Bitkisel Tıbbın Hazırlanması: Er-Xian Kaynatma ve Er-Xian içeren Serum In vitro Deneyler

Çalışmaya ve geleneksel bitkisel tıbbın uygulanmasına olan ilgi günümüzde artmaktadır. Kimyasal maddelerin kesin olduğu modern ilaçların aksine bitkisel formüllerin bilinmeyen bazı bileşenleri vardır ve aktif bileşiklerinin verilmesini sağlamak için ekstraksiyon işlemleri gerektirir. Çoğu araştırma, bütün ot veya bitkisel formülün temsilcisi olarak iyi bilinen bir yapıya sahip küçük bir bileşik seçmeye çalışsa da, ne farmakolojik etkinlikler ne de mekanizmalar eşdeğer ^{1 , 2} olarak kabul edilemez. Parmak izi kompleks bitkisel formüllerin bileşenlerini analiz etmeyi sağlarken, bazı bileşenler hala net bir şekilde analiz edilmediğinden, çalışma ³ için tüm özütleri birleştirirken bir meydan okumaya neden olur. Çok sayıda bileşenin / ekstraktların etkileşimleri, bitkisel ilaçların terapötik etkilerine aracılık eder. Bu avantajı korumak için, geleneksel ekstrakt form-dekoctİyon hala klinikte yaygın olarak kullanılmaktadır. Ekstrakt prosedürü, terapötik etkinlik üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu için, özellikle in vivo çalışmalar için ^{4 , 5} için geleneksel su sıkılmasının standart bir protokolü gereklidir.

Öte yandan, farmakolojik mekanizmaları araştırırken, in vitro veya ex vivo çalışmalar sırasında bitkisel açma maddelerinin uygulanması da bir mücadeledir. İlaç içeren serumun konsepti ilk kez Tashino tarafından 1988'de ⁶ önerildi. O zamandan beri, artan sayıda araştırmacı onu bitkisel ilaç ^{7 , 8 , 9'a} uyguladı. İlaç içeren serumun metodu, serumun belli bileşenlerinin etkisi gibi bazı kısıtlamalara sahip olmakla birlikte, fizyolojik koşulları yakından taklit eden bir yöntem olarak kabul edilmektedir.

14 , menopoz osteoporozu ^{15 , 16 , 17} , prematür over yetmezliği ¹⁸ , meme kanseri ¹⁹ , yumurtalık kanseri ²⁰ ve ertelenmiş ergenlik 21'in tedavisinde de uygulanmıştır. Burada, er-xian ekstraksiyonunun (EXD) ve ilacı içeren serumun hazırlanması için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Buna ek olarak, fare menopoz osteoporotik modellerine EXD ve EXD içeren serumun uygulanmasını açıklıyoruz.

Bir EXD, 9 gr Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii'den oluşur Radix Morindae Officinalis ve Radix Angelicae Sinensis ve her biri yetişkin hasta başına günde 6 g Cortex Phellodendri ve Rhizoma Anemarrhenae . Bir fare için eşdeğer doz, aşağıdaki denklem ^22'ye dayanılarak 0.1418 EXD / kg / gün'dür: dB = dA * RB / RA * (WA / WB) ^1/3 . DA ve dB, sırasıyla insan ve fare vücut ağırlığı başına doz (mg / kg) anlamına gelir. Dozun mg / kg olarak, EXD / kg sayısı ile değiştirilir. RA ve RB sırasıyla vücut yüzey alanı (m ² ) / vücut ağırlığı (kg) ile orantılı insan vücut faktörünü ve fare gövde faktörünü temsil eder) ^2/3 (Bkz. Tablo 1 ). WA ve WB sırasıyla insan ve fare vücut ağırlığını (kg) gösterir.

Protokol, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı'nın hayvan bakım rehberlerini takip eder ve hayvan deneyleri Şanghay Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanır.

1. Protokol I: EXD'nin hazırlanması

1. Hesaplama
   1. EXD'yi 10 altı aylık bayan Baskı Kontrol Bölgesi (ICR) farelerine (0.02 kg / fare), haftada 5 gün 12 hafta süreyle uygulayan bir tedavi grubuna uygulayın.
      NOT: Toplam 1.702 EXD'ye ihtiyaç vardır. EXD'ler ayrı artışlarla ölçülür, çünkü gerçek uygulamada 2 EXD uygulayın.
   2. Fare başına uygulanan EXD hacmini hesaplayın ( yani, V = (0.1418 EXD / kg • gün) * (0.02 kg / fare) * 50 mL / EXD = 0.14 mL / fare • gün.
2. Islatma
   1. İki EXD'nin ( örneğin Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedi (18 g), Radix Morindae Officinalis'in (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) ve Rhizoma Anemarrhenae (12 g), toplam 96 g) bir kapaklı bir kaba koydu.
      NOT: Seramik bir kap tavsiye edilir.
   2. Çiğ otları 500 mL damıtılmış su ile 1 saat süreyle macerante edin; Su otları bir inç kadar kaplamalıdır. Tüm otları iyice ıslatın.
3. İlk suda kaynatma
   1. Otlar, su kaynarcaya kadar yüksek sıcaklıkta bir gaz ocağı veya bir indüksiyon ocağı kullanarak ısıtın (yaklaşık 5 - 10 dakika, süre, ısıtma gücüne, kaba ve otların miktarı ve suya bağlıdır). Gücü 2 saat daha düşük bir kaynatma değere çevirin.
4. İlk filtrasyon
   1. Normal filtre kağıdıyla veya gazlı bezle ve pamuklu, 500 mL'lik cam bir behere koyun. Dikkatli bir şekilde, kaynatmayı filtre vasıtasıyla behergöre dökün. Şifalı bitkiler kabın içinde bırakın.
   2. Geri kalan bitki kalıntılarını geri getirin oFiltre kağıdını kaba koyun.
5. İkinci suda kaynatma
   1. Otlarla birlikte kaba damıtılmış su ekleyin; Otları bir inç kadar kapağı olsun.
   2. Adım 1.3'ü tekrarlayın.
6. İkinci filtrasyon
   1. 1.4.1 ve 1.4.2 adımlarını tekrarlayın.
   2. İkinci kaynatmayı aynı behere dökün. Birinci ve ikinci dekatikleri birlikte karıştırın.
7. konsantrasyon
   1. Beferleri asbest içermeyen tel gazlı bezli bir gaz ocağının üzerine koyun, kaynatıp düşük bir kaynatmayla ısıtın ve yavaşça ve bir cam çubukla karıştırın.
   2. Yoğuşma 200 mL'ye düştüğünde, 500 mL'lik bir behere aktarın.
   3. Yıkama 100 mL'ye düşene kadar adım 1.7.1'i tekrarlayın.
8. Depolama ve yönetim
   1. Konsantre kaynatmayı steril bir cam şişeye aktarın. Oda sıcaklığına kadar soğutunYeniden (RT). Bir hafta içinde kullanıyorsanız 4 ° C'de veya uzun süre depolamada -70 ° C'de saklayın.
   2. Bir tenteli iğne kullanarak, ovarektomize (OVX) farelere günde bir kez, 12 hafta boyunca haftanın 5 günü, 0.14 mL / fare eksiltme uygulayın.

2. Protokol II: EXD-içeren Serumun Hazırlanması

1. Hesaplama
   1. Her sıçanın vücut ağırlığı (1 aylık) olarak 0.15 kg kullanarak sıçan eşdeğer dozunu (RED) hesaplayın: dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) ^1/3 = 0.111 EXD / kg / gün.
      NOT: 100 mL kültür ortamı (% 10 EXD içeren serum) hazırlamak için toplam 10 mL EXD içeren serum gereklidir. Her sıçandan 2 mL serum sağlaması bekleniyor. Böylece, 6 sıçan (% 20'lik bir kayıp dikkate alınır), 3 gün boyunca günde bir kez EXD uygulaması için gereklidir. EXD sayısı: (0.111 EXD / kg • gün) * (0.15 kg / sıçan) * (6 sıçan) * (3 gün) = 0.300 EXD. Yine, EXD'ler ayrı artışlarla ölçülür,1 EXD kullanın.
   2. Sıçan başına uygulanan EXD hacmini hesaplayın ( yani, V = (0.111 EXD / kg • gün) * (0.15 kg / sıçan) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / sıçan • gün.
2. Islatma
   1. 1 EXD'ye ait hammaddeleri kapaklı bir kaba koyun. Çiğ otları damıtılmış suda 1 saat maceratlayın; Su otları bir inç kadar kaplamalıdır. Tüm otları iyice ıslatın.
3. İlk suda kaynatma
   1. Otlar, yüksek kaynaklarda kaynar su gelene kadar indüksiyon ocağı kullanarak ısıtın (yaklaşık 5 - 10 dakika; süre, ısı gücüne, konteynere ve otlar ile suyun miktarına bağlıdır). Gücü 2 saat daha düşük bir kaynatma noktasına getirin.
4. İlk filtrasyon
   1. Normal filtre kağıdıyla veya gazlı bezle ve pamuklu, 500 mL'lik cam bir behere koyun. Dikkatli bir şekilde, kaynatmayı filtre vasıtasıyla behergöre dökün. Şifalı bitkiler kabın içinde bırakın.
5. İkinci suda kaynatma
   1. Otlarla birlikte kaba damıtılmış su ekleyin; Otları bir inç kadar kapağı olsun.
   2. Adım 2.4'ü tekrarlayın.
6. İkinci filtrasyon
   1. 2.5.1 ve 2.5.2 adımlarını tekrarlayın.
   2. İkinci sıkma işlemini, adım 2.4.1'deki gibi aynı behça boşaltın ve birinci ve ikinci dekatikleri birlikte karıştırın.
7. konsantrasyon
   1. Asfalt içermeyen tel gazlı bezli bir gaz ocağı üzerine beheri koyun, kaynatmayı düşük bir kaynatmayla ısıtın ve yavaşça ve bir cam çubukla karıştırın.
   2. Yoğuşma 100 mL'ye düştüğünde, 100 mL'lik bir behere aktarın.
   3. Yıkama 50 mL'ye düşene kadar adım 2.7.1'i tekrarlayın.
8. Depolama ve yönetim
   1. Konsantre kaynatmayı sterilizeIle cam şişe. Oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir hafta içinde kullanıyorsanız 4 ° C'de veya uzun süre depolamada -70 ° C'de saklayın.
   2. Intragastional olarak 0.83 mL / sıçan günde bir kez 3 gün boyunca uygulayın.
9. EXD içeren serum preparatı
   1. Farelerin son uygulanmasından 1 saat sonra intraperitonal olarak 300 mL / 100 g 80 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg xylazin enjekte ederek anestezi uygulayın. Çimdikleme ile doğru anestezi doğrulayın.
   2. Sıçanın cildi ve peritonunu, karın bölgesinden göğüs dibine bir bistül (veya düz ameliyat makası) kullanarak incise edin. Sırasıyla yaklaşık 5 cm ve 0.5 cm'lik bir uzunluk ve derinlik kesiği oluşturun. Doku kağıdı kullanarak karın iç organını sola doğru hareket ettirin.
   3. Doku kağıdı kullanarak, damarı açıkça ortaya çıkarmak için karın aortunun bağ dokusunu çıkarın.
   4. Karbon aortundan, 10 mL'lik, 22 ölçüslü bir şırınga kullanarak kanı yavaşça çekin. Şuraya aktar:İğneyi çıkardıktan sonra 15 mL'lik steril bir tüp; Bir fare 8-10 mL kan üretebilir.
      NOT: Kan çizimine başlanırken ve çizim tamamlandıktan sonra ölü olan sıçan canlı olmalıdır ( yani, abdominal aort titreşirken).
   5. Oda RT'da 30 - 60 dakika boyunca dik bir konumda kan pıhtılaştırın. 500-600 xg'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Tüm süpernatanı (serum) dikkatli bir şekilde bir 50 mL steril tüp içine yerleştirin ve tüm serumu (farklı hayvanlardan) karıştırın.
   6. Serumu 56 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe ederek ısı inaktivasyonu yapın. Serumu, 0.22 um gözenek boyutlu bir hidrofil polietersülfon membranlı bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Serumu taze veya -20 ° C'de saklayın.
10. Kontrollü ilaç içeren serum preparatı (kontrol grubunda kullanılır)
    1. Her bir fare günde bir kez aynı miktarda tuzlu su (0.83 mL) ile 3 gün süre ile idare edilir. Diğer adımlar adım 2.9'daki ile aynıdır.
11. Uygulama
    1. Her 100 ml'lik orta ve artı% 1 penisilin-streptomisin (PS) ^23'e 10 mL EXD içeren serum veya ilaç içeren serum ekleyin.

EXD'nin OVX farelerinin kemik yoğunluğuna etkisi

Omurga vertebrası bölümündeki hematoksilin ve eozin boyama, OVX grubundaki kişilerle ( Şekil 1A , sol panel) karşılaştırıldığında in vivo EXD tedavisinden sonra artmış kemik trabekülleri gösterir ( Şekil 1A , sağ panel). Şekil 1B , 12 haftalık EXD tedavisine sahip OVX farelerindeki ( Şekil 1B , sol panel) ve 4. OVX farelerdeki 4. lomberin temsilci μCT görüntülerini göstermektedir ( Şekil 1B , sağ panel). EXD ile tedavi edilen farelerin bel omurlarının içinde daha fazla trabeküler kemik görülür ve kontrol OVX farelerine göre daha fazla görülür. ΜCT görüntülemeden elde edilen veriler, 4. lomberin artmış kemik hacmi / doku hacmi (BV / TV), trabeküler sayı (Tb. N) ve trabeküler kalınlık (Tb. Th) ve azalmış trabeküler aralığının (Tb. Sp) EXD farelerde ( Şekil 1C ).

EXD'nin OVX farelerinden kemik mezenkimal kök hücrelerinin (bMSC'ler) osteojenezine etkisi

Şekil 2 , bMSC'lerin osteojenik potansiyeli göstermektedir. OVX farelerinin bMSC'leri 7 gün boyunca kültürlendiğinde yağ damlacıkları (yıldız, düzensiz şekli bir lipid damlacıksı) oluşur ( Şekil 2A , sol panel). EXD ile tedavi edilen farelerde, yağ damlası yerine kemik nodülleri (ok) oluşur ( Şekil 2B , sağ panel). Bir alkalin fosfataz (ALP) analizi, kontrol OVX farelerinden ( Şekil 2B , sol panel) bMSC'lerinkine kıyasla, EXD ile muamele edilen bMSC'lerde ( Şekil 2B , sağ panel) daha fazla ALP pozitif hücrenin (mor) tespit edilebildiğini gösterir.

OVX ve EXD fareleri arasındaki gen ekspresyonundaki değişikliklers = "xref"> 24

Hiyerarşik kümeleme, in vitro OVX ve EXD ile muamele edilen fareler arasında (toplam: 26.991 gen), bMSC'lerde mikrodizinin ortaya çıkardığı 389 genin ifadesinin katlandığı (> 1.5, OVX olmayan farelerle normalleştirildi) olduğunu gösterir ( Şekil 3 ). Yeşil ifadenin yukarı doğru düzenlendiğini, kırmızı ise ifadenin aşağıya düzenlendiğini gösterir. Aynı gruptaki üç numune, profilin güvenilir kalitesini gösteren ilk önce bir araya getirilir. Şekil 4 , hem in vivo hem de in vitro olarak EXD tarafından hedeflenen örtüşen sinyal yolunu göstermektedir.

Şekil 1: EXD'nin Kemik Morfolojisi Üzerindeki Etkisi.
( A ) OVX ve EXD ile muamele edilmiş farelerin lomber 4'üncü bölümünün H & E boyanması. ( 4. trabeküler kemiğin üç boyutlu μCT rekonstrüktif görüntüleri. ( C ) μCT'nin tayini. BV: kemik hacmi, TV: doku hacmi, Tb.N: trabeküler sayı, Tb.Th: trabeküler kalınlık ve Tb.Sp: trabeküler aralık. Sütunlar, ortalamaları ± SE'yi temsil etmektedir. Grup başına n = 6. * P <0.05, ** p <0.01 EXD'ye OVX'e karşı (Öğrencinin t-testi). ( AC ) Shufen Liu ve ark. 24. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: EXD'nin bMSC Farklılaşmasına Etkisi.
( A ) Bei'den sonra 7 gün boyunca kültürlenen bMSC'lerin görüntüleriOVX veya EXD ile muamele edilmiş farelerin femurundan izole edilmiştir. * Bir yağ damlasını gösterir. Bir ok, bir kemik nodülünü gösterir. ( B ) 7 gün boyunca kültürlenen OVX ve EXD ile muamele edilen bMSC'lerin ALP boyaması (mor ALP'yi pozitif gösterir). ( C ) ( B ) miktarının tayini. Sütunlar, her grup için üç yemekten (altı fare) ortalama ± SE'yi temsil etmektedir. ** p <0.01 EXD'ye OVX'e karşı (Öğrencinin t-testi). ( AC ) Shufen Liu ve ark. 24. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 3: EXD'nin Gen Ekspresyon Profili Üzerindeki Etkisi.
OVX ve EXD bMSC'lerindeki 389 genin ekspresyonunun hiyerarşik kümelenmesinin ısı haritası Ayrılma sonrası 7. gününde hasat edildi. Ölçek (küçük resim) OVX olmayan bMSC'ler ile normalleştirilen kıvrım değişikliklerini gösterir. Genlerin listesi Ek Dosya 1'de sağlanmaktadır . Bu rakam Shufen Liu ve ark. 24. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: EXD'nin Hem In Vivo Hem de In Vitro Denemelerde Çakışan Sinyalizasyon Yoluna Etkisi.
EXD in vivo ve EXD içeren serum tarafından in vitro olarak KEGG yoluna dayalı ters çevrilen ilk 10 örtüşen sinyal yolağı. Yollarla ilgili genler Ek Dosya 2'de gösterilmektedir ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: Farklı Türlerde R faktörü.
Farmakolojik araştırmada yaygın olarak kullanılan 8 türe ait R faktörü. R-faktörü şu orantılıdır: (vücut yüzey alanı (m 2 ) / bOdy weight (kg)) 2/3 .

Ek Dosya 1.
Upregüle veya downregüle edilmiş 389 genin ≥1,5 kat üzerine bilgisi, ancak in vivo EXD ile kurtarıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Ek Dosya 2.
Hem in vivo hem de in vitro deneylerde sinyal yolağı hakkında bilgi (KEGG yoluna dayalı) ve ilgili genler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.