Dinamik Hücresel Protrüzyonlarda Protein Konsantrasyonunun Yazılım Destekli Takibi için Grafiksel Bir Kullanıcı Arayüzü

Summary

Dinamik hücresel çıkıntıların uzunluğu boyunca göreli protein yoğunluğunun yarı otomatik olarak izlenmesi için bir yazılım çözümü sunmaktayız.

Abstract

Filopodia, göç ve hücre-hücre iletişimi ile ilişkili dinamik, parmak benzeri hücresel çıkıntılardır. Filopodial başlatma, uzama ve daha sonra stabilizasyon veya geri çekmenin altında yatan karmaşık sinyal mekanizmalarını daha iyi anlamak için, bu dinamik yapılarda uzay-zamansal protein aktivitesinin belirlenmesi çok önemlidir. Filopodiya'daki protein fonksiyonunu analiz etmek için kısa bir süre önce filopodial şekil değişikliklerine uyum sağlayan yarı otomatikleştirilmiş bir izleme algoritması geliştirdik ve böylece tüm filopodial uzunluk boyunca çıkıntı dinamiklerinin ve göreceli protein konsantrasyonunun paralel analizine izin verdik. Burada, optimize hücre işleme, görüntü toplama ve yazılım analizi için ayrıntılı bir adım adım protokol sunuyoruz. Ayrıca görüntü analizi ve veri sunumu sırasında isteğe bağlı özelliklerin kullanımı ile ilgili talimatların yanı sıra yol boyunca tüm kritik adımlar için giderme yönergeleri sağlıyoruz. Son olarak, aynı zamanda dFilopodia niceleme için hazır bulunan diğer programlarla birlikte görüntü analiz yazılımını hazırlar. Sunulan protokol, birlikte görüntü analizi yazılımı kullanarak filopodial çıkıntılar protein dinamikleri doğru analiz için bir çerçeve sağlar.

Introduction

Aktin düzenleyici proteinlerin spatio-temporal kontrolü filopodium dinamikler ^{1 , 2} ile ilişkilidir. Zamanla tüm filopodial uzunluk boyunca uzaysal olarak çözülen protein konsantrasyonunun izlenmesi, bu dinamik yapıların başlatılması, uzatılması, stabilizasyonu veya çökmesinin altında yatan mekanizmaları anlamak için çok önemlidir ^{3 , 4} . Birçok hücre şekli değişikliğinin daha büyük bir ölçekte gerçekleştiği sitoplazmada protein analizinin aksine, filopodiya, sürekli olarak ⁵ virajını kavrayan ve virüs oluşturan dinamik mikro yapılar olup, bu nedenle çizgi tarama gibi basit bir yaklaşımla analiz yapılmamaktadır.

Filopodial şekli izlemek için farklı yazılım özümleri mevcuttur ^{6 , 7 , 8 , 9} . LikewHücre gövdesi içerisindeki protein dinamiklerinin oraniyometrik izlenmesi için yazılım geliştirilmiştir. ^{10 , 11} . Filopodial şekil ve uzay-zamanlı protein analizinin otomatik izlenmesini birleştirmek için son zamanlarda konveks-gövde algoritmasına ¹² dayalı bir görüntü analiz yazılımı geliştirdik. Bir grafiksel kullanıcı arabirimi (GUI) aracılığıyla çalıştırılan bu yeni analiz yöntemi, filopodial uzunluk ve büyüme hızı boyunca göreli protein konsantrasyonunu ilk kez birleştirir ve böylece uzay-temporal protein dağılımının bu ölçümlerin hareketlerinden bağımsız olarak doğru ölçümünü sağlar Dinamik yapılar ¹² .

Yazılımın arkasındaki fikir (kaynak kodu serbestçe bulunur, aşağıya bakınız), konveks gövdesinin köşelerinden biri filopodyumun ucuyla örtüşecektir ( Şekil 1A ). Sonraki çerçeveye bakarak,Dışbükey gövdenin en yakın tepe noktası, hareketli uç tüm film boyunca izlenebilir. Ucu her karede algılandıktan sonra, konumu, filopodyum tabanında bir referans noktası ile ucu birleştirerek bir eksen çizmek için kullanılır ( Şekil 1B ). Son olarak, konumları eksene dik olan çizgide maksimum yoğunluk ile medyan piksel ile belirlenen eşit uzaklıktaki düğüm noktaları kullanılarak, filopodial şekli takip eden omurga belirlenir. Bu adaptif omurgadan yararlanarak, filopodial uzunluk boyunca üç kanala kadar filopodial büyüme ve protein konsantrasyonlarını izlemek için bir kymograph oluşturulur ( Şekil 1C ).

Şekil 1: Görüntü Analiz Yazılımının Çalışma Prensibi. ( A ) Arkasındaki algoritmayazılım. Adım1'de kullanıcı, filopodyumun referansını (tabanı) ve tepeyi (ucu) belirtir. Adım 2-1'de, filopodyumun omurgası, maksimum yoğunluk değerine sahip medyan piksel kullanılarak elde edilir. Adım 3'te omurga mekansal protein yoğunluğu profili için kullanılır. Adım 2-2'de, yazılım otomatik olarak sonraki çerçevedeki ucu izler. Bütün prosedür tekrarlanır. ( B ) İzlem için kullanılan konveks gövde gibi önemli elementleri sunan gerçek filopodyumlu algoritmanın anlık görüntüsü. ( C ) Algoritma ile ölçülebilen parametrelere genel bakış. Bu rakam referans ^12'den değiştirildi. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Görüntü analiz yazılımı, grafiksel bir kullanım yoluyla Matlab'da (programlama yazılımı olarak anılır) çalıştırılırR arabirimi. Belli deneysel ayarlar için esneklik ve dayanıklılığı en üst düzeye çıkarmak için kullanıcı bir dizi izleme parametresini ayarlayabilir ( örneğin, izin verilen eğme açısı ve çerçeve içi hareketi) ve filmlerde bazı düzeltmeler yapabilir ( örneğin, kırpma, döndürme, istenmeyen nesnelerin giderilmesi) ( Şekil 2A ve Tablo 1) .

GUI	Yok hayır.	Zorunlu	Açıklama					İsim (GUI'de)
1.	1 A	Y	Hücre gövdesini (kutu işaretli olarak) gösteren yığınlanmış .tiff dosyasını yüklemek veya kanallardan üst üste yerleştirilen hücre gövdesi oluşturmak					Vücut hücresi
1.	1b	Y		Protein 1
1.	1c	Y	Protein 2'ye karşılık gelen yığılmış görüntü dosyasını yükleme					Protein 2
1.	1d	Y	Protein 3'e karşılık gelen yığınlanmış görüntü dosyasını yükleme					Protein 3
1.	1e	N-	Önceden yüklenmiş yığılmış görüntü dosyalarına her şeyi sıfırlar					Reset
1.	2a	Y	GUI penceresinde # 2 analiz için ilk kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu					NA
1.	2b	Y	GUI penceresinde # 2 analiz için son kareyi belirlemek için kaydırma çubuğu					NA
1.	2c	Y	Curre'yi temsil eden kaydırma çubuğuNt çerçevesi					NA
1.	2d	N-	Tüm piksellerin altında sıfıra ayarlanacağı piksellerin gri değeri					NA
1.	2e	N-	Yukarıdaki tüm piksellerin maksimum değerlere ayarlanacağı piksellerin gri değeri					NA
1.	2f	N-	<2e> & <2f> ile belirtilen piksellerin yoğunluk değerlerini ayarlayın.					Set
1.	2 g	N-	Yoğunluğu ayarlanmış filmi oynat					Oyun
1.	2s	N-	Görüntüyü kırp					ekin
1.	2i	N-	Resmi Döndür					Döndürme
1.	2j	N-	Tüm yığında bölgeleri sil					Bölgeleri sil
1.	3 A	Y	'Analiz Penceresi'ni açmak için tıklayın (GUI penceresi # 2)					İzleme Penceresi
1.	3b	Y	Mikron cinsinden bir piksel boyutunu girin					Piksel boyutunu girin
2.	4	Y	Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin sınır / kenar görüntüsünü oluşturmak için tıklayın					Sınır
2.	5	Y	Filopodiyanın taban ve ucunu seçmek için tıklayın					Referernce
2.	6a	Y	Segmentlerin veya düğümlerin sayısını girin					Segment sayısı
2.	6b	Y	Tarama uzunluğunu girin (eksene dik olarak)					Tarama Genişliği
2.	6c	Y	Filopodinin yukarıya doğru bükülmeye başlama uzunluğunu girin					Sonra Doğru Ölçümler
2.	6d	Y	İpucu algılama çemberinin yarıçapını girin (yani, vertex'in bir sonraki çerçevede lokalize edilebileceği alan)					İpucu algılama yarıçapı
2.	6e	Y	Filopodium'un dikey eksenden kıvrılabileceği maksimum açıyı girin					Açı Eşiği
2.	6f	N-	Belirli çerçeve için taban ve uç için referans noktaları ekleyin					Referans seç
2.	6g	N-	Belli bir çerçeve için filopodinin bükülmeye başlandığı uzunluğu girin					Sonra Doğru Ölçümler
2.	6h	N-	Belirli çerçeve için algılama çemberinin yarıçapını girin					İpucu algılama yarıçapı
2.	6i	N-	Belirli bir çerçeve için tüm parametreleri girdikten sonra, daha sonraki referanslar için bellek ve dosyalara değerleri depolamak için tıklayın.					Eklemek
2.	6j'nin	N-	Bu karenin elle ayar parametrelerini silmek için tıklayın					silmek
2.	6k	N-	Tüm kareler için 'isteğe bağlı özellikler paneli' kullanılarak manuel olarak saklanan tüm parametreleri silmek için tıklayın					Reset
2.	6l	N-	Gelecekteki referans için tüm izleme sonuçlarını belleğe kaydetmek için izleme işleminden önce kontrol edin					Geçmiş izi
2.	7	Y	İzlemeyi başlatmak için tıklayın					Takip ve Analiz
2.	8a	N-	Protein kanalı yoğunluğunu izlemeye başlamak için tıklayın					Protein yoğunluklarını analiz edin
2.	8b	N-	Filopodial uzunluk boyunca protein kanal yoğunluğunu izlemek için kontrol edin					Bütün filopodi
2.	8c	N-	Referans proteinini veya protein A'yı izlemek için kontrol edin					Protein A
2.	8d	N-	B proteinini izlemek için kontrol edin					ProteinB
2.	8e	N-	Proteini C izlemek için kontrol edin					ProteinC
2.	8f	N-	Ortalama protein yoğunluğunu izlemek için kontrol edin.E uç					Öne çıkan ipucu
2.	8g	N-	İpucunun uzunluğunu girin					İpucu Uzunluğu
2.	8h	N-	Ucun üstünde şekillendirme başladığı minimum mesafeyi girin					eşik
2.	8i	N-	Öncü ipucu analiz sonuçlarını dosyaya kaydetmek için tıklayın.					Butona basınız
2.	9a	N-	Ratiyometrik protein analizi başlatmak için tıklayın					Karşılaştırmak
2.	9b	N-	A proteinine B proteinini karşılaştırmak için giriş yapın.					log 10 (B / A)
2.	9c	N-	Protein C'yi A'ya göre karşılaştırmak için kontrol edin					log 10 (C / A)
2.	9d	N-	Protein B'yi uçtaki A'ya göre karşılaştırmak için kontrol edin					log 10 (B / A)
2.	9e	N-	Protein C'yi uçtaki A'ya göre karşılaştırmak için kontrol edin					log 10 (C / A)
2.	10a	N-	Diğer renk haritasını seçin (varsayılan: Jetplot)					Renk Haritası
2.	10b	N-	Renk haritasını düzenle					Renk haritasını düzenle

Tablo 1: GUI'de Bulunan Tüm İşlevlere Genel Bakış Windows # 1 ve # 2.

Bu gerçekleştirildiğinde, program bir konveks gövde oluşturur ve film boyunca ucu otomatik olarak izler. Filmden çıkarılan parametreler, örneğin bir sıçanometrik kymograph, büyüme hızı ve filopodial uzunluk aYeniden görüntülenir ve iş klasörüne görüntüler ve veri dosyaları olarak saklanır. Filopodial yaşam süresi, büyüme hızı ve geri çekme oranı gibi diğer parametreler daha sonra çıkarılabilir ve depolanmış veri dosyalarından daha fazla analiz edilebilir ( Şekil 2B ).

Şekil 2: Görüntü Analiz Yazılımının Kullanımı için Grafik Kullanıcı Arayüzü. ( A ) GUI Penceresi # 1, resim yüklemek ve işlemek için kullanılır. Program 3 kanala kadar yükleyebilir, böylece 2 kanal karşılaştırılır. Pencere, izlemeden önce görüntülerin ön işleme tabi tutulması için zorunlu (mavi) ve isteğe bağlı özellikler (yeşil) ile birlikte gelir ( B ) GUI Pencere # 2, filopodyumun yanı sıra zamansal ve oran-metrik protein analizi izlemek için kullanılır. Yine, isteğe bağlı özellikler yeşil olarak işaretlenmiştir. Bu rakam modifi olduKaynakça ¹² . Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Burada, örnek hazırlama ve yazılım kullanımı için ayrıntılı bir protokol sunmaktayız. Hücrelerin kültürlenmesi ve görüntü analizi için optimize edilmiş filmlerin edinilmesi ile ilgili ayrıntılı talimatlarla başlayacağız. Veri edinimi ile ilgili bu bölüm, görüntü analiz yazılımını çalıştırmak için ayrıntılı bir açıklama izliyor. Protokol boyunca, verileri toplamak ve işlemek için dikkate alınması gereken kritik adımları ve isteğe bağlı özellikleri tanıtmaktayız. Son olarak, açıklanan görüntü analiz yazılımının filopodial niceleme için mevcut olan diğer programlarla karşılaştırılması ve sınırlamalar ve geleceğe yönelik bir tartışma ile kapanmadan önce, filopodiyi görüntü analiz yazılımı ile farklı model sistemlerinden analiz ediyoruz.

Protocol

1. Hücre Kültürü

1. 4.5 g / L D-glükoz, L-alanin-L-glutamin dipeptid, piruvat,% 10 sığır fetüsü serumu ve 10 ünite / ml penisilin / streptomisin içeren Dulbecco'nun Değiştirilmiş Kartal Ortamında (DMEM) Kültür HeLa veya COS hücreleri. 0.5 mM L-alanin-L-glutamin dipeptid, serumsuz nöronal takviyeleri ve 10 ünite / ml penisilin / streptomis ile takviye edilmiş L-glutamin, glutamik asit veya aspartik asit içermeyen kültür ortamındaki kültür nöronları.
2. % 40 confluency ulaşıldığında, üreticinin talimatlarına göre bir transfeksiyon reaktifi kullanarak seçim yapıları ile transfekte hücreleri. 37 ° C'de inkübe edilen transfekte hücreleri tutun ve 15-18 saat boyunca% 5 CO ₂ .
3. Görüntü alımı sırasında pH ve ozmolarite (buharlaşma nedeniyle) değişiklikleri azaltmak için, hücre kültürü odalarını (görüntülemeye başlamadan önce)% 90'a kadar, 20 mM 4- (2-hidroksietil) -1 içeren 37 ° C önceden ısıtılmış ortam ile doldurun -piperazinetansülfonik asit (HEPES). MühürlemekKapak, vakum gres ince bir tabaka içinde kapağın iç uygulayın ve yavaşça transfekte hücreleri içeren kültür odası üzerine bastırın.

2. Görüntü Edinimi

NOT: Filopodiya uzunluğu 2-10 μm3 arasında değişir ¹³ . Filopodia ortalama hız 0.05-0.1 μm / sn'de büyür ^{13 , 14} .

1. 60X veya 100X objektif ve hiçbir piksel binning (burada bir dönen disk konfokal mikroskop) ile bir mikroskop kullanılarak görüntü elde edin. Filopodial dinamikleri izlemek için 1 Hertz'den (Hz) büyük edinim hızları kullanın. Odak dışı nesneleri en aza indirgemek için görüntü filopodisi bazal membrana ( yani substrat yüzeyi) yakındır.
2. Düzgün izlemeyi sağlamak için kameranın maruz kalma zamanını ve lazer yoğunluğunu, sinyal / gürültü oranı (SNR) 4'ten büyük olacak şekilde ayarlayın. Bireysel kanalların doygunluğundan kaçının ( örn .255 8-bit görüntüler için 65.535 16-bit görüntüler için), daha sonraki görüntü analizini engelleyecektir.
3. Kanamayı önlemek için, lazer çizgileri ve mikroskop filtreleri ile uyumlu floresan etiketleri kullanın (ayrıntılar için bkz. Referans ¹⁵ ).

3. Görüntü Ön işleme

NOT: Görüntüleri önceden işleme koymak için ImageJ veya diğer mevcut yazılımı kullanın ^{16 , 17} .

1. Örnek hareket ediyorsa, analiz öncesinde mevcut yazılımları kullanarak yanal sürüklenmeyi düzeltin ( örn. Https://github.com/NMSchneider/fixTranslation-Macro_for_ImageJ). Filmleri eksenel sürüklenme (yani, z-yönünde hareket) ile hariç tutun.
2. Doğru arka plan ( yani hücrenin dışındaki alanların gri değerleri), ağartma ( yani , flüoresans proteinlerine hasar vermesi nedeniyle floresan yoğunluğu varsa sürekli kaybı) ve olası kanama yalakı ( yani , bir gribten gelen sinyal(Örn. Http://imagej.net/Category:Plugins ve ^{16 , 17} ) kullanarak).
   Not: Münferit kanalların floresan yoğunluğu yazılım tarafından değiştirilmez.
3. Sonraki görüntü analizini sağlamak için, belirli protein kanallarına karşılık gelen filmleri, gri tonlamalı olarak '.tiff' yığınlı dosya formatı olarak çalışma klasörüne kaydedin.
   NOT: İstiflerin boyutları (boyut, uzunluk) tüm kanallar için aynı olmalıdır.

4. Görüntü Analizi - Adım 1: Resim Yükleme

NOT: Burada açıklanan yazılım Matlab'da (programlama yazılımı olarak anılır) yazılmıştır ve yalnızca bu program ile çalışır.

1. Görüntü analizleri için gerekli tüm dosyaları içeren sıkıştırılmış klasörü aşağıdaki siteden indirin: https://campus.uni-muenster.de/en/einrichtungen/impb0/nanoscale-forces-in-cells/softwdır-dir/. Dosyaları iş klasörüne sıkıştırın ve kopyalayın.
2. Kurulduktan sonra programlama yazılımını açın ve 'filopodiaAnalysisM3.fig' dosyasını çalıştırın. GUI Penceresi # 1 Şekil 2A'da gösterildiği gibi açılacaktır.
3. Belirli bir proteine ​​karşılık gelen kaydedilmiş yığınlanmış '.tiff' dosyalarını, protein C için <1b> protein B, <1c>, protein C için <1d> düğmelerini kullanarak GUI Pencere # 1'e yükleyin. Bkz. Şekil 2 ve Tablo 1 ayrıntıları için.
   NOT: GUI Penceresi # 1'de gösterilen Protein A, nihai rasyonel analiz için referans kanalı görevi görür.
4. <1a> 'yı tıklayarak protein kanallarından hücre üst üste imajı oluşturun.
5. İlk kareyi atamak için <2a>, analiz için kullanılan son kareye <2b> tıklayın.
6. İsteğe bağlı olarak, <2h> düğmesini kullanarak ilgilenilen filopodiumu içeren ilgi alanını (ROI) kırpın, resmi döndürünüz u<2i> deyin veya serbest el çizim aracını <2j> kullanarak istenmeyen bölgeleri silin.
   NOT: Görüntü analizini kolaylaştırmak için ImageJ kullanarak ROI'yı (diğer bir deyişle kırpma, döndürme, silme) diğer ön işleme adımlarıyla (arka plan çıkarımı, çamaşır suyu düzeltmeleri vb.) Ayırmanız önerilir.
7. Kalite kontrolü için her çerçeve için kaydırıcıyı hareket ettirin ve filmin tamamında filopodyumun açıkça görülebileceğini kontrol edin.

5. Görüntü Analizi - Adım 2: İz Yaratın

1. GUI Pencere # 2'yi açmak için GUI Pencere # 1'deki <3a> düğmesine tıklayın ( Şekil 2B'ye bakın).
2. Üst üste yerleştirilen hücre gövdesinin maskesini oluşturmak için GUI Penceresi # 2'deki <4> düğmesine tıklayın (<1a> 'yi tıkladıktan sonra GUI Penceresi # 1'de oluşturulur). Program aynı zamanda vertex noktalarını elde etmek için konveks gövde uygulandığı maskenin sınırını oluşturur.
3. cliCk düğmesi <5>; Bir imleç belirecektir. İmleci (filopodial ucu mesafesinin ölçülmekte olduğu) tabanı ve ardından ilk göründüğü çerçevedeki filopodinin ucunu seçmek için imleci kullanın. Bunu yapmak için kaydırıcıyı Pencere # 2'de hareket ettirin).
   NOT: Veri çıkışındaki hataları en aza indirgemek için, taban noktasını eksene göre filopodial ucun altına dikey olarak yerleştirin. Taban noktasının başka yerlere yerleştirilmesi ( örneğin yanal olarak kaydırılmış olması), hücre gövdesi içerisindeki floresans değerlerinde yönsel bir önyargı ortaya çıkarabilir.
4. <6c> 'yi kullanarak eşik uzunluğunu (filopodinin üzerinde bükülecek) seçin.
   Not: Bu uzunluk, taban noktası (<5> kullanılarak seçilen) ile hücre gövdesinin sınırı (filopodinin büyümeye başladığı bölge) arasındaki uzaklık olarak tanımlanır. Mesafe piksel olarak ölçülür.
5. <6a> kutusunda filopodiya şekline yaklaşmak için kullanılan kesim sayısını belirtin.
   NOT: mEn az sayıda bölüm, filopodyum tarafından ulaşılan maksimum uzunluğa, ayrıca filopodyumun nasıl bükülmesine bağlıdır. Taban ve ucu arasındaki piksel sayısından daha büyük sayıda segment ( örn . Eşik uzunluğu) seçmeyin. Adım 5.4'te tanımlanan eşik uzunluğundan daha fazla segment seçme. ( Yani taban ve uç arasındaki piksel sayısı) filopodyumun uzunluğunun bir tahmini ile sonuçlanacaktır.
6. Düğümleri yerleştirmek için yatay tarayıcı görevi gören tarama genişliğini <6b> olarak belirtin.
   NOT: Bu düğümler, program tarafından, filopodyumun gövdesi ile taban ve ucu birleştiren çizginin ( yani omurgasını oluşturmak için) sığdırılması için kullanılır. Bir başlangıç ​​noktası olarak, maksimum uzunluğa bir faktör ile çarpılmış piksele bir değer koyun .
7. <6d> kutusunda tarama yarıçapını (piksel cinsinden) belirtin. Ob'dan yaklaşık% 50 daha büyük bir değer kullanınÇerçeveler arası uç yer değiştirmesini sağladı.
   NOT: Çok büyük bir tarama yarıçapı kullanmak, gerçek filopodial ucu bulunmayan çerçevelerde istenmeyen konveks gövde noktalarını yakalayabilir ( örneğin düzlem dışı hareket veya düşük SNR).
8. Kutu <6e> 'de eğme açısını belirtin.
   NOT: Açı eşiği, bütün analiz sırasında filopodyumun bükülmüş maksimum açısı ile belirlenir. Açı eşiğini belirtmek, filopodiya hücre gövdesine doğru eğildiğinde yazılımın filopodiya yanından büyüyen istenmeyen yapıların izlemesini hariç tutmasına yardımcı olur. Program dikey eksenden 45 dereceden daha az eğilme açısı ile filopodiya için güvenilir şekilde çalışır.
9. İzlemeye başlamak için GUI Penceresi # 2'deki düğmesini tıklayın. Gelecekteki referans için tüm izleme protokolünü kaydetmek için GUI Penceresi # 2'deki 'Geçmiş izlemesi' kutusunu tıklayın.
   NOT: İzleme işlemi tamamlandıktan sonra, her karedeki filopodyumun uzunluğu,Gelecekteki başvurular için 'dynamics.xlsx' dosyasının 'length_vel' adlı sayfası. Aynı şekilde, diğer tüm izleme parametreleri 'dynamics.xlsx' parametrelerinde saklanır.
10. İsteğe bağlı olarak, filopodiya tüm karelerde otomatik olarak algılanmazsa, elle düzeltmek için aşağıdaki adımları kullanın.
    1. Pencere # 2'deki kaydırıcıyı kullanarak ilgili çerçeveyi ziyaret edin ve elle filopodyumun ucunu seçin.
       Not: Dışbükey gövde noktalarının bulunmadığı çerçeveler, GUI Penceresi # 2'nin izleme penceresinde mavi bir bölge ile temsil edilecektir. Bu çerçeve içindeki düğüm koordinatlarına erişmek için izleme programı başlatılmadan önce 'Geçmiş izi' düğmesini kontrol etmek zorunludur.
    2. GUI Penceresi # 2'de <6f> kullanarak referans noktalarını (taban ve ipucu) seçin. 'Tarama uzunluğu', 'Sonradan Hassas Ölüm' ve 'maksimum eğme açısı' gibi diğer parametreleri belirtin; 5.4-5.8 adımlarında açıklandığı gibi bu çerçeve için.
    3. Yeni parametreleri kaydetmek için <6i> düğmesine tıklayın (bir kareye özgü). Adımlar mavi bölgenin gösterdiği tüm kareler için tekrarlanmalıdır.
    4. İşiniz bittiğinde, <7> tuşunu kullanarak izleme prosedürünü yeniden başlatın.
       NOT: Bu düzeltme, program bir filmdeki bir filopodialden aniden geçiş yaparsa da kullanılabilir. Alternatif olarak, birden fazla filopodiyi içeren filmleri kırpmayı düşünün.

6. Görüntü Analizi - 3. Adım: Spatio-temporal Protein Analizi

1. Uzay-zaman analizi için, <8b> ile temsil edilen kutuyu ve ardından ilgili protein kanalı (<8c> ve / veya <8d> ve / veya <8e>) seçin.
   Not: Protein A referans olarak kullanıldığından, rasatometrik analizden (<9a>, <9b> ve / veya <9c>) önce Protein A seçilmesi zorunludur.
2. <8a> 'yı tıklayın5.9. Adımda üretilen izi kullanarak filopodial uzunluk boyunca protein izlemeyi başlatmak için.

7. Görüntü Analizi - 4. Adım: Oran-metrik Protein Analizi

1. Uzay-zamansal oranlamalı grafiği elde etmek için <9b> veya <9c> onay kutusunu işaretleyin ve <9a> düğmesine tıklayın.
   NOT: Göreceli protein konsantrasyonunun yanlış gösterilmesini önlemek için, ratiyometrik görüntü X / Y olarak değil, log (X / Y) olarak çizilmemektedir. İleride kullanılması için, ratiyometrik grafiğe '.png' ve '.fig' format dosyaları verilir ve gebelik verisi 'dynamics.xlsx' dosyası içinde saklanır.

8. Görüntü Analizi - Adım 5: Filopodial İpucu Analizi

1. <8f> onay kutusunu işaretleyin ve ucu uzunluğunu ve eşik uzunluğunu <8g> ve <8h> kullanarak tabandan belirleyin. Verileri 'dynamics.xlsx' dosyasına kaydetmek için tıklayın. seçeneğini tıklayarakFilopodial ucun protein yoğunluklarının izini sürmek ve rasatiyometrik analiz için tasarruf sağlamaktır.
   NOT: İpucu uzunluğu, analiz için kullanılan uçtaki piksel sayısını belirler. Yazılım, her çerçevedeki uçtaki piksellerin ortalama yoğunluk değerini döndürür. Eşik uzunluğu, filopodyumun (filopodial ucu) büyümeye başladığı (ve program ucun yoğunluk değerini izlemeye başladığında) tabandan uca minimum mesafeyi belirler. Bu nedenle uç uzunluğu eşik uzunluğundan daha küçük olmalıdır.
2. <9d> veya <9e> kullanılarak analiz edilecek arzulanan oranı tıklayın.
3. Orantılı verileri oluşturmak için karşılaştırma düğmesini <9a> tıklayın.

Results

Filamentöz aktin (f-traktin ¹⁸ , kırmızı) ve sitosolik referans (yeşil) için bir markör ile transfekte edilmiş COS hücrelerini kullanarak, aktin bakımından zengin filopodial çıkıntıları bulduk ( Şekil 3A , üst panel). Zaman serileri, filopodinin hızla uzaması ve geri çekilmesi olduğunu gösterdi ( Şekil 3A , orta panel). Görüntü analiz yazılımını kullanarak, bireysel filopodiyi izledik. El ile görüntü anal...

Discussion

Burada, filopodial büyüme dinamikleri ve konveks gövde algoritması yoluyla bu dinamik yapılardaki bağıl protein konsantrasyonlarının izlenmesi için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Yazılımı kullanarak, iki kanalın ( yani proteinler) göreli konsantrasyonlarının uzatma / geri çekme çevrimi boyunca belirlendiği ve ayrı klasörler halinde görüntü ve veri dosyaları olarak depolandığı tek bir programda üç kanala tek tek karşılaştırılabilir. Yazılım, rutin işlemlere ek olarak, ilgili deney için analizin optimize edilm...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	Yaşam Teknolojileri	31966-021
%10 Fetal sığır serumu	Biochrom AG	L11-044
Lipofektamin 2000	Yaşam Teknolojileri	11668-027
%1 penisilin / streptomisin	Biochrom AG	12212
Nörobazal Orta Yaşam Teknolojileri		21103-049
B27	Yaşam Teknolojileri	17504-044
HEPES (1M stok çözümü)	Yaşam Teknolojileri	15630
Sitrin-N1	Addgene	54593
Labtech	Thermo	155411
Glutamax-I	Thermo	35050-061
Hela	Leibniz Enstitüsü DSMZ	ACC-57
COS 7	Leibniz Enstitü DSMZ	ACC-60
3T3 hücreleri	Leibniz Enstitüsü DSMZ	ACC-59
Mikroskop	Nicon Eclipse
Kamera	Andor	DU888 Ultra
Konfokal	Ünite Yokagawa	CSU-X1
Piruvat	Gibco	31966-021