis. Dev Biol. 254 (1), 50-67 (2003).
  5. Yang, C., et al. Calmodulin Mediates Ca2+-Dependent Inhibition of Tie2 Signaling and Acts as a Developmental Brake During Embryonic Angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (7), 1406-1416 (2016).
  6. Moody, S. A. Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo. Dev Biol. 122 (2), 300-319 (1987).
  7. Elliott, K. L., Houston, D. W., Fritzsch, B. Transplantation of Xenopus laevis tissues to determine the ability of motor neurons to acquire a novel target. PLoS One. 8 (2), 55541(2013).
  8. Grainger, R. M. Xenopus tropicalis as a model organism for genetics and genomics: past, present, and future. Methods Mol Biol. 917, 3-15 (2012).
  9. Weisgraber, K. H., Innerarity, T. L., Mahley, R. W. Role of lysine residues of plasma lipoproteins in high affinity binding to cell surface receptors on human fibroblasts. J Biol Chem. 253 (24), 9053-9062 (1978).
  10. Showell, C., Conlon, F. L. Egg collection and in vitro fertilization of the western clawed frog Xenopus tropicalis. Cold Spring Harb Protoc. 2009 (9), 5293(2009).
  11. Nieuwkoop, P. D., Faber, J. Normal Table of Xenopus laevis (Daudin). , North-Holland Publishing Company. Guilders. Amsterdam. (1956).
  12. Longair, M. H., Baker, D. A., Armstrong, J. D. Simple Neurite Tracer: open source software for reconstruction, visualization and analysis of neuronal processes. Bioinformatics. 27 (17), 2453-2454 (2011).
  13. Marshak, S., Nikolakopoulou, A. M., Dirks, R., Martens, G. J., Cohen-Cory, S. Cell-autonomous TrkB signaling in presynaptic retinal ganglion cells mediates axon arbor growth and synapse maturation during the establishment of retinotectal synaptic connectivity. J Neurosci. 27 (10), 2444-2456 (2007).
  14. Cha, H. J., et al. Evolutionarily repurposed networks reveal the well-known antifungal drug thiabendazole to be a novel vascular disrupting agent. PLoS Biol. 10 (8), 1001379(2012).
  15. Ny, A., et al. A transgenic Xenopus laevis reporter model to study lymphangiogenesis. Biol Open. 2 (9), 882-890 (2013).
  16. Bussmann, J., et al. Arteries provide essential guidance cues for lymphatic endothelial cells in the zebrafish trunk. Development. 137 (16), 2653-2657 (2010).
  17. Li, X. M., Hu, Z., Jorgenson, M. L., Slayton, W. B. High levels of acetylated low-density lipoprotein uptake and low tyrosine kinase with immunoglobulin and epidermal growth factor homology domains-2 (Tie2) promoter activity distinguish sinusoids from other vessel types in murine bone marrow. Circulation. 120 (19), 1910-1918 (2009).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Xenopus tropicalisBlood Vessel VisualizationDiI AcLDL InjectionFluorescent Dye LabelingVascular Network AnalysisEmbryonic AngiogenesisConfocal MicroscopyVein Complexity IndexGene PerturbationPharmacological Application

Related Articles