Yöntem makalesi

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

DOI:

10.3791/55738

⸱

1 Haziran 2017

 , 
1Department of Pediatrics-Division Cardiology, University of Rochester

Bu makalede

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu protokol, fonksiyonel mitokondriyal elektron transport zincir komplekslerinin (Cx) IV ve bunların süper komplekslerinin yerli elektroforezi kullanarak, bunların montajı ve yapısı hakkında bilgi vermek üzere ayrılmasını açıklamaktadır. Nativ jel immünoblotlama, in-jel deneylerine tabi tutulabilir ve bireysel kompleksleri daha da karakterize etmek için elektroliz ile saflaştırılabilir.

Özet

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal elektron taşıma zinciri (ETC), çeşitli yakıtların parçalanmasından elde edilen enerjiyi hücre ATP'nin biyoenerjetik para birimine dönüştürür. ETC, elektron taşıma ve ATP üretiminin verimliliğini arttıran respirasom (CI, C-III ve C-IV) ve synthasomes (CV) süper komplekslerine de dahil olan 5 büyük protein kompleksinden oluşur. ETC fonksiyonunu ölçmek için 50 yılı aşkın süredir çeşitli yöntemler kullanılmıştır, ancak bu protokoller bireysel komplekslerin ve süper komplekslerin montajı hakkında bilgi sağlamamaktadır. Bu protokol, yerli jel poliakrilamid jel elektroforezinin (PAGE), ETC karmaşık yapısını incelemek için 20 yıldan daha önce modifiye edilmiş bir yöntemi açıklar. Doğal elektroforez, ETC komplekslerinin aktif formlarına ayrılmasına izin verir ve bu kompleksler daha sonra immünoblotlama, jel içi deneyler (IGA) ve elektroliz ile saflaştırma kullanılarak incelenebilir. BirleştirerekDoğal jel PAGE'in diğer mitokondriyal deneylerle elde edildiği durumlarda, ETC aktivitesinin kompleman resmini, dinamik birleştirme ve demonte parçasını ve bunun mitokondriyal yapı ve işlevi nasıl düzenlediğini görmek mümkündür. Bu çalışma aynı zamanda bu tekniklerle ilgili sınırlamaları tartışacaktır. Özetle, aşağıda sunulan immünoblotlama, IGA ve elektroelüsyon takip eden yerli PAGE tekniği mitokondrial ETC süper komplekslerinin işlevselliğini ve kompozisyonunu araştırmanın güçlü bir yoludur.

Giriş

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ATP formundaki mitokondrial enerji, sadece hücre sağkalımı için değil, aynı zamanda hücre ölümünün düzenlenmesi için de gereklidir. Oksidatif fosforilasyon ile ATP'nin üretilmesi, fonksiyonel bir elektron taşıma zinciri (ETC; Cx-I ila IV) ve mitokondriyal ATP sentaz (Cx-V) gerektirir. Son yıllarda yapılan çalışmalar, bu büyük protein komplekslerinin respirazomlar ve synthasomes 1 , 2 olarak adlandırılan süper kompleksler halinde düzenlendiğini göstermiştir. Bu muazzam komplekslerin ve süper komplekslerin montajını, dinamiklerini ve faaliyet düzenlemelerini analiz etmek zor. Bir oksijen elektrodu ile alınan oksijen tüketimi ölçümleri ve bir spektrofotometre kullanılarak gerçekleştirilen enzim analizleri, ETC karmaşık aktivitesi hakkında değerli bilgiler verebilirken, bu testler, ilgili protein kompleksinin veya süper komplekslerin varlığı, boyutu ve alt birimi kompozisyonu hakkında bilgi sağlayamaz. Bununla birlikte, mavi ve berrak yerli (BN ve CN) SAYFA 3 , fizyolojik ve patolojik koşullar altında karmaşık kompozisyon, montaj / demontaj ve bu hayati solunum komplekslerinin supramoleküler organizasyonunun dinamik düzenlenmesi hakkında önemli bilgileri açığa çıkarmak için güçlü bir araç yarattı.

Bu komplekslerin yüksek mertebeli süper komplekslere birleştirilmesi, mitokondriyal yapıyı ve fonksiyonu düzenler gibi gözükmektedir 5 . Örneğin respirasome düzeneği, elektron transferinin verimliliğini ve mitokondriyal iç zar 5 boyunca proton güdü kuvvetinin oluşmasını arttırır. Buna ek olarak, sentazomların bir araya getirilmesi sadece ATP üretiminin etkinliğini ve enerji eşdeğerlerinin sitoplazma 2'ye aktarılmasını arttırmakla kalmaz, aynı zamanda mitokondriyal iç zar da boru şekilli cristae 6'ya kalıplar./ Sup> 7 . Fare embriyolarında kardiyak gelişim sırasında süper kompleks birleştirme çalışmaları, kalpteki Cx-I içeren süper kompleks oluşumunun yaklaşık embriyonik gün 13.5 8'de başladığını göstermektedir. Bazıları, yaşlanma veya iskemi / reperfüzyon yaralanmaları 9 , 10 nedeniyle kalpte Cx-I içeren süper kompleks miktarının azaldığını veya nörodejeneratif hastalıkların ilerlemesinde rol oynayabileceğini göstermiştir.

Bu protokol, ETC kompleksleri ve süper komplekslerinin toplanması ve aktivitesini araştırmak için kullanılabilen yerli jel PAGE için yöntemleri açıklamaktadır. Mitokondriyal süper komplekslerin yaklaşık molekül ağırlığı, protein komplekslerinin CN veya BN poliakrilamid jeller ile ayrılmasıyla değerlendirilebilir. CN PAGE ayrıca tüm mitokondriyal komplekslerin enzimatik aktivitesinin jel içinde doğrudan görselleştirilmesini sağlar (in-jel deneyleri;IGA) 12 . Bu çalışma, CX-I'in IGA yoluyla NADH'yi oksitleme kabiliyetini ve IXA tarafından Cx-V'nin ATP-hidrolize edici aktivitesine bağlı olarak sentazomların varlığını vurgulayarak respirasomların aktivitesini gösterir. Cx-I ve Cx-V içeren çoklu kompleksler ve süper kompleksler, proteinlerin nitroselüloz membranlara aktarılması ve imünoblotlama yapılması ile de gösterilebilir. Bu yaklaşımın avantajı, BN veya CN PAGE'nin genellikle protein komplekslerini fizyolojik büyüklükleri ve bileşimine göre ayırmasıdır; Bir membrana transfer bu bant modelini korur. Bir BN veya CN PAGE'deki protein komplekslerinin analizi, 2D-PAGE (bir gösteri için bkz. Fiala ve diğerleri 13 ) veya sakkaroz yoğunluğu santrifüjleme 14 , 15 ile de yapılabilir. Belirli bir bandı daha ayrıntılı olarak analiz etmek için, BN PAGE'den çıkarılabilir ve bu protein kompleksinden alınan proteinler saflaştırılabilirD onları doğal koşullar altında elektro-eriterek. Doğal elektroelüsyon, birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir, bu da bir jelden proteinlerin çevresindeki tampona pasif difüzyona (Referans 16'da kullanıldığı gibi) önemli bir fark yaratabilir.

Özetle, bu yöntemler, yüksek molekül ağırlıklı süper komplekslerin mitokondriyal membranlardan daha fazla karakterize edilmesini sağlayan birkaç yaklaşımı açıklamaktadır.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Protokol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tüm deneyler, C57BL / 6N farelerinden (vahşi tip) kalpler kullanılarak gerçekleştirildi. Fareler, servikal dislokasyon öncesinde CO 2 ile anestezi altına alındı ​​ve tüm prosedürler, Rochester Üniversitesi Laboratuar Hayvanları Tıbbı Birimi'ne ve devlet yasalarına, federal tüzüğe ve NIH politikasına uygun olarak gerçekleştirildi. Protokol, Rochester Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (Hayvan Kaynakları Üniversite Komitesi) tarafından onaylandı.

1. CN ve BN SAYFASI

NOT: BN ve CN PAGE için kullanılan tüm teçhizat deterjan içermemelidir. Bunu sağlamak için, tüm ekipmanı 0.1 M hidroklorik asit ile yıkayın ve bunu takiben deiyonize H20 ile durulayın.

  1. Hazırlık
    1. 4 mM'de, 25 mM imidazol, pH 7.0'dan oluşan anot tamponunu hazırlayın; 4 ° C'de saklayın.
    2. Katot tamponunu CN veya BN PAGE için hazırlayın.
      1. CN PAGE için 7.5 mM imidazol ve 50 mM trişin kullanın; Litre tampon başına 0.5 g sodyum deoksikolat ve 0.2 g lauril maltozid ilave edin. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
      2. BN PAGE için, 7.5 mM imidazol ve 50 mM trişin kullanın ve pH'yı 4 ° C'de 7.0'a ayarlayın. 4 ° C'de saklayın.
      3. Açık mavi BN katot tamponu için 7.5 mM imidazol ve 50 mM trişin kullanın. PH'ı 4 ° C'de 7.0'a ayarlayın ve litre tampon başına 20 mg Coomassie ekleyin. 4 ° C'de saklayın.
    3. Ekstraksiyon tamponunu (EB) 50 mM NaCl, 50 mM imidazol, 2 mM aminokaproik asit ve 1 mM EDTA ile hazırlayın. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    4. 75 mM imidazol ve 1.5 M aminokaproik asit ile 3x jel tamponu (BN ve CN jelleri için kullanılır) hazırlayın. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    5. 0.01 g Ponceau S, 5 gr gliserol ve 5 mL H 2 O'dan oluşan bir yükleme tamponu (LB) hazırlayın. Odasıcaklık.
    6. 1 mL 500 mM 6-aminoheksanoik asite 50 mg Coomassie ekleyerek Coomassie mavisi hazırlayın. 4 ° C'de pH'ı 7.0'a ayarlayın ve 4 ° C'de saklayın.
    7. H20 içinde 20 mM ve 200 mM lauril maltozid hazırlayın. 200 uL'lik alikotları yapın ve dondurularak saklayın. Kullanmadan önce deterjanı çözün.
% 3 ila% 8 (mini) % 4 ila% 10 (maksimum)
0.5 jel (ışık) 0.5 jel (ağır) 0.5 jel (ışık) 0.5 jel (ağır)
AAB (mL) 0.42 1.3 2.5 7.7
CN / BN tamponu (mL) 1.6 1.6 8.5 8.5
H20 (mL) 2.7 1.4 14 6.3
Gliserol (g) 0 0,47 0 2.5
Hacim (mL) 4.72 4.77 25 25
APS (μL) 27 27 65 65
TEMED (μL) 4 4 10 10

Tablo 1: 1 Mini veya Maxi-PAGE'yi Dökmek İçin Gerekli Malzemelerin Miktarları. Bu tabloda kullanılan ciltler, 1.5 mm kalınlığında 1 mini veya 1 maxi-jel için hesaplanmıştır. AAB hacmi,% 40 stok çözeltisine dayanıyor. Hafif ve ağır konsantrasyona işaret eder.AAB'nin iyonu. Degrade karıştırıcının her bir sütununun AAB çözeltisi ile doldurulmasından sonra APS ve TEMED eklenir.

  1. Dökme ve koşu jöleleri
    NOT: sırasıyla CN veya BN jelleri için% 3-8 veya% 4-10 akrilamid / bisakrilamid (AAB) gradyan kullanın. Tablo 1 , bir mini jel (85 mm genişlik x 73 mm yüksek x 1.5 mm kalınlık) veya maxi-jel (160 mm) için kullanılan tampon, AAB, H20, gliserol, amonyumperülfat (APS) ve tetrametiletilendiamin'in (TEMED) miktarlarını özetlemektedir Mm genişlik x 200 mm yükseklik x 1.5 mm kalınlık). CN veya BN jelleri ile cam plakaların montajları birkaç mL 1x jel tamponlu bir torbada soğutulabilir veya saklama için 1x jel tamponu ile ıslatılmış kağıt havlu içine sarılabilir. Jeller, bir haftaya kadar kullanım için kararlıdır.
    1. Jel dökmek için, jelin hazırlanmış jel odasına yerçekimi tarafından akmasını sağlamak için degrade karıştırıcıyı yükseltilmiş bir karıştırma plakasına yerleştirin.
    2. Degrade karıştırıcının çıkış odasını 4.77 / 25 mL (Mini / maxi) (daha yüksek AAB konsantrasyonu ile).
    3. Ağır ve hafif haznenin durdurma musluğunu yavaşça açın ve diğer tarafa doğru bir damla solüsyon akmasını sağlayın.
      NOT: Bu, iki hazne arasındaki akışı engelleyecek şekilde bağlantı tüpünden ve durdurma musluğundan gelen hava kabarcıklarını iter. Bu, her iki tarafın da zaten doldurulmuş olması halinde yapılamaz, çünkü eşit basınç kabarcığın içinden geçmesini önleyecektir.
    4. Degrade karıştırıcının diğer odasını 4.72 / 25 mL (mini / maxi) ışık özümüyle doldurun.
    5. Ağır çözelti ile dışarıya akış odasında bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve karıştırmaya başlayın. Kabarcık oluşturmayan bir karıştırma çubuğu hızı kullanın.
    6. Polimerizasyonu başlatmak için her bölmeye hızla APS ve TEMED ekleyin.
    7. Degrade mikseri iki odası arasındaki bağlantıyı açın ve jel dökmek için çıkış odası açmadan önce birkaç saniye karıştırmaya bırakın.
      NOT: Gravity wiHer iki odacığı eşit derecede boşaltacağım ve ışığın ağır çözeltiye karıştırılması akrilamid yoğunluğunu yavaş yavaş jelin tepesinden altına düşürecektir. Jel dökmek için degrade karıştırıcıdaki tüm içeriği kullanın.
      1. Sonunda, kabarcıkları ve katmanı karıştırmayı önlemek için tarağı jelin içerisindeki oyuklarla dikkatlice monte edin.
    8. Herhangi bir jelin durulanması için degrade karışım maddesini etanol ile hemen yıkayın. Su ile durulayın ve ikinci jeli dökün. Jellerin polimerize olmasına izin verin (genellikle mini jeller için 20 dakikadan az gerekir).
    9. Jelleri çalıştırmak için, elektrot montaj kelepçesine takın ve orta / üst bölmeyi CN veya açık mavi BN katot tamponu ile doldurun. Anot tamponunu dış / alt bölmeye eklemeden önce kaçak olup olmadığını kontrol etmek için birkaç dakika bekleyin.
      1. Nazikçe kuyu taraklarını çekin ve bir şırınga veya pipet kullanarak kuyuları katot tamponu ile yıkayın.
      2. Jelleri soğuk bir odada (4 ° C) çalıştırın veya tamamen buz içerisinde paketleyin.
        1. CN mini-PAGE için, ilk saat 100 V, tamamlanıncaya kadar 200 V, genelde ek bir 1-1.5 saat kullanın. Alternatif olarak, CN mini-PAGE'i gece boyunca 30-40 V'de çalıştırın.
          NOT: Buradaki odaklanma, yüksek molekül ağırlıklı protein kompleksleri üzerindedir, bu nedenle, 140 kDa'dan daha düşük bir molekül ağırlığına sahip protein kompleksleri jelden kaçacaktır. Düşük molekül ağırlıklı kompleksleri korumak için elektroforez için daha kısa çalışma süreleri kullanılabilir.
        2. BN maxi-PAGE için 100 V kullanın ve gece boyunca jelleri çalıştırın (yaklaşık 18 saat).
          NOT: Akım çok düşük (<15 mA) olacaktır, bu nedenle bu koşulları yerine getirebilecek bir güç kaynağı gerekir. Bu noktada, jeller IGA veya imünoblotlama için kullanılabilir. Bazı durumlarda, elektrik elüsyonu için bir cam plaka üzerine bir jilet kullanarak jetlerden bantlar veya şeritler kesilebilir.
  2. örnek hazırlama
    NOT: Membran bağlı mitokondriyal süper kompleksler,İç mitokondrial zar. Mitokondriyal süper kompleksleri korumak için, yeni izole edilmiş mitokondri ya da sadece bir kez dondurulmuş ve çözülmüş numuneler kullanın. Aşağıdaki hesaplamalar / hacimler, mini jel (1.5 mm kalınlığında bir jelde 10 kuyucuklu tarağın kuyusu, 35-40 μL'ye kadar tutar) ve maxi jeller (15 kuyucuklu kuyucuğun kuyusu için geçerlidir) için verilmiştir. 200 uL). Buna ek olarak, bir yükleme kontrolü olarak voltaja bağlı anyon kanalının (VDAC) tespiti için bir denatüre SDS jel üzerinde çalışacak şekilde, her numunenin bir bölümünü (genellikle 10 uL) saklayın.
    1. Mikrotüblerde izole mitokondriyum veya doku homojenatına uygun bir miktarda (mini jel için 10-50 μg protein ve maksimal jel için 50-200 μg) yerleştirin ve 4 ° C'de 10-15 dakika süreyle 17.000 xg'de santrifüjleyin.
      NOT: Bu adım, çözünür mitokondrial matris ve / veya sitosolik proteinlerin bir kısmını ortadan kaldırır.
    2. Süpernatantı aspire edin ve atın ve ekstraksiyon tamponu arzu edilen miktara ekleyinJel üzerine yüklemek için. Çökeltiyi buz üzerinde yavaşça tekrar süspanse edin. İsterseniz, bu noktada genel bir proteaz inhibitörü karışımı ekleyin.
      NOT: Burada kullanılan ekipmana dayanarak, bir mini jel için 30 uL ve maksi jel için 100 uL, proteinin / tampon oranının 2 mcg'den fazla proteine ​​1 uL tampona sınırlandırılması için kullanıldı.
    3. Deterjan ekleyin ( örneğin, 2 μg lauril maltozid / 1 μg protein, daha fazla bilgi için Temsilcilik Sonuçlarına ve Tartışmaya bakın).
      NOT: Genellikle, lauril maltosid kullanılır, ancak digitonin de kullanılabilir.
    4. Buz üzerinde 20 dakika inkübe edin. Tüpü öğütmek ve / veya çalkalamak suretiyle, başlangıçta ve bazen inkübasyon sırasında nazikçe karıştırın.
    5. Herhangi bir membran ve doku parçasını kaldırmak için 4 ° C'de 10 dakika süreyle 17,000 xg'de santrifüjleyin.
    6. Süpernatanı yeni bir tüpe aktarın. CN örnekleri için her 10 μL örnek hacmi için 1 μL LB ekleyin; Numunenin toplam hacmi app olmalıdırBir mini jel için yaklaşık olarak 40 μL ve maksimum jel için 130 μL. BN numuneleri için, boya ile deterjana oranı 1: 4 (a / a) olacak şekilde numunelere Coomassie ekleyin.
    7. Örneklerin sırasıyla 30 ve 120 μL'sini mini veya maxi-jelin oyuklarına yükleyin. VDAC'yi yükleme kontrolü olarak algılamak için denatüre SDS jeli için her bir örnekten kalan 10 μL'yi kullanın.
    8. Moleküler ağırlık belirteçlerini hazırlamak için, 60 μL BN / CN jel tamponundaki bir yüksek molekül ağırlıklı kalibrasyon karışımının 1 şişesini (daha fazla bilgi için Malzeme Tablosuna bakın) çözündürün ve 120 μL H 2 0 ve 20 uL 1 POUND = 0.45 KG. Şerit başına 15 μL yükleyin.
    9. Adım 1.2.9.2'de belirtildiği gibi jelleri çalıştırın.

2. Cx-I ve Cx-V için jel Analizleri

NOT: Testler oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Belgeler için gelişen bantların fotoğraflarını, taramalarını veya görüntülerini alın. (Önemli) Proteinler ont üzerinden transfer edilemezO nitroselüloz membranlar bir IGA tamamlandıktan sonra.

  1. Cx-I tahlili
    1. Hazırlık.
      1. 7.4'lük bir pH ile H20'da 5 mM Tris'lik bir deney tamponu hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
      2. 10 mg NADH'yi 1 mL tahlil tamponu içinde eritin. Kullanıma kadar -20 ° C'de 100 uL'lik alikotlar halinde saklayın; Donma ve çözülmeyi önleyin.
      3. 25 mg Nitroblue tetrazolyum'u mikrotuba koyun.
      4. 95 mL H20'da 5 mL asetik asit inceltilerek fiksatif hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
    2. Tahlil gerçekleştiriliyor.
      1. 10 mL tahlil tamponu, 25 mg Nitroblue tetrazolyum (nihai konsantrasyon: 2.5 mg / mL) ve 100 μL 10 mg / mL NADH (0.1 mg / mL) ile birleştirin. Bunu, bir jel jelden çıkarılan tüm jel, bir şerit veya ilgi alanı ekleyin.
        NOT: Bu, açık bir plastik veya cam kap içinde yapılabilir. Lütfen bu tahlilin BN PAGE'den sonra gerçekleştirilemeyeceğini unutmayın.
      2. > 3 dakika boyunca hafifçe çalkalandıktan sonra (külbütör) mavi bantların gelişimini takip edin.
      3. Jeli 10-20 mL asetik asit solüsyonu içinde sabitleyin veya reaksiyonu durdurmak için 5 mM Tris, pH 7.4 içinde yıkayın. Dokümantasyon için fotoğraf çekin (Malzeme Tablosuna bakın).
  2. Cx-V tahlili
    NOT: Cx-V tahlili, Cx-V-bağımsız aktivitesini göstermek için bir tanesi 5 ug / mL oligomisin (bir Cx-V inhibitörü) ile inkübe edildiğinde, kopya CN veya BN jelleri kullanılarak yapılmalıdır.
    1. Hazırlık.
      1. 35 mM Tris ve 270 mM glisin ile bir deney tamponu hazırlayın; Oda sıcaklığında pH'ı 8.3'e ayarlayın. Tamponu 50 mL'lik alikotlar halinde dondurulmuş olarak saklayın, ancak dondurarak ve çözdükten sonra pH değerini kontrol edin.
      2. H20'da 1 M MgS04 hazırlayın; Kullanıma kadar 4 ° C'de saklayın.
      3. 27.28 mg Pb (NO3) 2'yi bir mikro tüpe koyun.
      4. 60 mg ATP'yi bir mikro tüpe girin.
      5. 1 mg o çözünür1 mL etanol içindeki ligomisin. Kullanıma kadar -20 ° C'de saklayın.
      6. 50 mL metanol 50 mL H20 ile karıştırılarak bir fiksatif hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
    2. Tahlil gerçekleştiriliyor.
      1. 10-20 mL tahlil tamponu ± 5 μg / mL oligomisin (50-100 uL 1 mg / ml oligomisin) içerisinde hafifçe çalkalamayla (rocker) 2 saat boyunca bir BN veya CN jelden bir jel, şerit veya ilgi alanı inkübe edin, ML etanol) oda sıcaklığında ilave edildi.
      2. İnkübasyondan sonra, tamponu 14 mL taze tayin tamponu ile değiştirin ve sırayla, 190 uL 1 M MgS04 (14 mM), 27.28 mg Pb (NO3) 2 (5 mM), 60 mg ATP 8 mM) ve 75 uL oligomisin (gerekirse).
      3. Oligomisin ile muamele edilmiş jellerin üzerindeki bantlar Cx-V'ye bağlı olmayan bantlar verecekleri için yumuşak bir ajitasyonla (rocker) kuluçkaya yatın ve beyaz bir çökelti için izleyin.
        NOT: Çökeltinin görünümü birkaç saat sürebilir.
      4. Jeli metanol-( Örn., % 50 metanol), çünkü asidik çözeltiler kurşun çökeltisini çözer. Sonuçları fotoğraflayın.
        NOT: Kurşun çökeltisi, jellerin Coomassie boyanmasına müdahale etmez.

3. Nitro Selüloz veya Poliviniliden Difluorid (PVDF) Membranlara Protein Transferi

  1. 25 mM Tris ve 200 mM glisin'den bir transfer tamponu hazırlayın. PH'ı 8.3'e ayarlayın ve 0.0005 g / L SDS ve 200 mL / L metanol ekleyin. Oda sıcaklığında saklayın.
    1. Bir nitroselüloz veya PVDF zarı (gözenek boyutu: 0.45 μm) jiletin biraz daha büyük bir tıraş bıçağı veya makasla kesin.
      NOT: Nitro selüloz zarlar Ponceau S boyamasının protein yüklemesini değerlendirmesine izin verirken, PVDF zarları daha keskin tanımlanmış bantlar üretir.
  2. Protokol.
    1. Nitroselüloz zar, filtre kağıdı ve süngerleri birTransfer tamponunda en az 10 dakika. PVDF zarını 15 saniye süreyle% 100 metanolde veya üretici önerisine göre aktarım tamponuna yerleştirmeden önce yerleştirin. Transfer kitinin açık kasetini, transfer tamponu bulunan düz bir kaseye yerleştirin.
    2. Kasetin arka tarafına sünger ve 1-2 kat filtre kağıdı yerleştirin. Kabarcıkları çıkarın.
    3. Jeli filtre kağıdına yerleştirin. Jelin ve / veya zarı bir köşesinden kırparak jelin yönünü belirtin.
    4. Membranı jelin üzerine yerleştirin. Tüm kabarcıkları çıkarın.
    5. Membran üzerine filtre kağıdı ve sünger koyun. Bu sandviçteki tüm kabarcıkları çıkarın.
    6. Kaseti kapatın ve aktarma kitinin kaset yuvasına yerleştirin.
    7. Proteinleri yaklaşık 12-18 saat boyunca 25 V'de aktarın.

4. Immünoblotting

  1. Hazırlık.
    1. Ponceau Lekesi (500 mL) 25 mLAsetik asit ve 0.5 g Ponceau S'den 475 mL H20'ya; Oda sıcaklığında saklayın (tekrar kullanılabilir).
    2. Tris tamponlu salin (TBS), 200 mM NaCl, 25 mM Tris-Baz ve 2.7 mM KCI ile hazırlanır. PH'ı 8.0'a ayarlayın ve oda sıcaklığında saklayın.
    3. TBS'ye 0.5 mL / L Tween 20 ekleyerek TBS-tween (TBST) hazırlayın; Oda sıcaklığında saklayın.
    4. 5 g süt katığını 100 mL TBST'ye eriterek süt katı / TBST hazırlayın. 4 ° C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
    5. 3 g sığır serum albümini (BSA, fraksiyon V) 100 mL TBST içinde eritilerek BSA / TBST hazırlayın. 4 ° C'de saklayın ve 3 gün içinde kullanın.
  2. Protokol.
    1. Transfer tamamlandığında, aktarılmış tüm proteinleri görselleştirmek için membranı Ponceau S çözeltisine yerleştirin. Membran üzerindeki işaretlerin konumunu kalemle etiketleyin ve Ponceau-S-lekelenmiş membranı fotoğrafla tarayın veya tarayın.
    2. Membranı 3 kez her 10 dakikada bir yıkayınYumuşak bir çalkantı altında.
    3. Memeyi süt katıları / TBST ile 1-2 saat oda sıcaklığında veya yavaşça çalkalamayla soğuk bir odada bir gece boyunca bloke edin.
    4. Membranı yumuşak ajitasyon altında TBST ile 10 dakika boyunca yıkayın.
    5. Hafif ajitasyon altında soğuk odada gece boyunca birincil antikor ile inkübe edin. Antikoru ( örneğin anti-ATP5A için 1: 1000 ve -NDUFB6) BSA / TBST'de seyreltin.
      NOT: Çoğu antikor, gece boyunca inkübe edildiğinde yerli jellerden zarlar üzerinde daha iyi bir sinyal verir.
    6. Membranı yumuşak ajitasyon altında TBST ile 10 dakika boyunca yıkayın.
    7. Oda sıcaklığında en az 60 dakika ikincil antikor ile inkübe ederek yumuşak çalkalamayı sağlayın. Süt katıları / TBST içinde antikoru (1: 5,000 ila 1: 50,000) inceltin.
    8. Membranı oda sıcaklığında 10 dakika 3 kez yıkayın, TBST yumuşak ajitasyonla uygulayın.
    9. Son yıkama sırasında, geliştirilmiş kemolüminesans (ECL) substratını manufa talimatlarına göre hazırlayıncturer.
    10. Memeyi üreticinin talimatları doğrultusunda ECL substratı ile inkübe edin.
    11. ECL alt tabakasının üreticisi tarafından verilen talimatları kullanarak film üzerindeki sinyali algılayın.

5. Elektroelüsyon

  1. Hazırlık.
    1. 25 mM triksin, 3.75 mM imidazol (pH 7.0, 4 ° C) ve 5 mM 6-aminoheksanoik asitten oluşan bir elüsyon tamponu hazırlayın.
      NOT: Harici proteinlerle kontaminasyonu önlemek için elektroöldürücü ve membran kapaklarını tutarken eldiven kullanın.
  2. Elektroeluteri yerli elektroelüsyon için kullanmadan önceki gün, aşağıdakileri gerçekleştirin:
    1. Zar kapakları (kesme: 3.5 kDa) elüsyon tamponunda 60 ° C'de 1 saat süreyle bekletin. Kapakları taze elüsyon tamponuna aktarın ve buzdolabında 12 saat veya daha uzun süre ıslatın.
      NOT: Kesilen bir molekül ağırlığı 3.5 kDa küçük p kaybını önlerIlgi konusu protein kompleksinden kolaylıkla ayrışabilen roteinler.
    2. Elektroeluter modülünü, cam tüpleri, tankı ve kapağı etanol ile iyice yıkayın. Su ile durulayın ve ekipmanın kuru kalmasına izin verin.
  3. Yerli elektroklorizasyonun yapıldığı gün aşağıdakileri yapın.
    1. Kullanılacak her cam borunun altına (buzlu) bir cam hamuru yerleştirin. Gerekirse, cam tüpü elüsyon tamponuna yerleştirin ve cambeyi tüpün içinden altına doğru itin.
    2. Cam tüpünü frit ile birlikte elektrohidrolik düzeninin modülüne itin. Yığın yıkama tamponu ile ıslatın ve cam tüpü yerine kaydırın. Cam tüplerin üstlerinin yaldız bile olmasına dikkat edin.
    3. Boş grometleri durdurucuyla kapatın.
    4. Silikon adaptörün altına ıslak bir zar kapağı yerleştirin ve adaptörü elution buffer ile doldurun. Diyaliz zarının çevresindeki hava kabarcıklarını gidermek için yavaşça adaptördeki tamponu piplayın.
    5. Tamponla dolu adaptörü cam tüpün altına kaydırın. Cam tüpün içindeki hamurda görünen tüm kabarcıkları çıkarın.
    6. Her cam boruyu elüsyon tamponuyla doldurun.
    7. Çıkartılan BN PAGE bantlarını cam tüplere yerleştirin (basamağa 1.2.9.3'e bakın). Büyük parçaları küçük parçalara kesin. Cam tüpün içindeki dolum yüksekliğinin yaklaşık 1 cm olduğundan emin olun.
    8. Tüm modülü depoya yerleştirin.
    9. Depoya yaklaşık 600 mL soğuk yıkama tamponu ekleyin. Diyaliz membranında kabarcıkları önlemek için silikon adaptör kapaklarının tamponda olduğundan emin olun.
    10. Deponun altına bir karıştırma çubuğu yerleştirin.
      NOT: Karıştırma baloncukların diyaliz zarının altına yapışmasını önleyecektir.
    11. Soğuk bir odada proteinleri 350 V'de 4 saat boyunca eleyin.
    12. Elüsyon tamamlandıktan sonra, elektrolüiter modülü tampon deposundan çıkarın ve bir lavaboya veya kaseye yerleştirin.
    13. Bir tıkaç kullanılmışsa, drapeyi çıkarınÜst tampon bölmesinde. Aksi takdirde, tamponu çıkarmak için büyük bir pipet kullanın.
    14. Her bir cam borudan tampon çıkarın ve atın. Silikon adaptörün yerinde kalmasını ve fritin altındaki sıvının rahatsız edilmemesine veya sarsılmamasına dikkat edin.
    15. Silikon adaptörü cam tüpün altındaki membran kapağı ile birlikte dikkatlice çıkarın. Silikon kapağın içeriğini (yaklaşık 400 μL) bir mikrotube içine pipetleyin. Elüsyon tamponundan 200 μL daha ilave edin, silikon kapağı durulayın ve mikro tübün içine ekleyin. Tüm cam tüpler için tekrarlayın.
    16. Membran kapakları tekrar kullanılabilir olduğundan, membran kapaklarını, 0.5 mg / mL sodyum azid içeren yıkama tamponuna yerleştirerek koruyun. Onları soğutun.
      NOT: Eluatın protein konsantrasyonu düşüktür ve bir santrifüj filtre cihazı kullanılarak konsantre edilebilir.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Sonuçlar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal süper kompleksleri görselleştirmek için, farelerden yeni izole edilen mitokondri 17 , 18'de kullanıldı. Mitokondriyal süper kompleksler, bazı araştırmacılar için tolere edilebilir olmasına rağmen tekrar tekrar donma ve çözülme döngülerine duyarlıdır ve parçalanmalarına neden olur. Depolama için dondurma gerekiyorsa, en iyi sonuçların elde edilmesi için numunelerin birden fazla donma ve çözülme döngüsünden geçmemesi ...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Tartışma

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mitokondriyal ATP üretimi için fonksiyonel bir ETC gerekir. ETC kompleksleri, iki tip süper kompleks oluşturabilirler: respirazomlar (Cx-I, -III ve -IV) 1 ve synthasomes (Cx-V) 2 . ETC'nin süper kompleksler halinde düzenlenmesinin, toplam ETC verimliliğini arttırdığı düşünülürken, her bir kompleksin sağlam bir ETC için bir araya getirilmesi gerekiyor 5,22. Bu süper komplekslerin nasıl bir araya gelip parçalarına ayrıldığı iyi anlaşılmamıştır, ancak burada sunulan proto...

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Açıklamalar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği Kurucu Ortaklığı [12GRNT12060233] ve Rochester Üniversitesi'ndeki Güçlü Çocuk Araştırma Merkezi'nden hibeler tarafından desteklendi.

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Malzemeler

Bu makalede kullanılan malzemelerin listesi
AdŞirketKatalog numarasıYorumlar
Protean II mini jel haznesiBiorad1658004Mini jel elektroforezini dökmek ve çalıştırmak için komple set
Protean XL maxi-jelBiorad1653189Maxi-jel elektroforezini dökmek ve çalıştırmak için komple set
Gradyan yapıcı, Hoefer SG15VWR95044-704Dökme mini jel gradyanları
Degrade yapıcı, maxi-jelVWRGM-100Dökme maxi-jel gradyanlar
Transfer kitiBiorad1703930Proteinlerin membranlara ıslak transferi için komple set
Electroeluter model 422Biorad1652976Doğal veya SDS'den proteinlerin elektroelüsyonu SAYFALAR
Cam plakalarBiorad1653308Kısa plakalar
Cam plakalarBiorad1653312Ara plakalar
Cam plakalarBiorad1651823İç plakalar
Cam plakalarBiorad1651824Dış Plakalar
Güç kaynağıBiorad1645070Doğal elektroforez için uygun güç kaynağı
ECL-Western Thermo Scientific32209Chemolumniscense substrat
SuperSignal-West DuraThermo Scientific34075Geliştirilmiş chemolumniscense substrat
Film/otoradyografi filmiGE Sağlık hizmetleri28906845Western lekelerinin dokümantasyonu
Film işlemcisi CP1000AgfaNC0872640
Canon Power Shot 640 CanonNAJelfleri, zarları ve lekeleri belgelemek için fotoğraf çekme.
Canon Power Shot 640 Fotoğraf makinesi siperliği Işıklı bir masada çekilen fotoğraflar içinCanon
Akrilamid/bisakrilamidBiorad1610148%40 önceden karıştırılmış çözelti
GlisinSigmaG7403
SDS (sodyum dodesil sülfat)İnvitrojen15525-017
Tris-baseSigmaT1503Tampon
TrisinSigmaT0377
Sodyum deoksişelatSigmaD66750Deterjan
EDTASigmaE5134
SükrozSigmaS9378
MOPSSigmaM1254Tampon
İmidazolSigmaI15513Tampon
Lauril maltosidSigmaD4641Deterjan
Coomassie G250Biorad161-0406
Aminoheksanoik asitSigmaO7260
Yerli  moleküler ağırlık kitiGE Sağlık 17-0445-01Doğal elektroforez için yüksek moleküler ağırlıklı kalibrasyon kiti.
NameCompanyKatalog NumarasıComments
NADHSigmaN4505
Nitroblue tetrazoliumSigmaN6639
Tris HClSigmaT3253
ATP   SigmaA2383
İsim>CompanyKatalog NumarasıYorumlar
Kurşun(II) nitrat (Pb(NO3)2):Sigma228621
OligomisinSigmaO4876
İsimCompanyKatalog NumarasıComments
Ponceau SSigmaP3504
anti-ATP5AAbcamab14748antikoru ATP sentaz alt birimi ATP5A
anti-NDUFB6Abcamab110244antikoru Cx-1 alt birimi NDUFB6 anti-VDAC'a karşı antikor
VDAC'a Calbiochem529534antikoru
ECL HRP'ye bağlı antikorGE Health CareNA931V, ATP5A, NDUFB6 ve VDAC'ye ikincil antikor
Bloke edici reaktifBiorad170-6404
BSA
sodyum klorürSigmaS9888
potasyum klorürSigmaP9541
EGTASigmaE3889
NameCompanyKatalog Numarası<strong>Comments
Silver boyama KitiInvitrogenLC6070
koruyucu kamera

Kaynaklar

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lenaz, G., Genova, M. L. Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation. Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).
  2. Saks, V., et al. Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells. J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).
  3. Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis. Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).
  4. Wittig, I., Schagger, H. Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions. Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).
  5. Genova, M. L., Lenaz, G. Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes. Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).
  6. Hahn, A., et al. Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology. Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).
  7. Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane. EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).
  8. Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes. PloS one. 9 (11), e113330(2014).
  9. Genova, M. L., Lenaz, G. The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging. Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).
  10. Rosca, M. G., et al. Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation. Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).
  11. Kuter, K., et al. Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease. Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).
  12. Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes. Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).
  13. Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates. J Vis Exp. (48), (2011).
  14. Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. Respiratory active mitochondrial supercomplexes. Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).
  15. Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III. Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).
  16. Giorgio, V., et al. Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).
  17. Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria. J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).
  18. Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia. Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).
  19. Schagger, H. Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria. Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).
  20. Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1. EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).
  21. Schafer, E., et al. Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes. J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).
  22. Wittig, I., Schagger, H. Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes. Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).
  23. Davies, K. M., et al. Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria. Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).
  24. Lapuente-Brun, E., et al. Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain. Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).
  25. Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis. J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).
  26. Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines. Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).
  27. Glancy, B., Balaban, R. S. Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria. Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).
  28. Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints. Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).
  29. Alavian, K. N., et al. An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore. Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).
  30. Chance, B., Williams, G. R. Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain. J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).
  31. Zickermann, V., et al. Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I. Science. 347 (6217), 44-49 (2015).
  32. Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. Structure of mammalian respiratory complex I. Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).

Erişim kısıtlı. Bu içeriği görüntülemek için lütfen giriş yapın veya deneme sürümünü başlatın.

Yeniden basım ve izinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya şekillerini yeniden kullanmak için izin iste

İzin iste

Etiketler

Mitochondrial SupercomplexesBlue Native PAGEImmunoblottingProtein Complex AssemblyMitochondrial BiologyMitochondrial Isolation

İlgili makaleler