Bu çalışma, trombosit yapışması, yayılması ve akış altında salgı çalışması için bir floresan mikroskopi tabanlı yöntem açıklanmaktadır. Bu çok yönlü platform tromboz ve hemostaz üzerine mekanik araştırma için trombosit fonksiyonunun araştırılmasını sağlar.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Akım altında Trombosit Degranülasyonu ve Salgılamanın Canlı Hücreli Görüntüleme
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Kan trombositleri, hemostazda vasküler ihlalleri gidermek için trombüs oluşumu için önemli oyunculardır. Ayrıca tromboz, vaskülatürü tıkayan tromboz oluşumu ve organları yaralamaya, hayati tehlike oluşturan sonuçlarla ilgilenmektedirler. Bu, trombosit fonksiyonu ve akış koşulları altında gerçekleşen hücre biyolojik süreçlerini izlemek için yöntemlerin geliştirilmesi üzerine bilimsel araştırmalara motive olur.
Trombosit yapışması ve toplanması, trombosit biyolojisinde iki temel olgu çalışması için çeşitli akış modelleri mevcuttur. Bu çalışma aktivasyon sırasında akım altında gerçek zamanlı trombosit degranülasyonunu incelemek için bir yöntem açıklamaktadır. Yöntem, geniş alanlı, ters çevrilmiş, LED tabanlı floresan mikroskop altında yerleştirilen bir şırınga pompası kurulumuna bağlı bir akış odası kullanır. Burada açıklanan kurulum, flüoresan etiketli antikorlar veya fluoresc tarafından gönderilen birden fazla florofor eşzamanlı uyarılmasına olanak tanırBoyalar. Canlı hücre görüntüleme deneylerinden sonra kapak gözlükleri statik mikroskopi ( örn. Konfokal mikroskopi veya taramalı elektron mikroskobu) kullanılarak daha da işlenebilir ve analiz edilebilir.
Giriş
Trombositler kan akışında dolaşan anükleat hücrelerdir. Ana işlevi yaralanma yerlerinde vasküler yaraları kapatmak ve kan kaybını önlemektir. Bu yaralanma yerlerinde, subendotelyal kollajen lifleri maruz kalır ve daha sonra multimerik protein olan von Willebrand faktörü (VWF) ile kaplanır. VWF, trombosit hızını yavaşlatan hücre yüzeyi 1 üzerindeki glikoprotein Ibα-IX-V kompleksine bağlı olan bir mekanizma içinde dolaşımdaki trombositler ile etkileşime girer. Bu, yüksek makaslama hızlarında özellikle önemlidir. Trombositler daha sonra kollajenden aktive edici uyaranlar alırken morfolojik değişiklikler yaparlar. Bu, geri döndürülemez yayılma ve ....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Utrecht Üniversite Tıp Merkezi'nin Yerel Medikal Etik Komitesi, bu çalışmanın da dahil olduğu ex vivo araştırma amaçları için kan çizimini onayladı.
1. Çözüm Hazırlama
- 10 mM HEPES, 0.5 mM Na2HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KC1, 1 mM MgS04 ve 5.55 mM D-HPO4 çözeltisi ile bir 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) Tyrode tamponu hazırlayın. Damıtılmış su içindeki glikoz.
- Tamponun iki çeşidi yapın: pH seviyelerini sırasıyla 6.5 ve 7,4 olarak ayarlayın. Deneylerin her günü için taze tampon yapın. Belirtildiği yerlerde, 10 ng / mL prostasiklin ile tamamlayın.
- Damı....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
Şekil 1 , akış odasının görüntülerini ve deney düzeneğini göstermektedir; Silikon levhanın konumu ve boyutları; Ve hortum bağlantıları. Şekil 2 , akış haznesinin boyutlarıyla ilgili ayrıntılar sunmaktadır. Şekil 3 ve Film 1 , platelet yapışmasının ve sabitlenmiş VWF üzerine yayılma görüntülerinin bir zaman serisini göstermektedir. CD63, dinlenme plateletlerinin hücre içi yoğun tanec.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Dünya çapında tromboz önde gelen ölüm ve morbidite nedenidir ve trombositler gelişiminde merkezi bir rol oynamaktadır. Bu çalışma akış altında trombosit degranülasyonunun canlı hücre görüntülemesi için bir yöntemi açıklamaktadır. Genellikle, trombositler harekete geçirildiğinde, tüm granül içeriği çözeltiye doğrudan salınır. Eşlik eden sonuçlar bunun mutlaka geçerli olmadığını göstermektedir. Yapışma ve degranülasyon sırasında, trombositler önemli miktarda polifosfat tutar ( Şekil 4 ). Ek olarak, multim.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
CM, C1 Hastalığı Önleyici Eksiklikler (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht ve Kan Transfüzyon Araştırması için Landsteiner Vakfı (LSBR) için Uluslararası Hasta Kuruluşu tarafından maddi desteği onayladı.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| 4-(2-hidroksietil)-1-piperazineetansülfonik asit (HEPES) | VWR | 441476L | |
| Na2< / sub>HPO<>sub4< / sub> | Sigma | S-0876 | |
| NaCl | Sigma | 31434 | |
| KCl | Sigma | 31248 | |
| MgSO4< / sub> | Merck KGaA | 1.05886 | |
| D-glikoz | Merck KGaA | 1.04074 | |
| Prostasiklin | Cayman Chemical | 18220 | |
| Tri-sodyum sitrat | Merck KGaA | 1.06448 | |
| Sitrik asit | Merck KGaA | 1.00244 | |
| Kapak camları | Menzel-Glä ser | BBAD02400500#A | 24 x 50 mm, No. 1 = 0.13 - 0.16 mm kalınlık. |
| Kromosülfürik asit (% 2 CrO3< / sub>) | Riedel de Haen | 07404 | CAS [65272-70-0]. |
| Von Willebrand faktörü (VWF) | kurum içi saflaştırılmış | ||
| Fibrinojen | Enzim Araştırma Laboratuvarları | FIB3L | |
| 4 kuyulu çanak, işlenmemiş | Thermo Scientific | 267061 | |
| İnsan Serumu Albümin Fraksiyonu V | Haem Technologies Inc. | ||
| Kan alma tüpleri, 9 mL, 9NC Pıhtılaşma Sodyum Sitrat %3.2 | Greiner Bio-One | 455322 | |
| Hücre analizörü | Abbott Diagnostics | CELL-DYN hematoloji analizörü | |
| Paraformaldehit | Sigma | 30525-89-4 | |
| Şırınga pompası | Harvard Aparatı, Holliston, MA | Harvard aparatı 14,5 | |
| 10 mL şırınga | 305959 | Luer-Lok şırınga | |
| Anti-CD63-biotin | Abcam | ||
| Anti-CD62P-biotin ve nbsp; | Ar-Ge D Sistemleri | Dy137 | |
| 4 ',6-Diamidino-2-fenilindol dihidroklorür (DAPI) | Polysciences Inc. | 9224 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 eşlenik | Thermo Scientific | S11223 | |
| Daldırma yağı | Zeiss | 444963-0000-000 | |
| Deterjan çözeltisi | Unilever, Biotex | ||
| Glycine | Sigma | 56-40-6 | |
| Polivinil alkol | Sigma | 9002-89-5 | Mowiol 40-88. |
| Tris hidroklorür | Sigma | 1185-53-1 | |
| 1,4-Diazabisiklo[2.2.2]oktan (DABCO) | Sigma | 280-57-9 | |
| Koyun Anti-hVWF pAb | Abcam | AB9378 | |
| Alexa fluor 488-NHS | Thermo Scientific | A20000 | |
| Gliserol | Sigma-Aldrich | 15523-1L-R | |
| Parafinn filmi | Bemis | PM-996 | 4 inç x 125 ft Rulo. |
| Silikon levha, takviyesiz, | Nagor | NA 500-1 | 200 mm x 150 mm x 0.125 mm. |
| Perfüzyon ve vakum kanalları ile özel kesim silikon levha | şirket içinde yapılmıştır | Silikon levhadan yapılmıştır takviyesiz (Nagor, NA 500-1) | |
| 1.5 mL tüpler | Eppendorf AG | T9661-1000AE | |
| Floresan mikroskop | Zeiss Observer Z1 | LED uyarma ışıkları ile donatılmıştır. | |
| Mikroskop yazılımı | Zeiss ZEN 2 | blue edition | |
| 18 G iğne (18 G x 1 1/2 "") | BD biosciences | 305196 | |
| NaCl | Riedel de Haen | 31248375 | |
| Tris | Roche | 10708976 | |
| Plastik pastör pipeti | VWR | 612-1681& | nbsp; 7 mL steril olmayan, 3 mL'ye kadar derecelendirilir. |
| Silikon boru | VWR | 228-0656 | İç çap. x Dış çap x Duvar kalınlığı = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm. |
| Mikroskop slaytları | Thermo Scientific | ABAA000001##12E | 76 x 26 x 1 mm, zemin kenarları 45 >, buzlu uç. |
Kaynaklar
- Springer, T. A. von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream. Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).
- Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells. Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013). <....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
