Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi

Eksozomlar, hücreler arasında membran ve sitozolik proteinler, lipidler ve RNA'lar aktararak hücresel iletişimi arabuluculuk edebilir ¹ . Eksozom aracılı iletişimin pek çok fizyolojik ve patolojik sürece dahil olduğu gösterilmiştir ( örn., Antijen sunumu, tolerans ² gelişimi ve tümör ilerlemesi ³ ). Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan kaynak hücrelerinkine benzer içerikler içerir. Böylece, eksozomlar, kaynak hücrelerden spesifik hücre özelliklerini taşıyabilir ve bu özellikleri, hücreleri sindiren hücrelere aktarabilir ⁴ .

Ekzozomlar, 50 ila 150 nm çift katmanlı veziküllü ve mevcut spesifik belirteçlerdir ( örn., CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix ve TSG101). Bu nedenle, eksosomlar farklı yönler için çeşitli yöntemlerle karakterize edilmelidir. İletim elektron mikroskobu, zar vezikülleri görselleştirmek için kullanılabilirEksosomlar ^{4 , 5 gibi} . Saflaştırılmış eksosomların boyut ve sayısını ölçmek için nanopartikül izleme analizi (NTA) ve dinamik ışık saçılım analizi (DLS) kullanılmaktadır. Ekzozomların lipid zar içeriği yoğunluk gradyanı ile doğrulanabilir. CD9, CD81, CD63, HSP70, Alix ve TSG101 ^{6 , 7} gibi ekzozom belirteçleri Western blot ile ölçülebilir.

Laminal hücreler ^{8 , 9 , 10} olamazken, meme bazal hücreleri yağ bezlerine implante ederken meme bezleri üretme özelliğine sahiptir. Böylece, meme bazal hücreleri aynı zamanda meme yeniden nüfuz üniteleri olarak da adlandırılır. Meme bazal ve luminal hücrelerin modelini kullanarak EV / eksosomların farklı hücre popülasyonları arasında hücre özelliklerini aktarma yeteneği incelenebilir. Bu işMeme bazal epitel hücrelerinden meme luminal epitel hücrelerine gland oluşturma yeteneğini, meme bazal epitelyal hücrelerden türetilen EVs / eksozomları kullanarak aktarma yöntemini göstermektedir. Luminal meme epitel hücreleri, bazal hücrelerden salınan EV / ekzosomların alımını takiben bazal hücre özelliklerini kazanmış ve daha sonra meme bezlerini oluşturabilir ⁴ .

Hayvanları ilgilendiren tüm araştırmalar, Hayvan Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere uymaktadır.

1. Ekstraselüler Vesikül / Ekzoz İzolasyonu ve Validasyonu

1. 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12'den sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile yapılmış taze, serum içermeyen ortam ile kültür meme epitelyal bazal hücreleri, NAMEC'ler ⁴ ; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Sığır hipofiz hulasası (BPE; 35 μg / mL); Ve GW627368X (1 μg / mL) ile 15 cm bulaşık yıkayın.
2. Hücreleri bir hemocytometer ile saydıktan sonra, 4 gün süreyle 0 günde 15 cm'lik tabaka başına 12 mL ortamda 1.2 x 106 hücre tohumlayın.
3. Kültürde 4 gün sonra, bir masa üstü santrifüj kullanarak 5 dakika 300 xg'de kültür ortamı santrifüjleyin. Süpernatantı konik bir boruya aktarın ( Şekil 1 ).
4. Süpernatantı santrifüjleyinBir masa üstü santrifüjünde 2,000 xg'de 20 dakika. Süpernatantı bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ve ölü hücreleri ve hücre pisliğini bırakın ( Şekil 1 ).
5. Süpernatantı 10,000 xg'de 30 dakika boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin. Süpernatantı yeni bir ultra-santrifüj tüpüne aktarın ( Şekil 1 ).
6. Süpernatantı 110,000 xg'de, 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve EV / exosome peletini PBS'de tekrar süspanse edin ( Şekil 1 ).
7. Süpernatantı 110,000 xg'de, 4 ° C'de 60 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın. EV / exosome peletini PBS'ye tekrar süspanse edin ( Şekil 1 ). 240 uM-80 mL NAMEC klimatlı ortamdan izole edilen pelleti 100 uL'de tekrar süspanse edin.
8. EV süspansiyonunun protein konsantrasyonunu BCA protein deneyi ile ölçün. Konsantrasyonun 20-40 μg / 100 μL civarında olduğundan emin olun. Için -20 ° C'de muhafaza edinIleri analiz.
9. Daha önce Gardiner ve ark. Tarafından anlatıldığı gibi nanopartikül izleme analizi (NTA) ile EV'lerin / eksosomların konsantrasyonunu ve boyutunu ölçün . ¹¹ . EVs / ekzozomları (20 μg / 100 μL) PBS ile NTA analizi için 10.000 katına kadar sulandırın.
   NOT: NTA analizinin sonucu analiz edilen veziküllerin sayısını ve boyutunu yansıtır.
10. Daha önce Lin ve ark . Tarafından açıklandığı üzere transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile EV / eksosomları görüntüleme ⁴ .

2. Bir Yoğunluk Degradesi Kullanılarak Exosome Arıtma

1. PBS (2 mL) içinde% 40'lık (w / v) iyodixanol içinde adım 1.7'den elde edilen 110.000 g peleti tekrar süspansiyon haline getirin. Bir ultra-santrifüj tüpünde bir yoğunluk gradyanı oluşturmak için karışımı sırayla PBS'de (her biri 2 mL)% 30,% 20,% 10 ve% 5 (w / v) iyodiksanol bölümleriyle örtün.
2. Karışımı 200 ° C'de 8 saat boyunca 4 ° C'de santrifüjleyin.
3. Her gradyan fraksiyonunu toplayın (10 çarpıons; 1 mL / fraksiyon) tüpün üstünden bir pipet ile kondu.
4. SDS-PAGE ¹² ve Western leke ile her bir fraksiyonda exozom belirteçlerinin ( örneğin, CD81, CD9, CD63 ve Tsg101) varlığını analiz edin. Her fraksiyonun 50 μL'lik süspansiyonlarını% 0.1 (w / v) SDS içeren% 10'luk bir jel üzerine yükleyin ve fraksiyonlarda proteinleri jel elektroforeziyle ayırın.
5. Proteinleri bir jelden bir PVDF zarına aktarın ve membranı, exozom belirteçlerine ( örn., CD81, CD9, CD63 ve Tsg101) karşı antikorlar ve gece boyunca oda ısısı proteini GAPDH'yi ( Tablolar Tablosu ) 4 ° C'de inkübe edin .
   NOT: Sonuç, eksosom içeren fraksiyonu tanımlar.

3. Ekstrasellüler Vesikül / Exposome Etiketleme

1. Adım 1.7'de elde edilen EVs / ekzosomları 10 μM karboksi floresein sukkinimidil diasetat ester (CFSE) 20 μg exozomal protein / 100 μL'de askıya alınız. Paralel bir örnek hazırlayınSadece CFSE'ye ve PBS'e sahip olmak, daha sonra EV / eksozom alım testleri için negatif bir kontrol olarak işlendi. Karışımları 37 ° C'de 30 dakika bekletin.
2. EVs / ekzosomları 50x hacim PBS'de askıya alın ve süspansiyonu 110,000 xg'de 4 ° C'de 60 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı alın ve EV / exosome peletini PBS'de tekrar süspanse edin. Adım 3.2'yi bir kez tekrarlayın.
3. EVs / ekzosomları PBS'de 20 μg exozomal protein / 100 μL konsantrasyonda askıya alın ve sonra EV / eksosomları hücrelere eklemeden önce EV / exosomes'ı 0.22 μm membranlar yoluyla filtreleyin.

4. Ekstrasellüler Vesikül / Exposome Alım Testi

1. Kültür ortamı yapmak için, 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12, sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile karıştırılır; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Ve BPE (35 μg / mL) ^4'tür . İnsan meme epitel HMLE hücrelerini 6 oyuklu tabaklarda (1 x 10 ^{6 <}/ Sup> hücreler / kuyu) EV / eksozom tedavisinden bir gün önce. 2-6 saat boyunca HMLE hücrelerinin kültür ortamına adım 3.3'te elde edilen 2 μg / mL CFSE floresan etiketli EVs / exosome ekleyin. Negatif kontrol grubunun HMLE hücrelerini 3. adımda anlatılan paralel hazırlık ile tedavi edin.
2. 2-6 saatlik inkübasyondan sonra hücreleri oda sıcaklığında 4 mL PBS ile iki kez yıkayın.
3. 10 dakika% 0.25 tripsin ile hücreleri ayırın ve% 0.2 FBS içeren PBS hücrelerini yeniden askıya alın. Bir flüoresan hücre analizörü ⁴ kullanarak hücrelerdeki floresans yoğunluğundan EV / exosome alımını ölçün. EVs / eksosomlarla tedavi edilen hücreleri veya konfokal mikroskobu kullanarak negatif kontrol edin.
   NOT: Hücrelerdeki yeşil flüoresans EV / eksosom tutulumundan kaynaklanır. Mikroskop ayarları için Şekil 6'daki efsaneye bakın.

5. Primer Fare Memeli Epitelyal Hücrelerinin İzolasyonu

1. Makas kullanarak 12 haftalık bakire diş C57BL / 6 farelerinden 2, 3, 4 ve 5 numaralı meme bezlerini ( Şekil 2 ) parçalayın ve bezleri küçük parçalar halinde (2 mm2) bir ustura ile kesip kesin.
2. Daha sonra 37 ° C'de 60 dakika boyunca meme bezlerinin bulamaçını (10 fareden) ayrıştırın,% 0.2 kolajenaz IV,% 0.2 tripsin,% 5 FBS, 5 μg / mL gentamisin içeren 50 mL DMEM / F12 ile 120 rpm karıştırma , Ve 1x kalem strep.
3. 10 dakika süreyle 350 xg'da santrifüje ederek karışımdaki epitelyal organoidleri peletleyin.
4. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 0.1 mg / mL DNase I ile 4 mL DMEM / F12'deki epitelyal organoidleri askıya alın. Final'e 6 mL DMEM / F12 ekleyin.Hacmi 10 mL.
5. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 400 xg'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
6. Peleti 10 mL DMEM / F12 içinde tekrar süspanse edin. Süspansiyonu santrifüjleyin, ancak hız 400 x g'ye ulaştığında frene basın. Süpernatanı atın.
   NOT: Fren isabet ederek, epitel organoitleri çabucak peletlenirken fibroblastlar tek hücreler olarak hala süpernatantta kalırlar.
7. 5.6 ve 5.7 adımlarını 5-7 kere tekrarlayın. Süspansiyonu bir hemositometreye bir damla ilave edin ve sonra her santrifüj işleminden sonra mikroskopik olarak organoid karışımdan fibroblastların temizlenmesini kontrol edin ( Şekil 3 ).
8. Adım 5.1'de elde edilen jelatin kaplı çanak içerisindeki organoidleri 1x ITS,% 5 FBS, 50 ug / mL gentamisin, 10 ng / mL EGF ve 1x kalem strep içeren DMEM / F12 ile 48 saat plaka haline getirin.
9. 48 saat sonra, kültür ortamındaki yüzen hücreleri ortamı, FBS içermeyen taze kültür ortamı ile değiştirerek çıkarın (1x ITS, 50 ug / mL gentamisin, 10 ng / mL EGF ve 1x kalem strepten oluşan DMEM / F12).
10. Memedeki epitel hücrelerinin tek tabaka- sının 3 gün içinde bağlı epitel organoidlerinden göç ettiğini ve büyüdüğünü doğrulayın.

6. Primer Fare Bazal / Luminal Memeli Epitelyal Hücrelerin Ayrılması

1. 3 günlük kültürden sonra fare birincil meme hücrelerini proteolitik ve kolajenolitik enzim aktivitesi olan doğal bir enzim karışımı ile 20 dakika ayırın. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
2. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Hücre pelletini 5 mg / mL dispazda 20 dakika boyunca tekrar süspanse edin. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
3. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
4. Seyreltilmiş 10 ⁷ hücre / mL'lik bir konsantrasyonda% 0.2 FBS ile 100 uL PBS'de hücrelerin yeniden askıya alındıAnti-CD49f ve anti-EpCAM antikorlarının buz üzerinde 1 saat karanlıkta tutulması.
5. PBS ile hücreleri yıkayın ve daha sonra karanlıkta 30 dakika boyunca buz üzerinde fluorofor-konjuge sekonder antikor ile hücreleri inkübe edin.
6. Yıkayın ve% 0.2 FBS ile PBS içinde hücreleri askıya alınız.
7. EpCAM ^hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerini bir hücre sıralayıcı ⁴ üzerinde sıralayın.

7. Ekstrasellüler Vesikül / Exozom Tedavisi

1. Sıralanmış EpCAM ^hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerini jelatin kaplı 6-iyi kaplar (2 x 10 ⁵ hücre / oyuk) üzerinde adım 6.7'den tohumlayın ve daha sonra bunlara PBS veya 2 ug / mL NAMEC türevi EVs / ekzozomlar ile muamele edin Adım 1.7'de elde edilmiştir.
2. Uzun süreli kültür tedavisinde EVs / eksosomların biyolojik etkinliğini sağlamak için, hücre kültürü ortamını her iki günde PBS veya 2 ug / mL NAMEC türevli EV / eksosom içeren taze ortam ile değiştirin. Fare primasını bölme.Ry luminal hücrelerinde 10 gün süreyle tedavi edildi.

8. Memeli Epitelyal Hücrelerin Yağ Pad Enjeksiyonu

1. İzoflüoran 2-3% inhalant içeren 3 haftalık bir kadın C57BL / 6 fareyi anestezi altına alın.
2. Anestezi uygulanmış fareyi sırtına yerleştirin. Karın ortasındaki kürkü bir ustura / saç kremi kullanarak çıkarın ve cerrahi alanı% 70 alkol ve povidon iyot içeren üç dönüşüm döngüsü ile temizleyin.
3. Makaslarla ventral torasik-inguinal bölge boyunca cilt boyunca 1.5 cm dikey kesi yapın ve ardından dönüşümlü olarak sağ ve sol ^4. meme yağ pedlerini gösterin.
4. Her yağ yastığını, bez parankimi makasla çıkartarak temizleyin. Yağ pedindeki lenf düğümünü bulun ve lenf düğümünün altındaki tüm bez parankimini çıkarın.
   NOT: Yağ yastığının üçte ikisi yerde kalmalıdır.
5. Adım 7.2'den elde edilen hücreleri , doğal bir enzim karışımı ( Malzeme Tablosuna bakınız ) ile proteolitik a10 dakika boyunca kolajenolitik enzim aktivitesi. PBS içinde% 5 FBS ile enzim aktivitesini nötralize edin.
6. Süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika 450 x g'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Bir hemositometre ile hücreleri sayın ve 15 μL istenen hücre dozu (10 ⁴ -10 ² hücre / ped) içeren bir konsantrasyonda PBS hücreleri askıya alın.
7. Bir meme epitel hücre süspansiyonu 15 mcL bir yağ yastığı içine bir 27G iğne bağlı bir 100 uL cam şırınga kullanarak enjekte edin.
8. Diğer taraftaki yağ yastığı için 8.4-8.7 adımlarını tekrarlayın.
9. Yara klipleri ile deriyi kapatın.

9. Meme Bezi Tüm Montaj

1. Fareyi, hücre enjeksiyonundan 8 hafta sonra CO ₂ artı servikal çıkığı ile euthanize edin (Adım 8.7).
2. Göğüs bölgesinden kasık bölgesine makas kullanarak cilt katmanı üzerinden dikey bir kesi yapın ve ardından sağ ve sol ^4. mAmmary yağ pedleri. ^4. meme bezlerini çıkartın ( Şekil 2 ).
3. Yağlı pedleri cam mikroskop lamları üzerine yayın ve gece boyunca oda sıcaklığında Kahle fiksatif (% 4 formaldehit,% 30 EtOH ve% 2 buzlu asetik asit) ile yağ yastıklarını sabitleyin.
   Dikkat: Kahle fiksatif maddesi tahriş edicidir. Bu adımı kimyasal bir kaputta uygulayın.
4. Yağ pedlerini 250 mL% 70 EtOH içinde 15 dakika yıkayın ve sonra 250 mL dH20 ile 5 dakika yıkayın. Yağ pedlerini gece boyunca oda sıcaklığında karmine şapla (1 g araba atığı ve 2.5 g alüminyum potasyum sülfat içinde 500 mL dH20) lekeleyin.
5. Yağ pedlerini 250 mL% 70 EtOH ile 15 dakika yıkayın, 250 mL 95% EtOH 15 dakika ve 250 mL% 100 EtOH ile 15 dakika yıkayın.
6. Yağlı pedler gün boyunca ksilen içinde temizlenir ve yağ pedleri saydam hale geldiğinde ksilen inkübasyonunu durdururlar.
   Dikkat: Ksilen tahriş edicidir. Bu adımı kimyasal bir kaputta uygulayın.
7. Slaytları monte edin(2,400 dpi) dijital bir slayt tarayıcısı kullanarak yağ yastıklarının alın.

PGE 2 / EP 4 sinyallemesinin engellenmesinin, meme bazal benzeri kök hücrelerden EV / exosome salınımını tetiklediği gösterildiğinden, bu çalışma, meme epitelyal bazal hücre (NAMEC) kültüründen indüklenen EV / eksosomların izole edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. NAMEC'ler serum içermeyen ortamda kültürlendiğinden, serum 13'den türetilmiş önceden EV / ekzosom bulunmamaktadır. Serum içeren ortamda kültürlenen hücreler için, EVs / eksosomların toplanması için kaynak hücrelerin kültürü için ortam kullanılmadan önce, ortamdaki önceden mevcut eksosomlar 110.000 xg'de ultra-santrifüj ile önceden temizlenmelidir. Şekil 1 ' de gösterildiği gibi, 4 günlük indüklenen NAMEC kıvamlandırmalı ortamdan EVs / eksosomlar, 110,000 xg peletten diferansiyel ultra-santrifüj ile izole edilebilir. 110.000 xg'lik pellin içindeki izole veziküllerin sayısı ve büyüklüğüNanopartikül izleme analizi (NTA) kullanılarak ölçülebilir. Diferansiyel ultrasantrifüj ile izole edilen 110.000 g pelet fraksiyonu esas olarak ~ 100 nm vesiküller içerir ( Şekil 4A ); Bu, literatürde bildirilen eksozomların (50 - 150 nm) boyutu ile uyumludur. Buna ek olarak, TEM analizi, 110.000 g NAMEC kıvamlandırılmış ortam fraksiyonlarının bol zar vesikülleri içerdiğini gösterdi ( Şekil 4B ). Diferansiyel ultrasantrifügasyon makul derecede saf eksosomlar üretse de, aşağıdaki yoğunlaştırma gradyan saflaştırma basamağı , kirletici maddeleri ( örneğin, protein agregaları) elimine eder. Yoğunluk gradyanında, ekzosomlar vesiküldeki lipid içeriğinden dolayı gradyanda yüzerlerken, protein agregaları, eğer varsa, degradenin altında kalır. Gradiyentin her fraksiyonu, eksozom üreticilerinin ( örn., CD81, CD63, CD9 ve TSG101) tespiti için toplanır , 7 ) Western blot ile belirlenir. Eksozom belirteçleri fraksiyonda ~% 20 iodiksanol ile tespit edilebilir ( Şekil 5 ). Eksozomları içeren fraksiyon PBS ile seyreltilebilir ve eksozomları izole etmek için 200,000 xg ultra-santrifüjleme tabi tutulabilir. İzole edilen exozom pelet bir kez PBS içinde yıkanır ve daha sonra PBS içerisinde yeniden süspanse edilir ve ileri analiz için -20 ° C'de saklanır.

NAMEC türevi EV'lerin / eksosomların, meme epitel hücrelerinin-HMLE hücrelerinin sap olmayan karşılığı olan parçası tarafından alınmasını ölçmeden önce, EVs / eksozomlar bir flüoresan boya ile ( örn., Karboksiflüoresase süksinimidil ester (CFSE)) etiketlenmelidir. Sadece CFSE'yi içermekle birlikte EV / exosome içermeyen paralel bir örnek aynı etiketleme prosedüründe işlenir. Bu numune, aşağıdaki EV / eksosom toplama testinde kullanılan, negatif bir kontrol olup, iz kalmayan serbest CFS'nin etkisini yansıtmaktadırE boya. HMLE hücreleri, CFSE ile işaretlenmiş, NAMEC'den türetilmiş EVs / eksozomlar veya negatif kontrol ile 2-6 saat kültürlenir ve daha sonra akış sitometrisine tabi tutulur. Muamele edilmemiş HMLE hücreleriyle karşılaştırıldığında, negatif kontrol ile kültürlenen HMLE hücreleri, CFSE sinyalinin biraz daha yüksek bir seviyesini ifade eder ( Şekil 6A , kırmızı çizgi / turuncu çizgi), bu, CFSE sinyalinin arka plan seviyesini, EV / exosome etiketleme süreci. Dahası, negatif kontrol ile tedavi edilen HMLE hücreleriyle karşılaştırıldığında, CFSE etiketli NAMEC türevi eksozomlar ile kültürlenen HMLE hücreleri, özgül alımdan kaynaklanan, 10 kat daha yüksek bir CFSE sinyalini ( Şekil 6A , mavi çizgi ile kırmızı çizgi) ifade eder CFSE etiketli EV'lerin / eksosomların. CFSE etiketli NAMEC türevli EV'lerin / eksosomların HMLE hücreleri tarafından alınması konfokal mikroskopi ile de gözlemlenebilir. Negatif kontrol ile tedavi edilen HMLE hücreleri bir CFSE sinyali göstermezken, NA'nın alınmasıHMLE hücreleri tarafından MEC türevi EVs / eksozomlar, CFSE etiketli EV / exozome ile işlem gören hücrelerdeki konfokal mikroskop altında CFSE sinyali ile gözlemlenebilir ( Şekil 6B ).

NAMEC'den türeyen EV'lerin / eksozomların göğüs benzeri meme bazal hücrelerden meme luminal hücrelerine meme bezi oluşturma yeteneğini aktarabildiğini değerlendirmek için fare meme lüminal hücreleri farelerde meme bezi oluşumunun analizi için ilk izole edilir. Farenin meme epitel hücreleri, 12 haftalık farelerden izole edilmiştir. Meme bezleri küçük parçalara ayrılır ve ayrıca kollajenaz ve tripsin ile ayrılır. Ayrışmış epitel organoidleri ve fibroblastlar, 5.7 ve 5.8. Adımlarda anlatıldığı gibi diferansiyel santrifüj ile ayrılabilir. Santrifüjün her turunda, tüplerin altındaki pelet esas olarak epitelyal organoidler içermeli ve fibroblastlar ve tek hücreler süpernatanda yüzmelidirt. Diferansiyel santrifüj işleminden önce hem epitel organoitleri hem de fibroblastlar içeren karışım ( Şekil 3 , üst paneller) ile karşılaştırıldığında altı turlu santrifüjleme, karışımdaki fibroblastların ve tekli hücrelerin hepsini temizler ( Şekil 3 , alt panel).

Epitelyal organoidlerin meme epitel hücreleri ( Şekil 7 ), proteolitik ve kollajenolitik enzim aktivitesi olan doğal bir enzim karışımı kullanılarak daha da ayrılır ve süspansiyon halinde tek hücreler üretmek için disperse edilir. Tek hücreli süspansiyonun hücre yüzeyi CD49f ve EpCAM ile sınıflandırılması, meme lüminal hücrelerini (EpCAM hi / CD49f lo ), meme bazal hücrelerinden (EpCAM lo / CD49f hi ) ve epitel dışı hücreleri (EpCAM - ) ( Şek. 8 ).

hi / CD49f luminal meme epitel hücreleri, NAMEC türevli EV'ler / eksozomlarla 10 gün boyunca kültürlenir ve taze EV'ler / eksozomlar ve ortam her iki günde bir değiştirilir. EV / ekzosom tedavisinden sonra, meme luminal hücreleri farelerin 4. meme yastığı yastıklarına ( Şekil 2 ) implante edilir. 8 hafta sonra, yağ bezleri izole edilir ve meme bezi oluşumunun analizi için lekelenir ( Şekil 9 ). İndüklenmiş NAMEC türevli EV / ekzozomlarla yapılan muamele, luminal hücrelerin meme bezi oluşturma yeteneğini kazanmasına olanak tanır 4 . NAMEC'den türeyen, EV / exozom ile tedavi edilen meme luminal hücreleri, fare yağ yastıklarında meme bezlerini oluşturur ( Şekil 9 ).

Şekil 1: Ekstraselluların İllüstrasyonuDiferansiyel Ultrasantrifüjleme ile Hücre Kültürü Ortamından Vesikül / Eksozom Pürfiye Yöntemi. Her bir santrifüjün hızı ve uzunluğu gösterilir. İlk üç santrifüjden her birinden sonra, süpernatan bir sonraki aşamada tutulur. 110.000 × g santrifüje edildikten sonra, topaklar muhafaza edilir ve süpernatanlar atılır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 2: Fare Meme Bezi Anatomisi. Fare, derinin hemen altındaki yağ yastıklarında (kırmızı) bulunan 1-5 rakamlarıyla gösterilen beş çift meme bezine sahiptir. Th daha büyük bir sürümünü görmek için lütfen tıklayınızŞekildir.

Şekil 3: Diferansiyel santrifüj işleminden önce ve sonra epitel organoitleri ve yağ yastıkları hücrelerinin bir karışımının görüntüleri. Ayrık santrifüj işleminden önce ve sonra, izole edilmiş yağ-pedi hücre karışımlarının parlaklık görüntüleri hemositometreden alınmıştır. Ok uçları: epitelyal organoidler. Ok: fibroblastlar ve tek hücreler. Ölçek çubuğu = 0.5 mm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 4: NAMEC110,000 xg Pelet Fraksiyonunun Vesikül Boyutu ve Konsantrasyon Analizi. NAMEC ortamının 110.000 g pelet fraksiyonu kolon ( A ) nano parçacık izleme analizi (NTA) ve ( B ) transmisyon elektron mikroskobisine (TEM) tabi tutuldu. Ölçek çubuğu = 1 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 5: Yoğunluk Derecesinin Kesirlerinde Eksozomların Saptanması. Ekzozom belirteçleri CD81, CD9, CD63 ve Tsg101 ve kat hizmetleri geni GAPDH'nin Western blot analizi, eksozomları içeren% 20 iodiksanol fraksiyonunu ortaya koymaktadır. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

55736fig6.jpg "/>
Şekil 6: Akış Sitometri ve Konfokal Mikroskopi ile Ekstraselüler Vesikül / Eksozom Alma Tespiti. EV / eksozom alımı HMLE hücrelerinde ölçülmüştür. Belirtilen kültürlere CFSE etiketli NAMEC türevli EVs / ekzozomlar ve negatif kontrol, 6 saat boyunca eklenir. İnkübasyondan sonra hücreler, ( A ) akış sitometrisi ve ( B ) konfokal mikroskopi. CFSE (yeşil; uyarılma / emisyon (nm): 492/517; mikroskop lazer çizgisi: 488) floresan yoğunlukları, EV / ekzozom alımı yansıtmaktadır. Hücre çekirdeği, DAPI (mavi; uyarılma / emisyon (nm): 358/461; mikroskop lazer hattı: 405) ile lekelenir ve plazma membranları, plazma membranı lekesi ile boyanır (kırmızı; uyarma / emisyon (nm): 649/666; Mikroskop lazer çizgisi: 633 , Malzeme Tablosuna bakınız ). Konfokal objektif lens: HCX PL APO 63x / 1.40-0.60 Yağ. Ölçek çubuğu = 20 μm.Ad / 55736 / 55736fig6large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 7: Ekli Epitelyal Organoidlerin Görüntüleri. Bağlanmış epitel organoidlerine göç eden ve büyüyen hücreler tarafından oluşturulan meme epitel hücrelerinin parlak görüntüleri. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 8: Yüzey EpCAM ve CD49f ile Birincil Fare Meme Epitelyal Hücrelerinin Sınıflandırılması. 12 haftalık farelerin yağ yastıklarından izole edilen fare meme epitel hücreleri, hücre sıralamasına tabi tutuluring. Fare meme luminal hücreleri, mavi daire ile işaretlenmiş EpCAM hi / CD49f popülasyonunda zenginleştirilmiştir; Bazal hücreler, kırmızı daire ile işaretlenmiş EpCAM lo / CD49f hizasında zenginleştirildi. Epitel dışı hücreler arsa içinde siyah kutu ile işaretlenmiştir. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Şekil 9: Primer Fare Luminal Membran Hücreleri Tarafından Yapılan Meme Bezi Oluşumu. Birincil fare EpCAM hi / CD49f luminal hücreler 10 gün süreyle hücre kültüründe PBS veya NAMEC türevli EVs / ekzozomlar ile muamele edilir ve 3 haftalık farelerin temizlenmiş yağ pedlerine implante edilir. Fareler östrüs haline getirildi ve 8 hafta sonra nekropsiyone edilerek meme bezi formunun analizi yapıldıtirme. Ölçek çubuğu = 0.75 cm. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.

Tablo 1: Şekil 8'de Açıklanan Nüfusların Yüzdesi ve Ortalama Floresans Yoğunluğu (MFI).

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.