Yöntem makalesi

Periferal Kan Türevi İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Kondrositlerin Farklılaşması

DOI:

10.3791/55722

⸱

18 Temmuz 2017

 ,  ,  , 
1Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University, 2Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences, 3Clinical and Translational Research Center of Shanghai First Maternity & Infant Hospital, School of Life Sciences and Technology, Tongji University

Bu makalede

Düzeltme bildirimi

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embriyodik vücut (EB) oluşumu, fibroblastik hücrelerin genişlemesi ve kondrojenik indüksiyonu içeren entegrasyonsuz bir yöntem kullanarak, indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla insan periferik kandan (PB) bir kondrojenik soy oluşturmak için bir protokol sunuyoruz.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışmada, entegrasyonsuz bir yöntemle indüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC'ler) yoluyla kondrosit üretmek için tohum hücreleri olarak periferik kan hücreleri (PBC'ler) kullandık. Embriyodik vücut (EB) oluşumu ve fibroblastik hücre genişlemesini takiben, iPSC'ler, serumsuz ve xeno içermeyen koşullar altında 21 gün süreyle kondrojenik farklılaşma için indüklenir. Kondrosit indüksiyonundan sonra, hücrelerin fenotipleri morfolojik, immünohistokimyasal ve biyokimyasal analizler ile kondrojenik farklılaşma belirteçlerinin kantitatif gerçek zamanlı PCR muayenesi ile değerlendirilir. Kondrojenik peletler pozitif alsi mavisi ve toluidin mavisi boyaması gösterir. Kolajen II ve X boyamasının immünohistokimyası da pozitiftir. Sülfatlanmış glikozaminoglikan (sGAG) içeriği ve kondrojenik farklılaşma belirteçleri COLLAGEN 2 ( COL2 ), COLLAGEN 10 ( COL10 ), SOX9 ve AGGRECAN , chondHiPSC'ler ve fibroblastik hücrelere kıyasla pıhtılaşmış peletler. Bu sonuçlar, PBC'lerin hastaya özgü ve maliyet-etkin olan kıkırdaklar onarımı için iPSC'ler üretmek üzere tohum hücreleri olarak kullanılabileceğini düşündürmektedir.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kıkırdak dokusu kendi kendine onarım ve rejenerasyon için çok zayıf bir kapasiteye sahiptir. Çeşitli cerrahi müdahaleler ve biyolojik tedaviler, kıkırdağı ve eklem işlevini yerine getirmekte, tatmin edici sonuçlarla birlikte kullanılmamaktadır. Kök hücre teknolojisinin son zamanlardaki gelişimi tüm kıkırdak onarım alanını değiştirebilir 1 . Çeşitli kök hücreleri, tohum hücre olarak incelenmiştir, ancak red reaksiyonları 2 neden olmaksızın hastanın spesifik hücrelerin çok çeşitli sağlayabilir insan uyarılmış pluripotent kök hücreler (hiPSCs), en çok umut verici bir seçim olarak görünmektedir. Dahası, yetişkin hücrelerin sınırlı proliferatif özelliklerini yenebilir ve kendi kendini yenileme ve pluripotent yeteneklerini sürdürebilirler. Dahası, gen hedefleme, belirli kondrosit tiplerini elde etmek için genotipi değiştirmek için kullanılabilir.

Yeniden programlama potansiyelleri de iyi çalışıldığından, fibroblastlar iPSC'ler üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır.Bununla birlikte, hastalardan gelen acılı biyopsi ve fibroblastların in vitro genişlemesine duyulan ihtiyaç gibi, gen mutasyonları ile sonuçlanabilecek bazı sınırlamalar hala mevcut 3 . Son zamanlarda, PBC'lerin yeniden programlama 4 için avantajlı olduğu bulunmuştur; Dahası, bunlar sıklıkla kullanılmakta ve bol miktarda depolanmaktadır. Çalışma odağını cilden yeniden yönlendirebilirler. Bununla birlikte, en iyi bilgimize göre, kondrositlere ayrışmayı takiben PBC yeniden programlama hakkında birkaç rapor bulunmaktadır.

Mevcut çalışmada, iPSC'lere yeniden programlayarak ve daha sonra kondrosit oluşumunu taklit etmek için iPSC'leri bir pelet kültür sistemi aracılığıyla kondrojenik soyla ayırarak alternatif bir kaynak olarak PBC'leri kullanıyoruz.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

PBC'lerden hiPSC üretimi için protokol önceki çalışmamızda bulunabilir 5 . Çalışma, kurumumuzun Kurumsal Değerlendirme Kurulu tarafından onaylandı.

1. Embriyoid Gövde (EB) Oluşumu

  1. 50 ml hiPSC ortamı yapın:% 15 nakavt serum replasmanı (KSR),% 5 sığır fetüsü serumu (FBS), 1 x gerekli olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol, 2 mM L (2 mM L) içeren takviyeli Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) -glutamin ve 8 ng / mL'lik bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF).
  2. 50 mL EB oluşum ortamı yapın:% 15 KSR,% 5 FBS, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM.
  3. 50 mL bazal kültür ortamı yapın:% 20 FBS, 1 x gerekli olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM.
  4. Nakavt DMEM'de 10 mL dispase solüsyonu, 1 mg / mL hazırlayın.
  5. CultuBesleyici hücrelerle ( yani, ışınlanmış fare embriyonik fibroblast hücrelerinin tek katmanı) 60 mm'lik doku kültürü yemekleri üzerine hiPSC'ler yerleştirin. Hücreler% 80-90 oranında birleştiğinde, hücreleri disperse ile ayırın ve 4-5 günde bir hiPSCs 1: 3'ü geçin. 37 ° C ve% 5 CO 2 inkübatör içine hücreleri yerleştirin.
  6. İPSC'ler% 80-90 oranında birleştiğinde ateşlenmemiş bir cam iğne kullanarak, farklılaşmamış hiPSC kolonilerini daha küçük parçalara (çap olarak yaklaşık 50-100 μm) ayırın. Genellikle, 100 mm'lik bir Petri kabında EB'ler oluşturmak için 60 mm'lik bir çanakta hiPSC kolonileri kullanın.
    1. 10 mL EB oluşum ortamı içeren 100 mm'lik, yapışkan olmayan bir Petri kabındaki 100'den küçük küçük koloni parçaları kültürü. 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör içine yemekler yerleştirin.
  7. Başlangıç ​​ortamının yaklaşık% 25'ini, her 2 günde bir eşit miktarda bazal kültür ortamı ile değiştirin. EB'lerin yerleşmesine izin vermek için çanağı eğin. 3 mL dikkatle çıkarınÜst ortamdan alınır ve 4 mL taze bazal kültür ortamı ilave edilir. EB'leri rahatsız etmeyin.
    NOT: EB'ler morfolojik olarak koloniler tarafından karakterize edilir, mikroskop altında pürüzsüz sınırlarla yuvarlak bir görünüm alır.
  8. Yapışık olmayan Petri kabındaki 10 günlük kültürden sonra, kullanımdan önce 37 ° C'de 30 dakika boyunca% 0.1 jelatinli 4 mL'lik yeni bir 100 mm'lik doku kültürü kabı kaplayın.
  9. Orta artı EB'ler, 100 mm'lik yapışkan olmayan bir Petri kabından 15 mL'lik konik bir boruya aktarın. EB'lerin 4-5 dakika tortulmasına izin verin. Süpernatantı dikkatli bir şekilde aspire edin ve 0.5 mL'den daha az orta artı EBs bırakın
  10. 10 mL bazal kültür ortamı ile 100 mm, jelatin kaplı doku kültürü çanağına 100 EB'den az tohum ekildi. 37 ° C ve% 5 CO2 inkübatör içine yemekler yerleştirin.

2. Hücre Pelet Oluşumu ve Kondrosit Farklılaşması

  1. 10 mL% 0.25 tripsin / etilendiaminetetraasetik asit (EDTA) yapın. 80 mL bas hazırlayınAl kültür ortamı:% 20 FBS, 1x esansiyel olmayan amino asitler, 55 uM 2-merkaptoetanol ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM.
  2. 10 mL kondrojenik farklılaşma ortamı yapın:% 10 insülin-transferrin-selenyum çözeltisi (ITS), 0.1 uM deksametazon, 1 mM askorbik asit,% 1 sodyum piruvat ve 10 ng / mL dönüştürücü büyüme faktörü-2 ile desteklenmiş DMEM (yüksek glikoz) Beta 1 (TGF-β1).
  3. Ortamı, 48 saat sonra 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin. Bundan sonra, ortamı her üç günde 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin.
    NOT: Kültürde 10 gün sonra, fibroblastik hücre büyümeleri EB'lerden genişlemiş olmalıdır.
    1. 100 mm yemekleri, kullanımdan önce 37 ° C'de 30 dakika boyunca% 4 jelatinli 4 mL ile kaplayın. Hücrenin süpernatantını atın ve hücreleri Dulbecco'nun Fosfat Tamponlu Tuzu (DPBS) ile bir kez yıkayın.
    2. Hücreleri 3 mL% 0.25 tripsin / EDTA ile 37 ° C'de 5 dakika boyunca sindirin ve 4 m ile nötrleştirinL bazal kültür ortamı.
  4. 5-10 kez pipetleme ve 70 μm'lik bir naylon örgü vasıtasıyla geçirerek hücreleri tek hücrelere ayırın. 5 dakika 200 xg'de hücre süspansiyonu santrifüjleyin. Hücreleri yeni bir 100 mm, jelatin kaplı doku kültürü çanağına, 10 mL bazal kültür ortamı ile tekrar tohumlayın.
  5. Ortamı, 48 saat sonra 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin. Bundan sonra, ortamı her üç günde 10 mL bazal kültür ortamıyla yenileyin.
    NOT: Hücreler homojen, fibroblast benzeri bir morfoloji kazanırlar.
  6. ~% 90-100 (yani, yaklaşık 5-7 gün), 5 dakika boyunca 37 ° C'de% 0.25 tripsin / EDTA, 3 mL olan hücreler hasat ulaşıldığında. 4 mL bazal kültür ortamı ile nötralize edin. Beş kez yukarı ve aşağı pipetleme ile hücreleri tek hücrelere ayırın. Hücre sayısını saymak için bir hemositometre kullanın.
    1. 15 mL polipropilen tüp içine 3 x 10 5 hücre yerleştirin. 200 xg'de santrifüjleyinOda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca. Hücreleri 1 mL kondrojenik farklılaşma ortamında yeniden süspanse edin.
  7. Hücreleri 300 xg'de 3 dakika boyunca tekrar santrifüjleyin ve hücreleri küçük pelet formunda muhafaza edin. Boruyu 37 gün ° C'de ve% 5 CO 2 inkübatöre 21 gün boyunca yerleştirin. Kapağı sıkıca vidalamayın ve gaz değişimine izin verin.
  8. Kültür ortamının 3 / 4'ünü her üç günde bir taze kondrojenik farklılaşma ortamı ile değiştirin.
    NOT: Kültürde 21 gün sonra, hiPSC-kondrojenik pelletler (hiPSC-Chon) oluşmuş olmalıdır. Pozitif bir kontrol olarak insan mezenşimal kök hücreleri (MSC'ler) de toplanır ve kondrojenik pelet (hMSC-Chon) oluşturmak için 21 gün süreyle kondrojenik farklılaşma ortamında kültürlenir.

3. Kondrojenik Farklılaşmanın Analizi

  1. 10 mL% 10 nötr tamponlu formalin hazırlayın.
  2. 50 mL% 0.1 alcian mavi reaktif ve 50 mL% 1 toluidin mavi reaktif hazırlayın.
  3. PrBirincil antikorların 1 mL'si: Kollajen II'ye (1:50) karşı tavşan poliklonal antikorları veya kollajene X (1:50) karşı fare monoklonal antikorları. Ayrıca, anti-tavşan veya fare ikincil antikorları hazırlayın.
  4. 1 mL papain solüsyonu yapın: 0.1 M sodyum asetat, 2.4 mM EDTA ve 5 mM L-sistein ile PBS içerisinde 10 U / mL.
  5. 100 mL dimetilmetilen mavisi (DMMB) boya çözeltisi yapın: 100 mg 16 mg / L 1,9-dimetilmetilen mavisi, 40 mM glisin, 40 mM NaCI ve 9.5 mM HC1; PH 3.0.
  6. Pelet bölümlerinin alsian blue ve toluidine blue lekeleri ile kondrojenik farklılaşmayı değerlendirin.
    1. Bir hiPSC-Chon pelet veya hMSC-Chon pelletini 1 mL% 10 nötr tamponlu formalinde 24 saat fikse edin.
    2. H 2 O'de% 70 etanol 1 mL'ye pelet aktarın. Pelleti 1 mL dereceli bir etanol serisi ile ( yani, 25, 50, 75, 90, 95, 100 ve% 100, her biri 3 dakika) kurutun.
    3. Pelleti 1 mL% 100 ksilen içinde üç kez açıklayın. infiltreE pelet 65 ° C'lik bir fırında 1 saat boyunca parafinle yıkayın. Rutin histolojik prosedürler izlenerek pelet 7 x 7 x 5 mm 3 taban kalıp ile parafin bloklarına yerleştirilir 6 .
    4. Yaklaşık 4 μm'lik bir kalınlığa sahip 7 bitişik kesitleri mikrotom ile yapın. Kesitleri cam slaytlara yapıştırın.
    5. Slaytları fırında 60 ° C'de 2 saat boyunca kurutun. Kesitleri üç döngüde (her biri 3 dakika)% 100 ksilen kullanarak deparafinize edin.
    6. Rehidrasyon için azalan bir alkol serisi kullanın ( örn., H 2 O içinde 100, 100, 95, 95, 70, 50 ve 25%, her biri 3 dak.) Ve daha sonra deiyonize suyla 5 dakika boyunca son durulamayı gerçekleştirin.
    7. Bölümleri% 0.1 alcian mavi reaktif veya% 1 toluidin mavi boyama ile 4-5 saat boyayın ve daha sonra damıtılmış suyla yıkayın.
    8. Kademeli bir etanol serisi ( yani 25, 50, 75, 90, 95, 100 ve 100%, her biri 3 dak.) Ile kurutun ardından üç ardışık stEps% 100 ksilen içinde berraklaştırma. Slaytları monte edin ve onları mikroskop altında görselleştirin.
  7. İmmünohistokimya yapın.
    NOT: Ek pellet bölümleri, immünohistokimyasal olarak daha da değerlendirilir.
    1. Deparaffinizasyon ve rehidrasyon işleminden sonra, slaytlar 1 mM EDTA, pH 8.0'da kaynatılır (otoklav ile kaynatılan suda su geçirmezdir). Kaynama sıcaklığında 8 dakika bekletin ve slaytların oda sıcaklığında soğumasına izin verin.
    2. Slaytları 3 kez deiyonize su ile durulayın. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için bölümleri oda sıcaklığında RT'de 15 dakika boyunca% 3 H 2 O 2 solüsyonunda inkübe edin.
    3. Slaytları deiyonize suyla durulayın ve 5 dakika süreyle DPBS'ye daldırın. Slaytlardaki kısımlara uygun şekilde seyreltilmiş (1:50) birincil antikor 50-100 μL uygulayın ve daha sonra oda sıcaklığında 1 saat boyunca nemlendirilmiş bir bölmede inkübe edin.
    4. Slaytları DPBS ile 3 kez (her biri 5 dakika) yıkayın. Sa'yı inkübe edinRT'de 15 dakika süreyle karşılık gelen ikincil antikorlarla ( yani, anti-tavşan veya fare) bağlantı kurun.
    5. Slaytları DPBS ile 3 kez (her biri 5 dakika süreyle) yıkayın. DAB algılamasını bir mikroskop altında yapın.
    6. Slaytları 3 kez (her biri 2 dakika) DPBS ile yıkayın. Slaytları 1-2 dakika boyunca hematoksilen içine batırarak hücre çekirdeğini karşı koyun. Kademeli bir etanol serisi (her biri 25, 50, 75, 90, 95, 100 ve% 100; her biri 3 dak.) Ile kurutun ve ardından ksilen ile üç ardışık saflaştırma aşaması uygulayın. Son olarak, slaytları monte edin ve onları mikroskop altında görün.
  8. SGAG içeriğini algıla.
    1. Papillon solüsyonunda 60 ° C'de 2 saat süreyle kondrojenik pelletleri özümleyin.
    2. DNA içeriğini dsDNA test kiti ve florometre sistemi kullanarak belirleyin. 525 nm'de 8 emme ölçümü altında DMG boya çözeltisi ile karıştırılarak sGAG içeriğini ölçün.
    3. SGAG konsantrasyonunu standart bir eğriye karşı hesaplayınKöpek balığı kondroitin sülfat.
  9. HiPSC-Chon pelletlerinde kondrojenik farklılaşma belirteçlerinin gerçek zamanlı PCR analizini yapın.
    1. Aynı kondrojenik pelletlerin 3-4'ünü, bir tüpe 500 μL buz soğukluğunda ekstraksiyon reaktifi ilave ederek hasat edin. Harca iyice girdap. Numuneyi oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin.
    2. 0.1 mL kloroform ilave edin. Numuneyi 15 saniye vorteksleyin ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Numuneyi 12,000 xg ve 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Üst sulu fazı (yaklaşık 250 uL) yeni bir 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
    3. Numuneye 25 μL sodyum asetat ve 1 μL glikojen ekleyin. RNA 250 μL izopropil alkol ile karıştırılarak çökeltilir. Iyice karıştırın. Numuneyi oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
    4. 12,000 xg'de ve 4 ° C'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkarın. RNA topak iki kez% 75 etanol 500 mcL ile yıkayın.
    5. 5 dakika boyunca santrifüjleyin7,500 xg ve 4 ° C'de. Artık etanolü çıkarın ve RNA pelletini 5-10 dakika havayla kurutun. RNA 10 uL nükleaz içermeyen suda eritilir.
    6. Bir ters transkriptaz sistemi kullanarak RNA'yı cDNA'ya dönüştürün. CDNA örneklerini qPCR kit master karışımı (2x) ve gerçek zamanlı PCR sistemi 9 kullanarak gerçek zamanlı PCR'ye tabi tutun.
      NOT: Primer sekanslar:
      H AGGRECAN- F: TCGAGGACAGCGAGGCC;
      H AGGRECAN -R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA;
      H β-ACTIN- F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC;
      H β-ACTIN -R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC;
      H COL2 -F: TGGACGATCAGGCGAAACC;
      H COL2 -R: GCTGCGGATGCTCTCAATCT;
      H SOX9- F: AGCGAACGCACATCAAGAC;
      H SOX9 -R: CTGTAGGCGATCTGTTGGGG;
      H COL10- F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT;
      H COL10 -R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HiPSC'lerin Kondrojenik Farklılaşması:

EB oluşum ortamı ve bazal kültür ortamı hiPSC'leri mezenkimal soy içine ayırmak için kullanıldı. Çok aşamalı bir kültür yöntemi kullanıldı ( Şekil 1 ). Birincisi, hiPSC'ler 10 gün boyunca EB oluşumu yoluyla spontan olarak ayırt edildi (D10; Şekil 2A ). İkincisi, hücreler EB'lerden 10 gün daha geriler (D10 + 10). Bu iki aşamada, iPSC...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Burada, iPSC'ler yoluyla PBC'lerden kondrosit üretmek için bir protokol sağlıyoruz. PBC'ler klinik alanda daha yaygın ve yaygın olarak kullanıldığından yeniden programlama için potansiyel bir alternatif olarak sunulmaktadır. Bu çalışmada, epidermal vektörler (EV), Zhang ve ark. Tarafından belirlenen yöntemi takiben, PBC'leri iPSC'lere yeniden programlamak için kullanıldı . 11 . Bu entegrasyon içermeyen bir yaklaşım klinik alanda 12,

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarlar Xiaobin Zhang'a plasmidinden dolayı teşekkür etmek istiyorlar. Deney sırasında tür yardımları için Shaorong Gao'ya ve Qianfei Wang'a da teşekkür ediyoruz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81101346, 81271963, 81100331), Pekin 215 yüksek düzey yetenek projesi (No.2014-3-025) ve Pekin Chao-Yang Hastane Fonu (Yoktur) tarafından desteklenmektedir. , CYXX-2017-01) ve Çin Bilimler Akademisi (YL) Gençlik İnovasyon Tanıtım Derneği bulunmaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Nakavt DMEMİnvitrojen10829018hiPSC kültürü ve EB oluşum ortamı için kullanılan bazal ortam
Nakavt Serum Replasmanı (KSR)İnvitrojen10828028HiPSC kültürü ve EB oluşum ortamı için kullanılan daha tanımlı, FBS içermeyen bir ortam takviyesi
Fetal sığır serumu (FBS)Hiklonsh30070.03HiPSC kültürü ve EB oluşum ortamı için kullanılır, hücre için mükemmel değer sunar kültür
Esansiyel olmayan amino asitlerChemiconTMS-001-CHücre büyümesini ve canlılığını artırmak için tüm hücre kültürü ortamlarında büyüme takviyesi olarak kullanılır
L-glutaminInvitrogenTMS-002-CHücre kültürü için gerekli bir amino asit
Temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)Peprotech100-18BHiPSC'lerin pluripotentliğini sürdürmek ve kendini yenilemek için kullanılan bir sitokin
DispaseInvitrogen17105041Alt kültür için hiPSC ayrışması için kullanılır
DMEMGibcoC11960MSC kültür ortamı için kullanılan bazal ortam
%0.1 jelatinMilliporeES-006-BBulaşıklara hücre tutturmak için kullanılır
%0.25 tripsin/EDTAGibco25200072Hücre ayrışması için kullanılır
DPBSGibco14190250Hücre yıkama veya reaktif hazırlama için kullanılan dengeli bir tuz çözeltisi
2-merkaptoetanolinvitrojen21985023Tüm hücre kültürü ortamlarında bir büyüme takviyesi olarak kullanılır.
ITSinvitrojen41400045İnsülin, Transferrin, Selenyum Çözeltisi.Kondrojenik farklılaşma için kullanılır.
Askorbik asitSigma4403C vitamini olarak bilinir. Aktif büyümeye yardımcı olur ve antioksidan özelliğe sahiptir.
Sodyum piruvatGibco11360070Glikoza ek olarak bir enerji kaynağı olarak hücre kültürü ortamına eklenir.
Transforme edici büyüme faktörü-beta 1PeprotechAF-100-21CHücre proliferasyonunu, büyümesini ve kondrojenik farklılaşmasını düzenleyen bir sitokindir.
Kollajen II Abcam'a karşı tavşan poliklonal antikorlarıab34712Bu antikor, kıkırdaklı dokular için spesifik olan Tip II kollajenlerle reaksiyona girer.
Kollajen X Abcam'a karşı fare monoklonal antikorlarıab49945Bu antikor, hipertrofik kondrotositlerin bir ürünü olan Tip X kollajen ile reaksiyona girer.
PermountFisher ScientificSP15-100Slaytların montajı ve uzun süreli saklanması için
Toluidin mavisiSigma89640Proteoglikanların tespiti için kullanılır.
Alcian mavisiAmresco# 0298Glukozaminoglikanların tespiti için kullanılır.
PapainSigmaP4762-25MGKondrojenik peletleri sindirmek için kullanılır.
Dimetilen mavisiSigma341088-1GGlikozaminoglyanları ölçmek için kullanılır
Kondroitin sülfat köpekbalığı kıkırdağından sodyum tuzuSigmaC4384-250MGsGAG içeriği ölçümü için standart eğriyi çizmek için kullanılır.
Qubit dsDNA HS test kitiInvitrogenQ32851 (100)DNA içeriğini belirlemek için kullanılır
TRIzolInvitrogen15596018Hücrelerden RNA izolasyonu için kullanılır
Ters Transkriptaz SistemiPromegaA3500RNA'yı cDNA'ya dönüştürmek için kullanılır
SYBR FAST qPCR kiti Master MixKapaKK4601Gerçek Zamanlı PCR için kullanılır

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Diekman, B. O., et al. Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).
  2. Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  3. Loh, Y. H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).
  4. Zhang, X. B. Cellular reprogramming of human peripheral blood cells. Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).
  5. Li, Y., et al. Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair. Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).
  6. Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).
  7. Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks. Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).
  8. Oldershaw, R. A., et al. Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes. Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).
  9. Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area. J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).
  10. Teramura, T., et al. Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells. Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).
  11. Su, R. J., et al. Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors. PLoS One. 8 (5), e64496(2013).
  12. Carey, B. W., et al. Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).
  13. Okita, K., et al. An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells. Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).
  14. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  15. Qu, C., et al. Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture. Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).
  16. Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells. J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).
  17. Koyama, N., et al. Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells. Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).
  18. Liu, X., et al. Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro. Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).
  19. Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential. Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).
  20. Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. Cartilage engineering from mesenchymal stem cells. Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).
  21. Ingber, D. E., et al. Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic. Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).
  22. Yoshida, Y., Yamanaka, S. Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration. Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Düzeltme

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Formal Correction: Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells
Posted by JoVE Editors on 1/01/1970. Citeable Link.

An erratum was issued for: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells.

The corresponding author was updated from:

Yueying Li
yueyinglee2010@hotmail.com
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences

The corresponding author is now listed as:

Tie Liu
waterkins@163.com
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

Etiketler

Kondrosit Farkl la masPeriferik Kan H creleriEmbriyoid Cisim Olu umuKondrojenik Farkl la maSerumsuz K lt rKseno Free K lt rKollajen II BoyamaGlikosaminoglikan AnaliziKondrojenik Mark rler

İlgili makaleler