Bu protokol, adherent / mezenkimal meme epitel hücrelerinden ekstraselüler veziküller (EV) / ekzozomların arıtılması, nicelendirilmesi ve karakterize edilmesine yönelik yöntemleri ve meme bezi oluşturma yeteneğini luminal meme epitel hücrelerine aktarmak için kullanmayı açıklamaktadır. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilmiş EVs / eksozomlar, bu hücre özelliğini EV'leri / eksosomları emen hücrelere aktarabilir.
Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliğiniz gereklidir. Giriş yapın veya ücretsiz denemenizi bugün başlatın.
Yöntem makalesi
Membran Bazal Epitelyal Hücreler ile Membran Luminal Hücreler Arasındaki Meme Bezi Oluşturma Yeteneğinin Ekstraselüler Vesiküller / Ekzozomlar Yoluyla Transferi
* These authors contributed equally
Bu makalede
Özet
Özet
Hücreler, ekzozomlar, proteinler, lipidler ve nükleik asitler içeren ~ 100 nm'lik ekstraselüler veziküllerle (EV'ler) iletişim kurabilir. Yapışık olmayan / mezenkimal meme epitel hücresi (NAMEC) kaynaklı ekstrasellüler veziküller, NAMEC ortamından diferansiyel ultra-santrifüj ile izole edilebilir. Yoğunluklarına bağlı olarak EV'ler 110.000 x g'de ultra-santrifüjleme yoluyla saflaştırılabilir. Ultra-santrifüjden elde edilen EV preparatı, çözünebilir proteinlerle kontaminasyonu önlemek için sürekli bir yoğunluk gradyanı kullanılarak daha da ayrılabilir. Ardından, saflaştırılmış EV'ler, müstahzar içindeki veziküllerin sayısını ve sayısını ölçen nanopartikül izleme analizi kullanılarak daha da değerlendirilebilir. 50 ila 150 nm arasında değişen boyuttaki hücre dışı veziküller eksozomlardır. NAMEC türevli EV'ler / eksozomlar, flow sitometri ve konfokal mikroskopi ile ölçülebilen meme epitel hücreleri tarafından alınabilir. Bazı meme kök hücre özellikleri ( örneğin, meme bezi oluşturma yeteneği) canGövde benzeri NAMEC'lerden NAMEC türevi EVs / eksozomlar yoluyla meme epitel hücrelerine aktarılmalıdır. EpCAM lo / CD49f yüksek bazal meme epitel hücreleri transplantasyondan sonra meme bezlerini oluştururken, izole primer EpCAM merhaba / CD49f luminal meme epitel hücreleri fare yağ pedlerine nakledildikten sonra meme bezleri oluşturamazlar. EpCAM hi / CD49f luminal meme epitel hücreleri tarafından NAMEC türevi EVs / ekzozomların alınması, yağ pedlerine nakledildikten sonra meme bezleri üretmelerine izin verir. Gövde benzeri meme epitel hücrelerinden türetilen EVs / eksozomlar meme bezi oluşturma yeteneğini EpCAM hi / CD49f luminal meme epitel hücrelerine aktarır.
Giriş
Eksozomlar, hücreler arasında membran ve sitozolik proteinler, lipidler ve RNA'lar aktararak hücresel iletişimi arabuluculuk edebilir 1 . Eksozom aracılı iletişimin pek çok fizyolojik ve patolojik sürece dahil olduğu gösterilmiştir ( örn., Antijen sunumu, tolerans 2 gelişimi ve tümör ilerlemesi 3 ). Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan kaynak hücrelerinkine benzer içerikler içerir. Böylece, eksozomlar, kaynak hücrelerden spesifik hücre özelliklerini taşıyabilir ve bu özellikleri, hücreleri sindiren hücrelere aktarabilir 4 .
....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Protokol
Hayvanları ilgilendiren tüm araştırmalar, Hayvan Bakımı Kurumsal Komitesi tarafından onaylanan protokollere uymaktadır.
1. Ekstraselüler Vesikül / Ekzoz İzolasyonu ve Validasyonu
- 500 mL MCDB 170, pH 7.4 + 500 mL DMEM / F12'den sodyum bikarbonat (% 0.2438) ile yapılmış taze, serum içermeyen ortam ile kültür meme epitelyal bazal hücreleri, NAMEC'ler 4 ; EGF (5 ng / mL); Hidrokorition (0.5 ug / mL); Insülin (5 ug / mL); Sığır hipofiz hulasası (BPE; 35 μg / mL); Ve GW627368X (1 μg / mL) ile 15 cm bulaşık yıkayın.
- Hücreleri bir hemocytometer ile saydıktan sonra, 4 gün süreyle 0 günde 15 cm&#....
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Sonuçlar
PGE 2 / EP 4 sinyallemesinin engellenmesinin, meme bazal benzeri kök hücrelerden EV / exosome salınımını tetiklediği gösterildiğinden, bu çalışma, meme epitelyal bazal hücre (NAMEC) kültüründen indüklenen EV / eksosomların izole edilmesi için bir yöntem sunmaktadır. NAMEC'ler serum içermeyen ortamda kültürlendiğinden, serum 13'den türetilmiş önceden EV / ekzosom bulunmamaktadır. Serum içeren ortamda kültürlenen hücreler için, EVs / eksosomların toplanması iç.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Tartışma
Ekzozomlar genellikle onları serbest bırakan hücrelerin özelliklerini taşır ve salınan eksosom miktarı uyaranlar 4 tarafından indüklenebilir. Hücrelerin kültür ortamı toplanabilir ve EV / ekzosom toplamak için diferansiyel ultrasantrifüj işlemine tabi tutulur ( Şekil 1 ). Şu anda EV'leri / eksosomları izole etmek için ideal bir yöntem hakkında genel bir mutabakat yok. Burada kullanılan en uygun yöntem, aşağı yönlü uygulama 14 tarafından belirlenmiştir. Ultra sant.......
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Açıklamalar
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Teşekkürler
Bu çalışma, Ulusal Sağlık Araştırma Enstitülerinden (05A1-CSPP16-014, HJL) ve Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MOST 103-2320-B-400-015-MY3, HJL) hibelerle desteklenmiştir.
....Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Malzemeler
| Ad | Şirket | Katalog numarası | Yorumlar |
|---|---|---|---|
| MCDB 170 | USBiological | M2162 | |
| DMEM/F12 | Thermo | 1250062 | |
| Optima L-100K ultrasantrifüj | Beckman | 393253 | |
| SW28 Ti Rotor | Beckman | 342204 | |
| SW41 Rotor | Beckman | 331306 | |
| NANOSIGHT LM10 | Malvern | Nanopartikül izleme analizi (NTA) için | NANOSIGHT LM10 |
| Optiprep | Sigma-Aldrich | D1556 | Suda% 60 (a/h) iyodiksanol çözeltisi (steril). |
| CD81 antikoru | GeneTex | GTX101766 | 1: 1.000% 5 w / v yağsız kuru süt, 1x TBS,% 0.1 Tween 20 at 4 & °C; C, bir gecede |
| CD9 antikoru | GeneTex | GTX100912 | 1: 1.000% 5 w / v yağsız kuru süt, 1x TBS,% 0.1 Tween 20 at 4 & derece; C, bir gecede |
| CD63 antikoru | Abcam | Ab59479 | 1: 1.000% 5 w / v yağsız kuru süt, 1x TBS,% 0.1 Tween 20 at 4 & derece; C, bir gecede |
| TSG101 antikoru | GeneTex | GTX118736 | 1: 1.000% w/v yağsız kuru süt, 1x TBS,% 0.1 Tween 20 at 4 & derece; C, bir gecede |
| GAPDH | GeneTex | GTX100118 | 1:6.000 inç %5 yağsız kuru süt, 1x TBS, 0.1 Tween 20 4 &°C'de; C, bir gecede |
| CFSE (karboksifloresein süksinimidil diasetat ester) | Thermo | V12883 | |
| FACSCalibur | BD Biosciences | floresan hücre analizörü | |
| kollajenaz Tip IV ve nbsp; | Termo | 17104019 | |
| tripsin | Termo | 27250018 | |
| ITS | Sigma-Aldrich | I3146 | , rekombinant insan insülinini, insan transferrini ve sodyum selenit |
| akutaz | karışımı ebioscience | 00-4555-56 | proteolitik ve kollajenolitik enzim aktivitesi ile doğal bir enzim |
| karışımıdır; | KÖK HÜCRE | 7913 | 5 mg/mL = 5 U/mL |
| anti-CD49f antikoru | Biolegend | 313611 | 1:50 |
| anti-EpCAM antikoru | Biolegend | 118213 | 1:200 |
| FACSAria | BD Biosciences | hücre sıralayıcı | |
| karmin şapı | Sigma-Aldrich | C1022 | |
| insan meme epitel hücreleri (HMLE hücreleri, NAMEC'ler) | Dr. Robert Weinberg'den hediyeler | ||
| permount | Thermo Fisher Scientific | SP15-500 | |
| sodyum bikarbonat | Zymeset | BSB101 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-015 | |
| Hidrokoriton | Sigma-Aldrich | SI-H0888 | |
| İnsülin | Sigma-Aldrich | SI-I9278 | |
| BPE (sığır hipofiz ekstresi) | Hammod Cell Tech | 1078-Yeni Zelanda | |
| GW627368X | Cayman | 10009162 | |
| 15 cm kültür kabı | Şahin | ||
| masa üstü santrifüj | Eppendrof | Santrifüj 3415R | |
| ultrasantrifüj tüpü | Beckman | 344058 | |
| PBS (Fosfat tamponlu salin) | Corning | 46-013-CM | |
| BCA Protein Testi | Thermo Fisher Scientific | 23228 | |
| Transmisyon Elektron Mikroskobu | Hitachi | HT7700 | |
| jelatin | STEMCELL | 7903 | |
| 10 cm kültür kabı | Falcon | ||
| 6 oyuklu kültür kabı | Corning | 3516 | |
| dişi C57BL/6 fare | NLAC (Ulusal Laboratuvar Hayvanları Merkezi | ||
| FBS (Fetal Sığır Serumu) | BioWest | S01520 | |
| gentamisin | Thermo Fisher Scientific | ||
| Kalem/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| DNaz I | 5PRIMER | 2500120 | |
| izofloran | Halokarbon | NPC12164-002-25 | |
| formaldehit | MACRON | H121-08 | |
| EtOH (Etanol) | JT Baker | 800605 | |
| buzlu asetik asit | Panreac | 131008.1611 | |
| alüminyum potasyum sülfat | Sigma-Aldrich | 12625 | |
| Ksilen ve nbsp; | Leica | 3803665 | |
| 0.22 μ m membranlar | Merck Millipore | Millex-GP | |
| AUTOCLIP Yara Klipsleri, 9 mm | BD Biosciences | 427631 | |
| AUTOCLIP Yara Klipsi Uygulayıcısı | BD Biosciences | 427630 | |
| CellMask ve ticaret; Koyu Kırmızı | Thermo Fisher Scientific | C10046 | plazma zarı lekesi |
Kaynaklar
- Simons, M., Raposo, G. Exosomes--vesicular carriers for intercellular communication. Curr Opin Cell Biol. 21 (4), 575-581 (2009).
- Théry, C., Ostrowski, M., Segura, E. Membrane vesicles as conveyors of immune responses. Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).
Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.
Yeniden basım ve izinler
