Yöntem makalesi

Yeniden Yönlendiren Sinir Devreleri: Hızlı Neurit Uzatımı ve Fonksiyonel Sinir Bağlantısı İçin Yeni Bir Yöntem

DOI:

10.3791/55697

⸱

13 Haziran 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physics, McGill University, 2Department of Neurology and Neurosurgery, Montreal Neurological Institute, 3Ananda Devices

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu prosedür, nevrit uzamasını yönlendiren mikropipetlere sabitlenmiş poli-D-lizin kaplı boncuklar kullanarak mikroakışkan odacıklar içerisinde düzenlenen nöritlerin hızla nasıl başlatılacağını, genişletileceğini ve bağlanacağını açıklamaktadır.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Beyin ve omurilik yaralanması kalıcı sakatlık ve ölümle sonuçlanabilir, çünkü nöronları uzun mesafelerde yeniden üretmek ve onları uygun bir hedefle doğru bir şekilde yeniden oluşturmak mümkün değildir. Burada yeni işlevsel nöronal devreleri uzun mesafelere hızla başlatmak, uzatmak ve tam olarak bağlamak için bir prosedür anlatılmıştır. Elde edilen uzatma hızları periferik sinir sisteminden (0.02 ila 0.04 mm / s) en hızlı büyüyen aksonların in vivo hızlarına göre 30 kat daha hızlı 1.2 mm / s üzerine ulaşır ve aynı için daha önce rapor edilenlerden 10 kat daha hızlıdır Gelişimin erken safhasındaki nöronal tip 4 . İlk olarak, sıçan hipokampal nöronlarının izole edilmiş popülasyonları 2-3 hafta boyunca mikroakışkan aygıtlarda yetiştirilir ve böylece hücrelerin hassas konumlandırılması kolay mikromanipülasyon ve deneysel tekrarlanabilirlik sağlar. Daha sonra, poli-D-lisin (PDL) ile kaplanmış boncuklar yapışkan madde oluşturmak üzere nevrit üzerine yerleştirilirEylemler ve pipet mikromanipülasyon elde edilen boncuk-nevrit kompleksi taşımak için kullanılır. Boncuk hareket ettikçe, yüzlerce mikrometreden uzatılabilen ve 1 saatten daha kısa bir sürede bir hedef hücrenin işlevsel olarak bağlanabilen yeni bir nevriti çıkartır. Bu süreç, nevrit büyümesini başlatmak için daha yavaş kimyasal stratejileri atlayarak, deneysel tekrarlanabilirlik ve manipülasyon kolaylığı sağlar. Burada sunulan ön ölçümler, nöronal büyüme oranını fizyolojik olanları aşmaktadır. Bu yenilikleri bir araya getirmek, benzeri görülmemiş derecede kontrol ile kültürdeki nöronal ağların kesin olarak oluşturulmasını sağlar. Sinir ağı içinde sinyal aktarımı ve iletişimi ile sinir ağının sınırlarını keşfetmek için bir oyun alanı olmanın yanı sıra, bol miktarda bilgi ve anlayışa kapı açan yeni bir yöntemdir. Potansiyel uygulamalar ve deneyler, nörona yeniden bağlanmayı amaçlayan terapiler için doğrudan etkileri olan yaygınL devrelerinde veya nörodejeneratif hastalıklarda.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Erişkin merkezi sinir sistemi (CNS) yaralanmaları aksonal yeniden büyümeyi sınırlayan çoklu mekanizmalara bağlı kalıcı sakatlıklara neden olabilir 1 . Yaralanmadan sonra, birçok CNS aksonları yeni bir büyüme konisi oluşturmaz ve etkili bir rejeneratif yanıt 2 oluşturmaz. Dahası, MSS lezyonlarını çevreleyen hasar ve skar dokusu , aksonal büyümeyi 1 , 2 , 3 önemli ölçüde inhibe eder. Hasardan sonra SSS yenilenmesini teşvik eden güncel terapiler yaralı nöronun intrinsik büyüme potansiyelini arttırmaya ve miyelin enkazı ve glial skarla ilişkili aksonal uzantı inhibitörlerini maskelemeye odaklanmıştır 1 , 3 . Buna rağmen, uzun aksonları uzak hedeflere yeniden üretme kapasitesi ve uygun fonksiyonel sinapslar oluşturma kapasitesi ciddi derecede sınırlı kalır 4 , 5 , 6 , 7 .

Bu çalışmada, mikro kapsüller, pipet mikromanipülasyonu ve mikroakışkan aygıtlar, yeni işlevsel nöronal devreleri uzun mesafelere hızla başlatmak, uzatmak ve tam olarak birleştirmek için kullanılmaktadır. Önceki çalışma, poli-D-lizin kaplı boncukların (PDL-boncuklar), sinaptik vezikül komplekslerinin kümelenmesi ve işlevsel presinaptik butonların oluşumunu takiben membran yapışmasını indüklediğini göstermiştir 8 . Ayrıca, presinaptik farklılaşma sonrasında PDL-boncuk mekanik olarak çekildiğinde, sinaptik protein kümesi boncuk izleyerek yeni bir nörit başlatan 9 da gösterildi. Aşağıdaki prosedür, bu gerçeği, sıçanların embriyonik hipokampal nöronlarını, nöronalin tam olarak yeniden bağlanması için polidimetilsiloksan (PDMS) mikroakışkan aygıtları kullanarak lamel üzerinde organize bölgelere kültürleme yeteneği ile birlikte kullanmaktadırdevre.

Bu PDMS mikroakışkan aygıtları, zehirli değildir, optik olarak şeffaftır ve mikrokanalların bir sistemi ile bağlı iki bölmeden oluşur. Bir lamel üzerine monte edildikten sonra, her cihaz, nöronal büyümeyi yönlendirmek ve in vitro ortamda 4 haftadan daha uzun süre kesin kalıplarda sağlıklı nöronal kültürleri korumak için bir kalıp görevi yapar.

Burada, yeni nevritin uzantısı ve işlevselliğinin sınırlarını araştırmak için bir çerçeve sunulmuştur. Yeni, işlevsel nöritler, nöronal ağları kontrol ederek (yeniden) tellemek üzere oluşturulur ve konumlandırılır. Elde edilen uzatma oranları, milimetre ölçeğine göre 20 μm / dakikadan daha hızlıdır ve fonksiyonel bağlantılar kurulmuştur. Bu sonuçlar beklenmedik bir şekilde, bu nevritlerin uzama için içsel kapasitesinin önceden düşünülenden çok daha hızlı olduğunu göstermektedir. Bu önerilen mekanik yaklaşım yavaş kimyasal stratejileri atlar ve belirli bir hedefe kontrollü bağlantı sağlar. th, Yaralanmadan sonra nöron bağlantısını geri getirmek için yeni terapilerin in vitro çalışması için yeni yollar açıyor. Aynı zamanda, in vitro olarak nöronal sinyal işleme ve nöronal fonksiyonun temel yönlerini araştırmak için nöronal ağların manipülasyonunu ve yeniden kablolanmasını sağlar.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan tüm prosedürler McGill Üniversitesi Hayvan Bakım Komitesi tarafından onaylanmış ve Kanada Hayvan Bakımı Konseyi kurallarına uymuştur.

1. Mikroakışkan Aygıtları Kullanarak Nöronal Kültürlerin Standardizasyonu: Aygıt Meclisi

  1. İstenen deney için uygun bir mikroakışkan aygıtı seçin. Aynı popülasyonda nöronları bağlamak için Nöron Cihazlarını ( Şekil 1 ) kullanın ve farklı popülasyonlarda nöronları bağlamak için Eş-Kültür Cihazlarını kullanın ( Şekil 6 ).
  2. Steril lamelleri veya cam altı yemekleri istediğiniz sayıda temizleyin ve hazırlayın. Plastik yüzeylerde en iyi sonucu elde etmek için, 35 mm tabaklar, cam kullanırken 25 mm lameller veya 35 mm cam alt tabaklar kullanın. Görüntüleme sistemine göre cam kalınlığını seçin, örneğin 0.15 mm.
  3. Bulaşıkları veya lamelleri 0,5-1 mL 100 ug / mL PDL ile 2 saat boyunca veya oda temperinde bir gece boyunca kaplayınature.
    Not: Protokol burada duraklatılabilir ve istenirse ertesi gün yeniden başlatılabilir. Furthemore, bulaşıklar borat tamponu ile seyreltilmiş PDL, Poly-L-Lizin (PLL), laminin veya herhangi bir başka hücre adezyon molekülü ile kaplanabilir.
  4. Bulaşıkları suyla iki kez yıkayın (tuz kristalleri kanalları tıkayabileceğinden fosfat tamponlu salin (PBS) kullanmayın), tüm sıvıyı alın ve 5-10 dakika biyogüvenlik kabini gibi steril bir ortamda kurutun. Yüzey tamamen kurudur.
    Not: kalan tüm sıvı mikroakışkan sistemlerin yapışmasına müdahale edecek şekilde lamelleri kesinlikle kuru olduğundan emin olmak için dikkatli olun.
  5. Modelleri mor ötesi ışıklı mikroakışkan cihazları UV ışığı altında steril bir ortamda (biyolojik güvenlik kabini) 10 dakika bekletin. Biyogüvenlik kabininde çalışırken steril prosedürlere uyduğunuzdan emin olun 10 .
  6. Cımbızın kullanılması, desenleri temiz örtülerle temas halinde aşağı bakacak şekilde mikro-akışkan bir cihaz yerleştirir.ip / çanak. Cihazı camın üzerine yapışacak şekilde yavaşça bastırmak için cımbız kullanın.
    Not: Yapışan bölgenin saydamlığı ışığa baktığınızda görülecektir. Tüm köşelerin camla temas ettiğinden emin olun. Bunu tüm mikroakışkan cihazlara uygulayın. Bkz. Şekil 1a .
  7. Tek popülasyon cihazını ortamla doldurmak için, pipete kanallara doğru bakınız ve serumsuz B-27 (hacim oranı 1:50) ve 500 μg / mL penisilin / streptomisin / glutamin (toplu olarak) takviye edilmiş 50 μL komple hücre ortamı ilave edin. NBM olarak adlandırılır) sağ üst kuyucuğa yerleştirin ve çapraz olarak kuyubaşıya başka bir 50 uL ekleyin. Ortamın kuyular arasında aktığından emin olarak bunu tüm cihazlar için yapın. Ardından kalan 2 kuyucuğa 50 μL orta madde ekleyin. Bkz. Şekil 2a .
    1. Birden fazla popülasyon cihazını ortam ile doldurmak için, pipet kanallarına doğru tutun ve 30 μLTam NBM'nin sağ kuyulara atanması için bkz. Şekil 6a . Ortamın kuyular arasında aktığından emin olarak bunu tüm cihazlar için yapın. Ardından kalan 4 oyuğa 50 μL orta madde ekleyin.
  8. Hücre kültürünü hazırlarken 1-2 saat boyunca otoklavlanmış su (ıslak oda) ve 37 ° C,% 5 CO 2 ve% 95 nem inkübatör yerleştirin açık bir çanak ile cihazları daha büyük bir plaka yerleştirin. Bkz. Şekil 2b .

2. Mikroakışkan Sistemlerde Nöron Kaplama

  1. Referansta açıklanan protokolün ardından. 8 , Sprague Dawley sıçan embriyolarından ayrılmış hippokampal veya kortikal nöronlar elde edin (ya cinsiyet).
  2. Embriyonik nöronları 1-2 milyon nöron / mL konsantrasyonda NBM'ye tekrar süspanse edin. Hemositometre ve referans 8 kullanarak mikroskopta hücre konsantrasyonlarını doğrulayın. Hücre konsantrasyonunu accordin ayarlayınG arzu edilen hücre yoğunluğuna getirir. Kanal başına tek bir hipokampal akson elde etme şansını artırmak için cihaz başına 10.000 nöron plaka yerleştirin. Aynı kanalda birden fazla akson olması için cihaz başına 60.000 nöron plak uygulayın.
    Not: Bu sayılar kullanılan nöronal türe göre değişir.
  3. Ortamı, kuyuları boşaltmadan mikroakışkan aygıtlardan çıkarın. Her biri yaklaşık 5 μL bırakın.
  4. Tek popülasyon cihazındaki hücreleri plaklamak için sağ alt kuyunun 50 uL NBM'sini ekleyin. Bu noktada orta, diğer alt kuyuyu doldurmak için kendiliğinden akar. Şekil 1b'de belirtildiği gibi, konsantre hücre çözeltisinin 20 uL'sini mikroakışkan aygıtın sağ üst kuyucuğuna ekleyin.
    1. Çok sayıda popülasyon cihazındaki plak hücrelerine, Şekil 6a'daki sağ çukurların her birine 20 μL konsantre hücre çözeltisi ekleyin.
  5. Mikroskopta hücreler varsa kontrol edinHücreler arasına yerleştirilir ve cihazları substrata hücre eklenmesini teşvik etmek için 15-30 dakika inkübatöre yerleştirir.
  6. Odacıkta yeterli hücre olup olmadığını mikroskopta kontrol edin. Daha fazla gerekiyorsa 2.4 ve 2.5 adımlarını tekrarlayın.
  7. Tek popülasyon cihazının 2 üst kuyusuna 50 uL NBM ekleyin ve hücrelerin birden çok popülasyon cihazına enjekte edildiği aynı kuyuya 20 uL NBM ekleyin. Ortamlar, pozitif bir menisküs oluşturmak üzere hafifçe çıkıntı yapar ve kuyuları bir kek üstü açı oluştururlar. Yine, Şekil 2a'ya bakınız.
  8. Hücreleri 37 ° C'de,% 5 C02'de ve% 95 nemde muhafaza edin.

3. Nöronal Kültürlerin Korunması

  1. Hücrelerden NBM'yi (bir pipetle kabaca 30 μL) çıkartın ve cihazlara giriş yaptıktan sonraki gün yeni önceden ısıtılmış NBM uygulayın (adım 2'den sonra 1 d'dir).
  2. Her kanalda yeterli ortam varsa 2 günde bir kontrol edin. Eğer çörek tOp düşük, sadece üst çukurlara daha fazla orta katın.
  3. Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından önce en az 7 gün boyunca kültür hücreleri. Hücreler bu cihazlarda birkaç hafta hayatta kalabilirler. Deneyler numuneler üzerinde gerçekleştirilmeden 1-2 gün önce cihazları çıkarın.

4. Mikroakışkan Cihazların Sökülmesi

  1. Mikroakışkan cihazların çıkarılmasından 1-2 gün önce, her bir numune çanağına önceden 37 ° C'ye ısıtılmış 2 mL NBM ekleyin, bölmeleri sular altında bırakın ve cihazları inkübatörde muhafaza edin.
  2. Nöronların desenli bir konfigürasyon bırakarak lamelleri mikroakışkan cihazları kaldırmak için steril cımbız ve bir ipucu kullanın. Lameri yerinde tutmak için ucu kullanın ve cihazın kenarını kuyunun sol alt köşesine tutturmak için cımbız kullanın. Torsiyonu dikkatli bir şekilde uygulayın, cımbızla cihazı yukarı kaldırın, böylece lamel soyulur. Şekil 2c - 2d'ye bakın.
  3. Her 2-3 günde, ha'yı değiştir.Numune kadar NBM deneyler için kullanılırsa.
  4. Örnek üzerinde tekrar kablolama deneyleri yapmadan önce, tek nüfuslu cihaz kanallarındaki nöritlerin ve birden fazla popülasyon cihazındaki nöronal popülasyonların, nöronal popülasyonları birbirine bağlayan filamentlerin olmamasını sağlamak için mikroskopta aralarındaki boşlukları inceleyerek izole edildiğini doğrulayın.

5. PDL kaplı Boncukların hazırlanması

  1. 1 mL PDL (100 μg / mL) suya (1: 500) seyreltilmiş 4, 10 veya 20 μm polistiren boncuklarından 2 x 50 μL damla ekleyin. Oda sıcaklığında en az 2 saat bekletin.
    Not: Protokol burada duraklatılabilir ve ertesi gün yeniden başlatılabilir.
  2. Çözümü 8,820 xg'de 1 dakika boyunca santrifüjleyin. Kabın altındaki birikmiş boncukları rahatsız etmeden süpernatanı dikkatlice çıkarın.
  3. Boncukları 1 mL steril 10 mM HEPES pH 8.4 solüsyonu ile iki kez yıkayın.
  4. PDL kaplı boncukları 200 mL, 10 mM HEPES pH 8.4 içinde tekrar süspansiyon haline getirinçözüm.

6. Mikroipipetlerin Hazırlanması

  1. Yatay bir elektrot çekici kullanarak cam kılcal tüplerden (1 mm iç çap, 1.5 mm dış çap) pipetler hazırlayın. Çekilen mikropipetin dış ucu ~ 2-5 μm olacak şekilde ayarları yapın. Çekmeden önce, cam tüplerin temiz olduğundan emin olun.
  2. Pipetleri saklamaya yönelik cam slaytlara sabitleyin ve ucu kırılgan olduğu için ucun slayt yüzeyine değmemesine dikkat edin. Tozdan korunmak için kapalı bir kapta oda sıcaklığında saklayın. Çekildikleri gün pipet kullanın.

7. Nöronlara PDL-boncuk Yapışması

  1. 4. adımda hazırlanan bir hücre kültürüne 5. adımda hazırlanan 40-60 μL PDL kaplı boncuk ekleyin. Lamel üzerinde hafifçe görünen nöronların üzerine pipet ucu koyun ( Şekil 3'e bakın).
  2. Sf oluşumunu teşvik etmek için numuneyi inkübatöre 1 saat geri getirinNaptik kontaklar 8 , 9 .
  3. Kuluçkadan sonra, önceden ısıtılmış NBM ile kültürü hafifçe yıkayarak yapışmamış boncukları çıkarın.

8. Fizyolojik Salin Çözeltisinin Hazırlanması (Oda Sıcaklığı Deneyleri için)

  1. Kaynaklar 7 , 8'de listelenen bileşenleri birleştirerek fizyolojik tuzlu su çözeltisi hazırlayın. Bu, inkübatör dışındaki hücre ortamını düzenlemek için.
  2. Referans 7 , 8'de gösterildiği gibi osmolarite ve pH düzeylerini doğrulayın.
  3. Deneyler yaparken pH dalgalanmalarını en aza indirgemek için çözeltiyi sürekli olarak O 2 ile infüze edin.
  4. Oda sıcaklığına ısıtın.
  5. Perfüzyon sistemini, bir plastik tüpün bir ucunu (isteğe bağlı boyutlar) O2 ile infüze edilen fizyolojik çözeltiye sokarak ve diğer eVe numune tutacağına bir iğne takın. Boruyu ve çözeltiyi numunenin üstünde yerleştirin (Bkz. Şekil 4 ).
    1. Boruyu iğneden ayırın ve bir şırıngaya bağlayın. Basınç uygulamak ve sıvıyı çekmek için tüpü doldurmak için şırıngayı kullanın. Silindir kelepçesiyle yapıştırın ve iğneyi tekrar bağlayın.

9. Boncuk Mikrom Manipülasyonu

  1. Numuneyi, deney hücrelerine hücrelere mikromanipülatörler üzerine monte edilmiş iki mikropipet ile erişilebilecek ve örneğin 40X fazlı bir objektifle (sayısal diyafram açıklığı 0.6 olan ters çevrilmiş optik mikroskop) optik olarak erişilebilecek şekilde monte edin. Bu konfigürasyonda, mikroskopun yan portuna görüntü yakalama için bir CCD kamera monte edin. Her pipeti 1 mL'lik enjektörlere plastik boru vasıtasıyla bağlayın. Bu aşamada, NBM'yi fizyolojik salin solüsyonu (1-2 mL) ile değiştirin (Bkz. Şekil 4 ).
  2. Tecrübe esnasındaAdım 8'de hazırlanan fizyolojik salin solüsyonu ile 0.5-1 mL / dakika oranında perfüze edin.
  3. Görünüm alanında bir nörona takılı DEĞİL bir PDL boncuk seçin. Boncuk üzerine mikro pipet üzerine odaklanarak boncuğu bir mikropipet ucuyla hizalayın. Ucu mikroskopta izleyerek boncuka olabildiğince yakın getirin.
  4. Boncuğu almak için pipete bağlı 1 mL şırınga ile negatif basınç uygulayınız. Deney boyunca negatif basınç uygulayın.

10. Neuritleri çekme

  1. Görünüm alanında bir nörona tutturulmuş bir PDL boncuk seçin ve adım 9.3-9.4'te açıklandığı gibi emmeyi kullanarak ikinci mikropipere takın.
  2. Nevrit başlatılmasına izin vermek için mikromanipülatörü veya numune aşamasını 1 μm ile yavaşça hareket ettirerek (~ 0.5 μm / dakika) PDL-boncuk-nöron kompleksini çekin ve 5 dakika bekleyin.
  3. Adım 10.2'yi iki kere tekrarlayın.
    Not: İlk 3 &# 181; zamanın% 95'inde gerçekleşen deneysel başarıyı garanti altına almak için çok yavaş çekilmeliyiz.
  4. Nevrit uzatılmasını sağlamak için mikromanipülatörü veya örnek tabakasını 2 μm ile yavaşça hareket ettirerek (~ 0.5 μm / dakika) PDL-boncuk-nöron kompleksini çekin ve 5 dakika bekleyin.
  5. İlk 5 μm için başarılı başlatma ve nörit uzatımı sonrasında, nöriti milimetre ölçekli mesafelerde 20 μm / dakika çekin.
    Not: Çekme işlemi sürekli veya aşamalı olarak ve farklı oranlarda yapılabilir. Bakınız Şekil 5b- 5c .

11. Bağlanma Nöronları

  1. Nörit bakımından zengin bir bölge seçin ve PDL-boncuk-nörit kompleksini fiziksel olarak onunla temas edecek şekilde indirin. Lamel sathının üstündeki ucu yüksekliğini ölçmek için diğer boncukları kullanın. Bakınız Şekil 5d .
  2. PDL-boncuk-nevrit kompleksini hedef nevritle temas halinde bırakın ve ikinci mikropi'yi manipüle edinPette. İkinci pipeti, ilk boncuktan yaklaşık 20 μm biçiminde yeni oluşan nevritin üzerine ikinci PDL boncukla indirin. Yeni nevrit filamanı hedef hücreye doğru itmek için ikinci PDL boncuk kullanın.
  3. Her iki boncuk da en az 1 saat tutulmalıdır. Odak şişmesi yokluğunu, boncukla temas eden nöritlerin kalınlaşmasını mikroskop 16 ile doğrulayın.
  4. Bu süre zarfında, örnek ortamını fizyolojik tuzlu sudan önceden ısıtılmış, CO2 ile dengelenmiş NBM'ye yavaşça değiştirmek için perfüzyon kullanın.
  5. Emmeyi bırakarak boncuğu ikinci pipetten ayırın. Yeni nörit bağlı kalırsa, ilk boncuk da serbest bırakın. Bakınız Şekil 5e .
  6. Hafifçe salin solüsyonu çıkarın ve NBM (~ 2 mL) ile değiştirin.
  7. Gelecekteki deneyler için nöron bağlantısını güçlendirmek için numuneyi kuluçka makinesine dikkatlice yerleştirin. Bu bağlantı> 24 saat 7 için sabittir 7 .

12. Tüm Hücreli Eşleştirilmiş Yama Kelepçesi Kayıtları İle Yeni Bağlantı İşlevselliklerinin Doğrulanması

  1. Referans 7 , 18 , 19'a uyun. Bir elektrofizyoloji kurulumu yapmak için.
  2. Referansları izleyin 7 . Pre-ve postsinaptik elektrotları hazırlamak.
  3. Yama klempi verilerini toplayın, yine 18 , 19 referanslarını izleyin.
  4. Bağlantı türünü belirlemek için sonuçları doğal olarak oluşan sinyallerle 7 karşılaştırın.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyonik sıçan hipokampal nöronları, hücrelerin, PDL boncuklarının ve mikromanipülatörlerin hassas konumlandırılmasını sağlamak için mikroakışkan aygıtlarda kültürlenir. İlk adım, bir cam lamel veya tabağa mikroakışkan cihazı düzgün bir şekilde monte etmektir. Mikroakışkan cihazın, hücrelerin odacıklardan çıkmasını ve mühürlenmesi gereken cihazın parçaları altında hareket etmesini önlemek için ( Şekil la ) alt tabakaya yapıştırılması esastır. Sağlıklı kült...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Standart mikromanipülasyon ve yenilikçi mikroakışkan cihazları kullanarak, yeni işlevsel nöronal devreleri büyük mesafelerde hızlı bir şekilde başlatmak, uzatmak ve hassas bir şekilde bağlamak için yeni bir teknik geliştirildi. Pipet mikromanipülasyon, çoğu nörobilim laboratuvarında yaygın bir araçtır 4 , 13 . Yeniden üretilebilir ve güvenilir sonuçlar elde etmek için asıl meydan, mikrometre hassasiyetli hücre kültürleri düzenlemek için mikroakışkan aygıtların g...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazar Margaret H Magdesian, bu Maddede kullanılan araçları üreten Ananda Devices'ın CEO'udur.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yoichi Miyahara'ya çok sayıda faydalı tartışma ve fikirler için teşekkür etmek istiyoruz. MA ve PG, NSERC'den finansman sağladığını onayladı.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Ko-kültür cihazlarıAnanda CihazlarıTicari olarak http://www.anandadevices.com
Neuro cihazlarındaAnanda CihazlarıTicari olarak http://www.anandadevices.com
No. 1'de mevcuttur Cam Lamel 25 mm YuvarlakWarner Instruments64-0705
35 mm Cam Alt Tabaklar #0, Kaplamasız, Gama IşınlanmışMatTex BirleştirmeP35G-0-20-C
35 mm hücre kültürü kabı, Pirojenik Olmayan, SterilCorning Inc430165
95 mm x 15 mm Petri Kabı, Kayabilir Kapak, Steril PolistirenFisherbrandFB0875714G
50 mL Baskılı dereceli ve düz kapaklı santrifüj tüpleriVWR89039-656
15 mL Polipropilen Konik Tüp, 17 x 120 mm stil, Pirojenik Olmayan, SterilŞahin
Nörobazal Orta YaşamTeknolojileri21103-049Hücre dışı çözelti
B-27 Takviyesi (50X), serumsuzB-27 Takviyesi (50X), serumsuz17504044Hücre dışı çözelti
Pennicilin, Streptomyosin, GlutaminThermo Fisher Scientific 11995-065Hücre dışı çözelti
200 μ L PipetleyicilerVWR89079-458
2 - 20 μ L PipetleyicilerAerosole Dayanıklı Uçlar2149P
BD Falcon 3mL Transfer Pipetleri [Steril olmayan]BD Falcon357524
GlikozGibco15023-021Hücre dışı çözelti
HEPESSigma7365-45-9Hücre dışı çözelti/Boncuk
NaClSigma-Aldrich7647-14-5Hücre dışı çözelti
KClSigma-Aldrich7447-40-7Hücre dışı çözelti
CaCl2< / sub>Sigma-Aldrich10043-52-4Hücre dışı çözelti
MgCl2< / sub>Sigma-Aldrich7786-30-3Hücre dışı çözüm
# 5 Dumont Dumostar Cımbız 11 cmDünya Hassas Aletler500233
Diseksiyon aletleriBraun, Aesculap
Poli-D-lizin HidrobromürSigma-AldrichP6407
Polistiren, 10 & mu bazlı mikro partiküller; mSigma-Aldrich72986
Borosilikat tüplerKing Precision Glass, Inc.14696-2
Yatay Pipet ÇektirmeSutter AletleriKahverengi Alevli P-97
Mikromanipülatörler, PCS-5000 SerisiSD AletlerMC7600R
1 mL ŞırıngaBD Luer-Lok309628
Ters MikroskopOlympus IX71
ObjektifOlympusUIS2, LUCPLFLN 40X
CCD KameraFotometriKaskad II: 512
Leibovitz'in (1x) L-15 Orta YaşamTeknolojileri11415-064Sıçan Diseksiyonu
Typsin-EDTA (%0.05), Fenol kırmızısıYaşam Teknolojileri25300054Sıçan Diseksiyonu
DMEM (1x) Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı [+4.5 g/L D-Glikoz, + L-Glutamin, + 110 mg/L Sodyum Piruvat]Yaşam Teknolojileri11995-065Sıçan Diseksiyonu
HBSS (1x) Hank'in Dengeli Tuz Çözeltisi [- Kalsiyum Klorür, - Magnezyum Klorür, - Magnezyum Sülfat]Yaşam Teknolojileri14170-112Sıçan Diseksiyonu
temin edilebilir 352097

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
  2. Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).
  3. Aguayo, A. J., et al. Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals. J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).
  4. Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons. J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).
  5. Goslin, K., Banker, G. Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture. J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).
  6. Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture. J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).
  7. Magdesian, M. H., et al. Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits. J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).
  8. Lucido, A. L., et al. Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts. J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).
  9. Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts. Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).
  10. General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood (2016).
  11. Strober, W. Monitoring cell growth. Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).
  12. Beaudoin, G. M. 3rd, et al. Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex. Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).
  13. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  14. Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition. J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).
  15. Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals. FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).
  16. Magdesian, M. H., et al. Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury. Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).
  17. Polleux, F., Snider, W. Initiating and growing an axon. CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).
  18. Debanne, D., et al. Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices. Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).
  19. Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings. J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).
  20. Harrison, R. G. On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology. Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).
  21. Weiss, P. Nerve patterns: the mechanics of nerve growth. Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).
  22. Gray, C., et al. Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler. Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).
  23. Heidemann, S. R., Bray, D. Tension-driven axon assembly: a possible mechanism. Front. Cell Neurosci. 9, (2015).
  24. Bray, D. Axonal growth in response to experimentally applied tension. Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).
  25. Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. Mechanical tension as a regulator of axonal development. Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).
  26. Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. Cytomechanics of axonal development. Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).
  27. Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. Extreme stretch growth of integrated axons. J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).
  28. Waxman, S. G., Kocsis, J. D. The axon: structure, function and pathophysiology. , Oxford University Press, USA. (1995).
  29. Cho, E. Y., So, K. F. Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters. Brain Res. 419, 369-374 (1987).
  30. Davies, A. M. Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance. Nature. 337, 553-555 (1989).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mikroak kan CihazlarPDL Kapl BoncuklarPipet Mikromanip lasyonuS an Hipokampal N ronlarN ronal B y me H zFonksiyonel N ronal DevrelerT m H cre Yama KenetlemeDeneysel Tekrarlanabilirlik

İlgili makaleler