Kromatin İmmunopresipitasyon Yöntemi Kullanılarak c-KIT Ligand Promotör Analizi

Özet

DNA-protein etkileşimleri, çoklu biyolojik işlemler için gereklidir. Hücresel işlevlerin değerlendirilmesi sırasında, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen düzenlemesinin anlaşılması için vazgeçilmezdir. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), böyle etkileşimleri in vivo olarak analiz etmek için güçlü bir araçtır .

Özet

DNA replikasyonu ve onarımı, DNA rekombinasyonu ve gen ekspresyonu dahil olmak üzere çoklu hücresel süreçler, proteinler ve DNA arasında etkileşim gerektirir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimleri, hücre farklılaşması, hücre proliferasyonu, hücre döngüsü kontrolü, kromozom stabilitesi, epigenetik gen düzenlenmesi ve hücre dönüşümü gibi çoklu fizyolojik, patofizyolojik ve biyolojik fonksiyonları düzenler. Ökaryotik hücrelerde DNA, histon ve histokonsuz proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Deneyi (EMSA) ve DNase I ayak izi gibi DNA-protein etkileşimlerini analiz etmek için çeşitli teknik araçlar kullanılabilir. Bununla birlikte, bu teknikler protein-DNA etkileşimini in vitro olarak analiz eder, hücresel bağlam içinde değil. Kromatin immüno çökeltme (ChIP), proteinleri belirli DNA bağlama bölgelerinde yakalayan ve böylece DNA-protein etkileşimini tanımlayan bir tekniktirOnların kromatin bağlamı içinde. DNA-protein etkileşiminin sabitlenmesiyle, ardından ilgilenilen proteinin immüno çökmesi ile yapılır. Daha sonra, proteinin bağlı olduğu genomik bölge karakterize edilir. Burada, ÇIP'yi tarif eder ve tartışır ve transkripsiyon faktörü SMAD2'nin Transforma Edici Büyüme Faktörü-β (TGF-β) ile indüklenmiş SMAD2'nin tirozin-bağışıklık sisteminin promotör bölgesi içindeki SMAD Bağlama Elemanları'na (SBE) bağlanmasının tanımlanması için analitik değerini gösteririz Protein kinaz Kiti (c-KIT) reseptör ligandı Kök Hücre Faktörü (SCF).

Giriş

Ökaryotların çekirdeğinde DNA, histon proteinleri ve histolojik olmayan proteinler ile etkileşime girer ve kromatine yoğunlaştırılır. Fizyolojik, patofizyolojik ve hücre biyolojik bağlamında, hücresel fonksiyonlar mekansal olarak ve geçici olarak kromatin koordine edilmiş gen ifadesi ile kontrol edilir. DNA-protein etkileşimleri, DNA replikasyonu, rekombinasyon ve tamir gibi hücresel süreçlerin düzenlenmesinde ve protein ekspresyonunda önemli bir role sahiptir. Bu nedenle, DNA-protein etkileşimlerinin analizi, gen ekspresyonunun ve hücre fonksiyonunun değerlendirilmesinde vazgeçilmez bir araçtır.

Elektroforez (jel) Hareketlilik Kaydırma Testi (EMSA) ve DNase I ayak izi ^{1 , 2} gibi in vitro DNA-protein etkileşimlerini değerlendirmek için çeşitli teknikler mevcuttur. Bununla birlikte, bu teknikler, kromatin ve hücresel bağlamda protein-DNA etkileşimini analiz etmez. ChIP iSa tekniği, spesifik DNA bağlama alanlarına bağlı proteinleri yakalar ve böylece kromatin bağlamında DNA-protein etkileşimlerinin tanımlanmasını kolaylaştırır. Bu teknik esas olarak Gimour ve Lis tarafından, Escherichia coli ve Drosophila melanogaster ^{3 , 4'te} spesifik genlere RNA polimeraz II'nin bağlanmasının değerlendirilmesi için geliştirildi. DNA-protein komplekslerinin sabitlenmesiyle, bunu takiben kromatin ekstraksiyonu yapılarak DNA'nın ~ 200 baz çifti (bp) parçalara kesilmesi ile yapılır. Daha sonra, ilgili DNA'ya bağlı protein immüno çökeltme ile izole edilir. DNA-protein çapraz bağlantının tersine çevrilmesinden sonra, DNA arıtılır ve analiz edilir. Protein bağlama bölgelerinin analizi için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve hedef gen ⁵ içindeki protein bağlama alanının nükleik asit dizisine bağlıdır. DNA dizisinin bilinmesi durumunda, standart PolYmeraz Zincir Reaksiyonları (PCR), bilinen bağlama alanına bitişik spesifik primer çiftleri kullanılarak uygulanabilir. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qRT-PCR) de kullanılabilir ⁶ . Dizinin bilinmediği durumlarda, ChIP, DNA mikrodizileri (ChIP-on-chip), DNA dizilimi (ChIP-seq) veya klonlama teknikleri ^{7 , 8 , 9 ile birleştirilebilir} .

TGF-β yolu güçlü tümör baskılayıcı işlevlere sahiptir ve hücre farklılaşmasında önemli bir yol oluşturmaktadır. TGF-β1 ligandının kognat reseptör kompleksine bağlanması yoluyla aktive edilir ve SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonuna neden olur. Ortak mediyatör olan SMAD4 ile olan ilişkisini takiben, SMAD kompleksi çekirdeğe translokasyon yapar ve hedef genlerin promotörü bölgesi içinde SBE'ye bağlanır ve burada hücre döngüsü, apoptoz ve hücre farklılaşmasını kontrol eden genleri düzenlerüzerinde. TGF-β stimülasyonuna transkripsiyonel yanıt hücre tipi ve bağlam-spesifik ^10'dur . Son zamanlarda, TGF-β ve c-KIT yolu arasında olumlu bir geri besleme döngüsü tanımladık ¹¹ . Bu modelde, TGF-β1 ile aktive olan SMAD2, c-KIT ligand yükselticisine bağlanır ve ekspresyonunu ve sekresyonunu indükler. Daha sonra, c-KIT ligandı, c-KIT reseptörünü otomatik ve para-kreynik biçimde aktive eder. C-KIT reseptör aktivasyonu, JAK1 / 2 yoluyla STAT3 Tyr ⁷⁰⁵ fosforilasyonuna neden olur. STAT3-aktivasyonu ve nükleer translokasyonu takiben STAT3, TGF-β1 ligand genine bağlanır ve ekspresyonunu düzenler.

Burada SMAD2'nin c-KIT reseptör ligand yükselticisine bağlanması ve Sinyal Transdüseri (ve) Aktivatörün (Transkripsiyon 3) (STAT3'in TGF-β1'e bağlanması) tanımlanması için ChIP analizinin temel rolünü gösteriyoruz gen).

Protokol

1. Çözümlerin Hazırlanması

1. Her bir deney için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın.
   1. Sabitleme çözümü için % 37 formaldehit hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın. 1X Fosfat Tamponlu Tuz (PBS) içinde% 1.42'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin.
      DİKKAT: Formaldehit tahriş edici, aşındırıcı, mutajenik, teratojenik ve kanserojen olarak sınıflandırılmıştır. Beslenmeyin. Gaz / duman / buhar / sprey solumayın. Havalandırmanın yetersiz olduğu durumda solunumla ilgili uygun ekipman giyin. Deri ve gözlerle temasından kaçınınız. Oksitleyici maddeler, indirgeyici maddeler, asitler, alkaliler ve nem gibi bağdaşmayan maddelerden uzak tutun.
   2. Glisin durdurma çözeltisi çözeltisi için, 1x PBS solüsyonunda 0.125 M glisin hazırlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
   3. Hücre sıyırma çözeltisi için, dH20 içerisinde 1x PBS solüsyonu hazırlayın ve buz üzerinde saklayın. Kullanımdan hemen önce, proteinaz inhibitörü fenilmetilsülfonil fluorür (PMSF) t0.5 mM nihai konsantrasyon.
      DİKKAT: PMSF aşındırıcı ve toksik olarak sınıflandırılmıştır; Koruyucu giysiler giyin ve havalandırılan bir alanda kullanın.
   4. Doğrudan hücre liziz tamponunu (20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 85 mM KCI ve% 0.5 NP40) kullanmadan önce, 1X Proteaz İnhibitörü Kokteyl (PIC; dimetil sülfoksitte 100X stok solüsyonu (DMSO): 104 mM 4- 2-aminoetil) benzensülfonil fluorür hidroklorid (AEBSF), 80 uM aprotinin, 4 mM enzatin, 1.4 mM E-64, 2 mM leupeptin ve 1.5 mM pepstatin A) ve 0.5 mM PMSF.
   5. Çekirdek liziz tamponunu (50 mM Tris-Cl, pH 8.0, 10 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ve% 1 SDS) kullanmadan önce doğrudan 1X PIC ve 0.5 mM PMSF ilave edin.

2. Hücre Tespiti ve Kesme

1. 10 cm doku kültürü plakaları üzerinde 70-80% konfluansa hücreleri büyütün. Hücreleri deneysel amaçlar doğrultusunda uyarırlar.
2. Doku kültürü ortamı çıkarın, 5 mL sabitleme solüsyonu ekleyin ve inkübe edin.Hücreleri titreşimli bir platformda oda sıcaklığında 10 dakika bekletin.
3. Sabitleme çözeltisini çıkarın ve hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın.
4. 1x PBS'yi çıkarın, 5 mL glisin durdurma çözeltisi ilave edin ve hücreleri sallanan bir platformda oda sıcaklığında 5 dakika boyunca inkübe edin.
5. Glisin stop-fix çözeltisini çıkarıp hücreleri 10 mL buz soğukluğunda 1x PBS ile iki kez yıkayın.
6. 1x PBS'yi çıkarın, 2 mL hücre kazıma çözeltisi ekleyin ve hücreleri bir kazıyıcı kullanarak hasat edin. Hasat edilen hücreleri buz üzerinde konik bir tüpe aktarın.
7. Örnekleri 600 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
8. Süpernatantı çıkarın, pelleti 1 mL'lik 1X hücre liziz tamponunda tekrar süspansiyon haline getirin ve 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Alternatif olarak, pelet sıvıyı sıvı nitrojende hızlı bir şekilde dondurun ve -80 ° C'de saklayın.
9. Pellet hücre liziz tamponunda bir kez yeniden süspansiyon haline getirildiğinde, hücre süspansiyonunu buz gibi dounce homojenleştiriciye aktarın ve bir B tipi böcek kullanarak 10 vuruş boyunca atınE hücre parçalanması için.
10. Hücre süspansiyonunu bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 2,400 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
11. Süpernatantı atın, 350 uL çekirdek sindirim tamponunda pellatı tekrar süspanse edin ve 37 ° C'de 5 dakika boyunca inkübe edin.
12. Mikrokakal nükleaz (1 U / μL) ekleyin ve vorteksleme ile karıştırın. Numuneleri 37 ° C'de 5-20 dakika inkübe edin; Numuneleri her 2 dakikada bir ters çevirerek karıştırın.
    NOT: Zaman ve enzim konsantrasyonu hücre çizgileri arasında farklıdır ve optimal olmayan enzimatik kesme durumunda optimizasyon gerektirebilir.
13. Alternatif olarak, piyasada bulunan sonikatörler kullanılarak sonikasyon ile kromatin makaslama elde edin.
    NOT: Sonication koşulları optimizasyon gerektirir. 300 uL'lik bir örnek hacmi ve% 25'lik bir örnek işleme gücü kullanılarak bir optimizasyon örnek protokolü aşağıda sağlanmaktadır.
    1. Adım 2.10'ın ardından süpernatanı atın ve n'yi tekrar süspanse edin1,0 mL ticari yılan tamponunda nükleer pellet.
    2. Üç 1.7 mL mikrosantrifüj tübüne tekrar süspansiyon haline getirilmiş nükleer pelletden 300 uL alikot altına alın. Onları buz koyun.
    3. Optimum sonikasyon koşullarını belirlemek için sabit renk kromatininin 3 kısımlarını% 25'lik bir güçle 3 farklı koşul kullanarak kesilin:
       Her bir darbe arasında buz üzerinde 30 saniye dinlenme ile 20 sn'lik 5 puls.
       Her puls arasında 10 saniye, buzda 30 saniye dinlenme.
       20 puls, her biri 20 s, her nabız arasında buz üzerinde 30 s dinlenme ile.
    4. Aşağıda özetlenen şekilde Adım 2.15 ile devam edin.
14. Mikrokokal nükleaz ile kuluçkadan sonra reaksiyonu durdurmak için 7 uL buz soğukluğunda 0,5 M EDTA ilave edin.
15. Numuneleri kesilmiş DNA ile 16,200 xg ve 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
16. Kesilmiş DNA içeren süpernatanı yeni bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Onaylamak için ayrı bir mikrosantrifüj tüpüne 50 uL'lik kısım ilave edinDNA'nın ccessful makaslama (bölüm 3). İmmünopresipitasyon için hemen geri kalan hacmi kullanın (bölüm 4) veya -80 ° C'de saklayın.

3. Kesme Verimliliğinin Doğrulanması

1. Adım 2.16'dan kesilmiş kromatin 50 mcL'ye bölünene, 150 uL nükleazsız dH2O ve 10 uL 5 M NaCl ekleyin.
2. Çapraz bağları tersine çevirmek için numuneleri 65 ° C'de 4 saat inkübe edin.
3. 2 μL RNase A (10 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 37 ° C'de 15 dakika inkübe edin.
4. 10 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin ve numuneleri 42 ° C'de 90 dakika inkübe edin.
5. DNA'nın saflaştırılması için bir fenol / kloroform ekstraksiyonu yapın ¹² .
   1. 200 uL'lik nihai bir hacme kadar nükleaz içermeyen su ekleyin. 200 μL fenol: kloroform: izoamil alkol (25: 24: 1) numuneye ekleyin ve 20 saniye vorteks ekleyin.
   2. Oda sıcaklığında santrifüjleyin16.000 x g'de 5 dakika süreyle kullanılır. Dikkatle üst sulu fazı çıkarın ve yeni bir tüpe aktarın. Pipetleme sırasında herhangi bir fenol taşımamaya dikkat edin.
   3. 0.1 hacim 3 M sodyum asetat (NH4OAc), pH 5.2 ilave edin ve tüpü bir parmakla birkaç kez hafifçe vurarak karıştırın. 2.5 hacim buz soğukluğunda% 100 etanol ilave edin ve 5 saniye vorteksleyerek karıştırın. Örnek O / N'yi -20 ° C'de veya en az 1 saat süreyle -80 ° C'de inkübe edin.
   4. CDNA pelet için 4 ° C ve 16.000 xg'de 30 dakika için numune santrifüjleyin.
   5. Peleti bozmadan süpernatanı dikkatlice çıkarın. 1 mL RT,% 70 etanol ekleyin ve tüpü birkaç kez ters çevirin.
   6. Numuneyi 4 ° C'de ve 16.000 x g'de 2 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkarın.
   7. Pelleti oda sıcaklığında 5-10 dakika boyunca kurutun. Pelleti 30 uL dH2O içinde tekrar süspanse edin.
6. % 1 TAE ile jel elektroforezi için saflaştırılmış DNA'nın 5 ve 10 uL'lik kısımlarını kullanınAgaroz jeli.
   NOT: Başarılı bir kromatin makaslama, 200-1,500 bp'lik DNA örüntüsü ile sonuçlanır. Kesme başarısız olursa, kesme aşamasının (aşama 2.12) inkübasyon süresini 5, 10 ve 15 dakika olarak değiştirerek, spesifik hücreler için optimum kesme koşullarını belirleyin.
7. Numunenin DNA konsantrasyonunu analiz etmek için kalan numuneyi kullanın. Kesilmiş kromatin örneğinde DNA konsantrasyonunu ters hesaplayın (basamak 2.16); Her bir tedavi grubu için immüno çökeltme için aynı DNA miktarlarını kullanın (bölüm 4).

4. İmmunopresipitasyon

1. 25 μL ChIP dereceli protein G manyetik boncuklar, 10 μL immüno-çöktürme seyreltme tamponu (stok çözeltisi:% 0.01 SDS,% 1.1 Triton X-100, 16.7 mM) ile 10-25 μg kesilmiş, çapraz bağlanmış kromatin birleştirin (adım 2.16) Tris-HC1, pH 8.0, 1.2 mM EDTA ve 167 mM NaCl) ve 1 uL PIC.
2. 4 saat inkübasyondan sonra, 1-10 μg antikor (antikor konsantratıAntikorun afinitesine bağlı olarak değişecektir; Başlangıçta üretici önerileri uyarınca kullanılmalı ve gerekliyse deneysel olarak optimize edilmelidir) 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne uygulandı ve 100 uL'lik bir son hacme dH20 eklendi.
   NOT: Yukarıda tarif edilen direkt immünopresipitasyon yöntemi yerine dolaylı immüno-çöktürme yöntemi, önce kromatin ile antikorları birleştirip daha sonra protein G manyetik boncuk ekleyerek kullanılabilir.
3. 4-12 saat boyunca 4 ° C'de örnekleri uçtan uca bir rotatöre inkübe edin.

5. Elüsyon

1. Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin. Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikçe, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve atın.
2. Boncukları üç kez 800 μL yıkama tamponu 1 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl, pH 8 ve 150 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik aya yerleştirin a.Manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın.
3. Boncukları bir kez 800 μL yıkama tamponu 2 (% 0.1 SDS,% 1 Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8, 20 mM Tris-HCI pH 8 ve 500 mM NaCl) ile yıkayın; Tüp birkaç kez ters çevirerek karıştırın. Tüpü manyetik standa yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yan tarafında biriktikten sonra yıkama tamponunu dikkatlice çıkarın ve atın.
4. 50 μL elüsyon tamponu (% 1 SDS ve 100 mM NaHCO ₃ ) içindeki boncukları tekrar süspansiyon haline getirin ve örnekleri oda sıcaklığında 15 dakika boyunca bir uçtan uca rotatörde inkübe edin.
5. Tüpleri manyetik bir stand üzerine yerleştirin ve manyetik boncuklar tüpün yanına bir kere toplandıktan sonra süpernatanı yeni bir tüpe aktarın.
6. Çapraz bağlanmayı tersine çevirmek için 6 μL 5 M NaCl ve 2 μL proteinaz K (0.5 μg / μL) ekleyin. Numuneleri karıştırdıktan sonra, numuneleri 2 saat 65 ° C'de inkübe edin.
7. DNA'nın saflaştırılması için bir phe gerçekleştirinNol / kloroform ekstraksiyonu ¹² (adım 3,5) ve daha sonra peleti 30 uL dH20 ile tekrar süspanse edin.
   NOT: Numuneler, protein bağlama alanları için doğrudan analiz edilebilir (bölüm 5) veya -20 ° C'de saklanabilir.

6. Bağlanma Sahası Analizi

1. PCR veya qRT-PCR kullanarak bilinen bir nükleik asit dizisi içindeki spesifik bağlanma alanları için bir analiz yapın. Primer tasarım için, geleneksel PCR veya qRT-PCR protokollerini uygulayın. İlgilenen protein bağlanma sitesini köprüleyen 150-400 bp'lik bir amplifikatı sentezlemek için primerleri tasarlayın ( Şekil 1 ).
2. Spesifikliği sağlamak için dört farklı DNA şablonu kullanarak PCR ayarlayın: i) ilgilenilen antikor ile immüno-çökeltilen immüno-çökelti ChIP'den DNA, ii) spesifik olmayan bir IgG antikoru ile immüno-çöktürülmüş ChIP'den DNA, iii) giriş DNA'sı ve iv) H20 Kontaminasyonu dışarı atmak için PCR için negatif kontrol. Yol uyarma durumunda, Immüno çökeltilmiş proteinin bilinen bir bağlanma bölgesine özgü farklı primerler seti kullanılarak beşinci bir şablon seçin.
   NOT: c-KIT ligand yükseltici analizi durumunda, c-KIT ligand yükseltici bölgedeki SBE'de TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasını göstermek için klasik PCR kullanın. Pozitif bir kontrol olarak, TGF-β ile indüklenen SMAD bağlanmasının bilinen bir hedefi olarak plazminojen aktivatör inhibitörü-1 (PAI-1) üzerinde PCR gerçekleştirin.

Sonuçlar

TGF-β1 ligandının aynı kökenli reseptör kompleksine bağlanması, SMAD2 / 3 transkripsiyon faktörlerinin serin fosforilasyonunu ve bunun ardından ortak mediatör SMAD4'le birleşmesini sağlar. SMAD kompleksi çekirdeğe taşır. TGF-β gen transkripsiyonunu hedef genlerin düzenleyici bölgelerindeki SBE'lere direkt olarak SMAD ile bağlanarak veya dolaylı olarak ilgilenilen genin ekspresyonunu düzenleyen transkripsiyonel aktivatörlerin veya baskılayıcıların SMAD tarafından düzenlenen ekspresyonu ar...

Tartışma

Bu raporda SMAD2'nin c-KIT ligand yükselticisindeki bir SBE'ye TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını ve STAT3'ün TGF-β1 ligand geni içindeki tanıma dizisine TGF-β1 ile indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz. Kromatin immüno çökeltme yöntemini kullanarak her iki transkripsiyon faktörünün sitokinle indüklenen bağlanmasını gösteriyoruz.

Kromatin immüno çökeltme, bir proteinin DNA'ya doğrudan bağlanmasını, protein ile DNA'nın bağlanmasını sağlayan uyarıların karakterize edilmesi v...

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi

Ad	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
HepG2 hücreleri	ATCC	HB-8065
Hep3B hücreleri	ATCC	HB-8064
TGF -β 1	Ar-Ge D Sistemleri	101-B1 10	ng/mL
Anti-SMAD2 antikoru	Hücre Sinyalleme Teknolojisi	5339	Kullanılan miktar/IP: 3 &mikro; g
Anti-STAT3 antikoru	Hücre Sinyal Teknolojisi	4904	Kullanılan miktar / IP: 3 ve mikro; g
ChIP-IT Proteini G Manyetik Boncuklar	Aktif Motif	53033
Proteaz İnhibitörü Kokteyl	Aktif Motif	37490
Mikrokokal	Nükleaz Hücre Sinyal Teknolojisi	10011
PCR ileri astar: PAI-1			Dizi: 5'-GGAAGAGGATAAAAGCTG-3'
PCR ters astar: PAI-1			Dizisi: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'
PCR ileri astar: SCF			Dizisi: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3'
PCR ters astar: SCF			Dizisi: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'
PCR ileri astar: TGF-β 1 (STB-1)			Sıra: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3'
PCR ters astar: TGF-β 1 (STB-1)			Sıra: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3'
PCR ileri astar: TGF-β 1 (STB-2)			Sıra: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3'
PCR ters astar: TGF-β 1 (STB-2)			Sıra: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3'