Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü
Bu makalede
Özet
Özet
Filopodia, göç ve hücre-hücre iletişimi ile ilişkili dinamik, parmak benzeri hücresel çıkıntılardır. Filopodial başlatma, uzama ve daha sonra stabilizasyon veya geri çekmenin altında yatan karmaşık sinyal mekanizmalarını daha iyi anlamak için, bu dinamik yapılarda uzay-zamansal protein aktivitesinin belirlenmesi çok önemlidir. Filopodiya'daki protein fonksiyonunu analiz etmek için kısa bir süre önce filopodial şekil değişikliklerine uyum sağlayan yarı otomatikleştirilmiş bir izleme algoritması geliştirdik ve böylece tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve göreceli protein konsantrasyonunun paralel analizine izin verdik. Burada, optimize hücre işleme, görüntü toplama ve yazılım analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Ayrıca görüntü analizi ve veri sunumu sırasında isteğe bağlı özelliklerin kullanımı ile ilgili talimatların yanı sıra yol boyunca tüm kritik adımlar için giderme yönergeleri sağlıyoruz. Son olarak, aynı zamanda dFilopodia niceleme için hazır bulunan diğer programlarla birlikte görüntü analiz yazılımını hazırlar. Sunulan protokol, birlikte görüntü analizi yazılımı kullanarak filopodial çıkıntılar protein dinamikleri doğru analiz için bir çerçeve sağlar.
Giriş
Aktin düzenleyici proteinlerin spatio-temporal kontrolü filopodium dinamikler 1 , 2 ile ilişkilidir. Zamanla tüm filopodial uzunluk boyunca uzaysal olarak çözülen protein konsantrasyonunun izlenmesi, bu dinamik yapıların başlatılması, uzatılması, stabilizasyonu veya çökmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir 3 , 4 . Birçok hücre şekli değişikliğinin daha büyük bir ölçekte gerçekleştiği sitoplazmada protein analizinin aksine, filopodiya, sürekli olarak 5 virajını kavrayan ve virüs oluşturan dinamik mikro y....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
1. Hücre Kültürü
- 4.5 g / L D-glükoz, L-alanin-L-glutamin dipeptid, piruvat,% 10 sığır fetüsü serumu ve 10 ünite / ml penisilin / streptomisin içeren Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamında (DMEM) Kültür HeLa veya COS hücreleri. 0.5 mM L-alanin-L-glutamin dipeptid, serumsuz nöronal takviyeleri ve 10 ünite / ml penisilin / streptomis ile takviye edilmiş L-glutamin, glutamik asit veya aspartik asit içermeyen kültür ortamındaki kültür nöronları.
- % 40 confluency ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçim yapıları ile transfekte hücreleri. 37 ° C'de inkübe edilen transfekte hücreleri tutun ve 15....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Filamentöz aktin (f-traktin 18 , kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) için bir markör ile transfekte edilmiş COS hücrelerini kullanarak, aktin bakımından zengin filopodial çıkıntıları bulduk ( Şekil 3A , üst panel). Zaman serileri, filopodinin hızla uzaması ve geri çekilmesi olduğunu gösterdi ( Şekil 3A , orta panel). Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bireysel filopodiyi izledik. El ile görüntü anal.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Burada, filopodial büyüme dinamikleri ve konveks gövde algoritması yoluyla bu dinamik yapılardaki bağıl protein konsantrasyonlarının izlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yazılımı kullanarak, iki kanalın ( yani proteinler) göreli konsantrasyonlarının uzatma / geri çekme çevrimi boyunca belirlendiği ve ayrı klasörler halinde görüntü ve veri dosyaları olarak depolandığı tek bir programda üç kanala tek tek karşılaştırılabilir. Yazılım, rutin işlemlere ek olarak, ilgili deney için analizin optimize edilm.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Yazarlar, DFG'den (MG için EXC-1003) finansman sağlamışlardır.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| DMEM | Yaşam Teknolojileri | 31966-021 | |
| %10 Fetal sığır serumu | Biochrom AG | L11-044 | |
| Lipofektamin 2000 | Yaşam Teknolojileri | 11668-027 | |
| %1 penisilin / streptomisin | Biochrom AG | 12212 | |
| Nörobazal Orta Yaşam Teknolojileri | 21103-049 | ||
| B27 | Yaşam Teknolojileri | 17504-044 | |
| HEPES (1M stok çözümü) | Yaşam Teknolojileri | 15630 | |
| Sitrin-N1 | Addgene | 54593 | |
| Labtech | Thermo | 155411 | |
| Glutamax-I | Thermo | 35050-061 | |
| Hela | Leibniz Enstitüsü DSMZ | ACC-57 | |
| COS 7 | Leibniz Enstitü DSMZ | ACC-60 | |
| 3T3 hücreleri | Leibniz Enstitüsü DSMZ | ACC-59 | |
| Mikroskop | Nicon Eclipse | ||
| Kamera | Andor | DU888 Ultra | |
| Konfokal | Ünite Yokagawa | CSU-X1 | |
| Piruvat | Gibco | 31966-021 |
Kaynaklar
- Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).
- Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U.
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
