JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Genetics

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

Published: June 06, 2017
doi:
10.3791/55745
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
, ,
1Department of Cell Biology and Histology,University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology,University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease,University of Zurich

Summary

Hücre döngüsünün belirli evreleriyle ilgili olayları incelemek için bir bağlam sağlayan iki hücre senkronizasyon protokolünü bildiriyoruz. Bu yaklaşımın, pertürbüssüz bir hücre döngüsünde spesifik genlerin düzenlenişini analiz etmek için veya hücre döngüsünü etkileyen maddelere maruz kaldığında yararlı olduğunu göstermektedir.

Abstract

Hücre döngüsünün gen ekspresyon programı, hücre döngüsüne bağımlı süreçleri ve kanser gibi hastalıklarda rollerini anlamak için kritik bir aşamayı temsil eder. Hücre döngüsü düzenleyen gen ekspresyon analizi, belirli fazlara hücre senkronizasyonuna bağlıdır. Burada, hücre döngüsü boyunca gen ifadesinin periyodik değişimini incelemek için yaygın olarak kullanılan iki tamamlayıcı senkronizasyon protokolünü kullanan bir yöntemi açıklıyoruz. Her iki prosedür, tanımlanmış bir noktada hücre döngüsünün geçici olarak bloke edilmesine dayanır. Hidroksiüre (HU) muamelesiyle senkronizasyon protokolü geç G1 / erken S evresinde hücrenin durması ve HU aracılıklı tutuklamadan salınma, S ve G2 / M boyunca düzgün bir şekilde ilerleyen hücresel bir nüfusu sağlar. Timidin ve nokodazol (Thy-Noc) tedavisinin erken mitozda hücreleri bloke ettiği ve Thy-Noc aracılı arrestten salındığı senkronizasyon protokolü, G1 fazı ve S fazı için uygun senkronize edilmiş bir hücre popülasyonu sağlarÇalıştırmayı deneyin. Her iki prosedürün uygulanması, tipik olarak, hücrelerin propidyum iyodür (PI) boyaması ve akış sitometrisinin aracılık ettiği DNA içeriğinin analizinden sonra gerçekleştirilen hücre döngüsü dağıtım profillerinin izlenmesini gerektirir. İki senkronizasyon protokolünün kombine kullanımının, hücre döngüsünde ( örn. E2F1 ve E2F7) farklı şekilde regüle edilen genlerin transkripsiyonel profillerini açıkça belirlemek ve sonuç olarak hücre döngüsündeki rollerini daha iyi anlamak için sağlam bir yaklaşım olduğunu gösteriyoruz süreçler. Ayrıca, bu yaklaşımın, ilaç kökenli terapileri ( yani , bir anti-kanser ajanı olan mitomisin C) altında yatan mekanizmaların incelenmesi için yararlı olduğunu göstermekteyiz, çünkü genotoksik ajana yanıt veren genleri hücre döngüsünün bozulmalarından etkilenen genlerden ayırt etmeye imkan tanır Aracı tarafından dayatılan.

Introduction

Hücre döngüsünün tüm aşamalarına geçiş, sıkı düzenlenen bir gen ifade programı ile birleştirilir. Hücre döngüsü boyunca gen transkripsiyonunun "açık ve kapalı" koordine edilmesinin, kompleks transkripsiyon düzenleyici sistemlerin kontrolü altında olduğuna, sadece zamanlamayı değil aynı zamanda gen ifadesinin seviyelerini de düzenlediğine inanılmaktadır. Anahtar hücre döngüsü bileşenlerinin düzenlenmesinin çeşitli hastalıkların gelişimine katkıda bulunduğu bilinmektedir ve bu, tümörojenezin iyi bilinen bir özelliktir 1 , 2 . Maya ve memeli hücrelerinde gerçekleştirilen genom çapındaki transkriptomik analizler, çok sayıda genin hücre döngüsünde periyodik gen ekspresyonu modelleri sergilediğini ortaya koymuştur; bu, hücre döngüsü boyunca transkripsiyonel dalgalanmanın, belirli bir gen ürününün zamansal gereksiniminin bir yansıması olduğunu düşündürmektedir Kesin bir fazda 3 , 4 , </suP> 5 .

Hücre döngüsü düzenleyen gen ekspresyonu çalışmasında önemli bir görev, hücrelerin spesifik hücre döngüsü fazlarına senkronize edilmesidir. Hücre senkronizasyonu, bir gen ekspresyon modelinin belirli bir hücre döngüsü faz geçişine ilişkisini yorumlamaya yardımcı olur ve birçok genin düzenlenmesi ve işlevinin daha iyi anlaşılmasına yol açmıştır. Hücre senkronizasyonu, kemoterapötik ajanların hem gen ekspresyonunu hem de hücre döngüsü kinetiğini etkilediği için antikanser ilaçların etki mekanizmasını incelemek için de önemlidir 6 , 7 . Bununla birlikte, bu ajanlarla yapılan tedaviden kaynaklanan gen ekspresyon farklarının tedaviye doğrudan müdahale olup olmadığının veya sadece hücre döngüsü profillerinde meydana gelen değişimlerin sonucunun olup olmadığının belirlenmesi genellikle zordur. Bu olasılıkları birbirinden ayırmak için, gen ekspresyonu,Kemoterapötik ilacın ilavesinden önce senkronize edilmedi.

G08'de senkronize edilen homojen bir hücre popülasyonu oluşturan taze izole edilmiş lenfoid hücreler gibi bazı birincil hücreler dışında, in vitro olarak belirlenen hücre hatları kültürde eşzamansız olarak büyür. Normal büyüme koşulları altında, bu eşzamansız döngülü hücreler, hücre döngüsünün her aşamasında, ancak tercihen G1 9'da bulunur . Dolayısıyla, bu bağlam belirli bir hücre döngüsü fazında ( örn. G1, S vb.) Fonksiyonel veya gen ekspresyon analizleri için optimal bir senaryo sağlamamaktadır. Dönüştürülmemiş ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri ( örneğin fibroblastlar), fizyolojik yöntemlerle senkronize edilebilir10. Bu yöntemler, bisiklet sürmeye devam etmek için, hücre teması inhibisyonu ve büyüme faktörü bağımlılığı gibi dönüştürülmemiş hücrelerin tutulan birincil hücre özelliklerine dayanır. uzaklaştırmaTemas inhibisyonu ile kombinasyon halinde, G0 / G1'de tutulan transforme edilmemiş hücreler oluşturmaktadır. Bununla birlikte, senkronize hücre döngüsü girişi ve ilerlemesi, genellikle, hücrelerin yapay olarak ayrılması ve yeniden kaplama 10'u içeren alt-kültürü gerektirir. En önemlisi, bu yöntem, halihazırda kullanımda olan ve hücre kontak aracılı büyüme inhibisyonu ya da büyüme faktörü geri çekilmesine tepki bulunmayan karakterize edilen transforme edilmiş hücre hatlarının senkronizasyonu için uygun değildir. Böylece, hücre döngüsünün spesifik evrelerinde etkin hücre senkronizasyonu için alternatif yöntemlerin gerekli olduğu açıktır. Genel olarak, en sık kullanılan senkronizasyon yöntemleri, tipik olarak DNA sentezi veya mitotik iğ oluşumu gibi hücre döngüsünün tanımlanmış bir noktasının geçici kimyasal veya farmakolojik inhibisyonuna dayanır. DNA sentezinin engellenmesi, onları geç G1 veya erken S evresinde tutarak hücreleri senkronize eder. Bu olabilir achiBir nükleotid biyosentezi 11,12, afidikolin, DNA polimeraz 13 , 14 inhibitörü, hidroksiüre, ribonükleotid redüktaz 15 , 16'nın bir inhibitörü veya fazla miktarlarda timidin 17,18 ile imünosin gibi bileşiklerin ilavesi ile ortaya çıkar. Öte yandan, kolşisin ya da nokodazol gibi mikrotübül polimerizasyonu önleyicileri, M evresi 19 , 20 , 21'in erken evrelerinde hücre senkronizasyonuna yol açan mitotik iğ oluşumunu bloke edebilir.

Bu çalışmada mRNA'da hücre döngüsü düzenleyen genlerin ekspresyonunu incelemek için geçici kimyasal inhibisyona dayalı iki tamamlayıcı senkronizasyon protokolünü içeren bir yöntemi açıkladıkseviyesi. Bu yöntem, belirli hücre döngüsü süreçlerinde hücre döngüsü genlerinin rolünün tanımlanması için temel önemdedir. Ayrıca, ilaçla tepki veren genleri doğru bir şekilde saptamak ve bu ilaçlar tarafından üretilen hücre döngüsü ilerlemesindeki pertürbasyonlardan kaynaklanan yanlış yorumlamaları en aza indirgemek için antikanser tedavilerinin etkisini incelemek için genel bir çerçeve sağlar.

Protocol

1. Hücresel Senkronizasyon, Hücre Döngüsü Progresyonunun Yayımı ve İzlenmesi Timidin ve nokodazol esaslı (Thy-Noc) senkronizasyon ve Mitozdan U2OS hücrelerinin salınımı Gerekli hücre kültürü ortamı hazırlayın. U2OS hücreleri,% 10 (hac / hac) FBS ile tamamlanan DMEM-Glutamine ortamında rastgele büyütülür (isteğe bağlı olarak:% 1 penisilin / streptomisin). Tüm orta hazırlama ve manipülasyonu steril koşullar altında gerçekleştirin ve tamamlanıp hazırlanan ortamı (bundan böyle "eksiksiz ortam" olarak anılacaktır), kullanımdan önce 37 ° C'ye ısıtın. Tohum 10 ml komple kültür ortamında 100 mm çanak başına 2 x 10 6 U2OS hücreleri. Gerekli bulaşıkların sayısını hesaplamak için, her bir 100 mm'lik çanağın tipik olarak, 6 oyuklu bir plakanın yaklaşık 5 kuyucuğunu (0.2-0.25 x 10 6 hücre / oyuk) yeniden plaklamak için yeterli mitotik hücre sağladığını göz önünde bulundurun (bkz. Şekil 1B ). Seçilen zaman noktası başına iki kuyu requir(RNA ekstraksiyonu için 1, hücre döngüsü izlemesi için 1 kuyu). Ek olarak, protein analizi için zaman noktası başına üçüncü bir kuyu toplanabilir. NOT: Akşamları (yaklaşık 19:00) hücreleri plakalayın, böylece müteakip adımlar ertesi gün çalışma saatlerinde yapılabilir. FACS analiz kompanzasyonu ayarlarını tanımlamak için eşzamansız büyüyen hücrelerin 2 kuyucuğunu ekleyin. 100 mm yemekleri 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 24 saat inkübe ederek hücreleri 24 saat süreyle tutturun. Timidin bloğu için, 145.2 mg timidin tozunu 3 mL H20 (veya eşdeğer miktarda) eriterek 200 mM timidin stok solüsyonu hazırlayın ve solüsyonu, 0.2 um gözenekli bir filtreden süzerek sterilize edin. Hafif ısınma, timidin eritilmesine yardımcı olabilir. Her 100 mm kültür çanağına (nihai konsantrasyon 2 mM) yeni hazırlanmış 200 mM stoktan 100 uL ekleyin. Hücreleri timidin ile 20 saat 37 ° C'de inkübe edin76 ° C'de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde. NOT: Ertesi gün, timidin salınımını ve nokodazol blokunu gerçekleştirmek için vakit geçirmek için akşamları hücreleri (akşam 7'de) tedavi edin. Timidin bloğundan salınmak için ertesi gün öğleden sonra (3 pm) timidin içeren büyüme ortamını çıkarın; Hücreleri önceden ısıtılmış 1x PBS ile iki kez yıkayın ve her 100 mm çanağa 10 mL komple ortam ekleyin. Hücreleri 37 ° C'de 5% CO 2 ile nemli bir atmosferde inkübe edin. Mitotik hücre tutuklaması için, 50 ng / mL (8 pm) nihai konsantrasyona kadar nocodazole ekleyin. Nokodazol tozunu DMSO'ya ( örn. 5 mg / mL) eriterek stok solüsyonu hazırlayın ve -20 ° C'de dondurarak saklayın. % 5 CO 2 ile nemli bir atmosferde 37 ° C'de nukodazol ile hücreleri en az 10 – 11 saat inkübe edin. N evresindeki nokodazol aracılı tutuklamadan (mitotik salınma) serbest kalma ve numunelerin bir kaç saat poi'den toplanmasıNts (saat 06: 00'da başlayarak). Her plakayı sallayarak yuvarlak (mitoz) hücreleri ayırın ve nocodazole içeren büyüme ortamı nazikçe pipetle verin. Her bir 100 mm plakadan 50 mL steril tüplere ayrılan hücrelerle toplayın, santrifüjleyin (300 xg, 5 dakika, oda sıcaklığı (RT)) ve santrifüj ile takiben 1x PBS ekleyerek hücreleri iki kez yıkayın. Mitotik kaymanın önlenmesi için soğuk PBS veya PBS artı nokodazol kullanılması önerilir (bkz. Tartışma bölümü). Her bir 100 mm'lik plaktan toplanan mitotik hücreleri 10 mL komple ortamda tekrar süspanse edin. RNA ekstraksiyonu için 2 mL ve 0 saat zaman noktası için FACS analizi için 2 mL (örnek başına yaklaşık 0.2-0.25 x 106 hücre) kaydedin. 6 oyuklu plakalarda (2 mL / çukur, 0.2-0.25 x 10 6 hücre / çukur) sonraki zaman noktaları için geriye kalan mitotik hücreleri yeniden plaka haline getirin. NOT: Seçilen zaman noktası başına 2 oyuk bulunduğunu unutmayın (RNA için 1, FACS analizi için 1). Örnekleri toplamaZaman noktaları. Hücre döngüsü ilerlemesinin yeterli bir profilini elde etmek için her 1,5 ila 3 saat önerilir. RNA ekstraksiyonu için, ortamı çıkarın, 2 mL önceden ısıtılmış 1x PBS ile iyice durulayın ve 1 mL uygun RNA izolasyon reaktifinin ( örn. TRIzol) kuyuya koyun (kimyasallar için bir güvenlik kabinindeki son adımı yapın). Plaka yukarı ve aşağı ayırın ve lizoz hücreleri, hücre lizatını 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın, RT'de 5 dakika inkübe edin ve sonraki kullanıma kadar -80 ° C'de tüp saklayın. FACS analizi için, 2 mL ön ısıtma 1x PBS ile iyice durulayın, hücreleri ayırmak için önceden ısıtılmış Trypsin-EDTA solüsyonu (0.3 mL / kuyu) ekleyin, 1 mL komple ortam ilave ederek tripsin-EDTA'yı bloke edin ve her numuneyi ayrı bir 15 mL tüp. Hücreleri (300 xg, 5 dakika, RT) santrifüjleyin, hücresel pelet kaydedin ve süpernatant atın. Hücreleri düzeltmek için yavaşça vorteksleyen tüplerle 1x PBS içinde soğutulmuş 70% (v / v) etanolün 1 mL'sindeki hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve uygulama için buz üzerine yerleştirin4 ° C'de depolamadan yaklaşık 15 dakika önce veya FACS ile daha ileri analiz için boyama (adım 1.4 – 1.5'de tarif edildiği gibi). HU tabanlı senkronizasyon ve U1OS hücrelerinin G1 / S sınırından çıkarılması Adım 1.1'de tarif edildiği gibi komple hücre kültürü ortamı hazırlayın. 6 oyuklu plakalarda oyuk başına 0.25 x 10 6 U2OS hücresi (oyuk başına 2 mL eksiksiz kültür ortamı). Deney için gerekli kuyuların sayısını hesaplamak için, seçilen zaman noktasına (kuyucuğa RNA ekstraksiyonu için 1, hücre döngüsü izlemesi için 1 kuyucuk) 2 oyuk gerekeceğini ve eşzamansız olarak büyümekte olan hücrelerin 2 kuyusunun FACS analiz kompanzasyonu ayarlarını tanımlamak gerekiyordu. 6-kuyucuklu plakaları gece boyunca (O / N) 37 ° C'de% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde kuluçka ederek hücreleri bağlayın. Ertesi sabah kuyulardan komple ortamı çıkarın ve 2 mLBaşına önceden ısıtılan FBS içermeyen DMEM-Glutamine ortamı. 37 ° C'de,% 5 CO2 ile nemli bir atmosferde 24 saat daha inkübe edin. NOT: Bu adımı 2 dışındaki bütün kuyularda yapın (FACS ayarlarını tanımlamak için kaydedilenler). Hücrelerin basitçe HU ile inkübe edilmesiyle etkin senkronizasyon sağlandıysa, serum geri çekme basamağı atlanabilir. H1 ile G1 / S hücre döngüsü tutuklanması. Her kullanımdan önce taze HU stok solüsyonu (500 mM) hazırlayın. 76.06 mg HU tozuna 2 mL H20 ilave edin ve iyice çözünene kadar karıştırın. Çözeltiyi, 0.2 um gözenekli bir filtreden süzerek sterilize edin. 4 mM son HU konsantrasyonu için filtre ile sterilize edilmiş HU stok solüsyonu 400 mcL olan komple ortamın 50 mL'si karıştırın. FACS ayarlarını tanımlamak için gerekli olan 2 kuyudan hariç tüm kuyucuklardan ortamı çıkarın ve yeni hazırlanmış 4 mM HU ihtiva eden komple ortam (2 mL / çukur) ile değiştirin. Hücreleri 24 saat inkübe edin.HU içeren ortamı 37 ° C'de% 5 CO 2 ile nemli ortamda kurutun. HU aracılıklı tutuklamadan hücrelerin salınımı. HU içeren ortamı çukurlardan çıkarın ve önceden ısıtılmış 1x PBS (her seferinde 2 mL) ile çukurları iki kez durulayın. Kuyu başına 2 mL komple ortam ekleyin. 0 saat nokta için (RNA ekstraksiyonu için 1, FACS tarafından hücre döngüsü tutuklama doğrulaması için 1) yanı sıra FACS ayarları için kaydedilen 2 örnek için 2 numune toplayın. Kalan kuyuları kuluçka odasına yerleştirin. Hücre döngüsü ilerlemesinin yeterli bir dağılımını elde etmek için her 1.5 ila 3 saatte bir örnekleri toplayın. Her zaman noktasında, 1.1.8.1-1.1.8.2'de açıklandığı gibi örnek işleme (RNA ekstraksiyonu ve FACS analizi için) uygulayın. DNA hasar ajanları ile tedavi NOT: Amaç, bir bileşiğin ( örneğin DNA'ya zarar veren ajanlar) hücre döngüsü olaylarındaki etkisini aydınlatmak olduğunda, daha önce tarif edilen senkronizasyon yöntemlerinden herhangi biriHücrelerin genotoksik ajan ile tedavisi ile kombine edilmiştir. Senkronizasyon yöntemini seçmek için, analiz etmek istediğiniz hücre döngüsünün evresini düşünmek önemlidir. Genel olarak Thy-Noc prosedürü, bir bileşiğin G1 fazı veya S fazı girişindeki etkisini incelemek için uygun olabilirken, HU aracılıklı senkronizasyon, S ila G2 fazlarındaki etkiyi incelemek veya mitoz girişinde daha uygun olabilir. Genotoksik ajanların G1 fazı veya S fazı girişindeki etkisinin analizi Hücreleri 1.1.2'de açıklandığı gibi senkronize edin. 1.1.6'ya. Nocodazole'den hücreleri serbest bırakın ve 1.1.7'de tarif edildiği gibi yeniden plakaya yerleştirin. Nemlendirilmiş bir atmosferde 37 ° C'de% 5 CO 2 ile 3 saat inkübe edin ve ajan ilavesinden önce ekleyin (gerekli inkübasyon süresi hücre hattına bağlı olarak değişebilir). Madde 1.1.8'de anlatıldığı gibi ajan ekleyin ve örnekleri toplayın. SG'de genotoksik ajanların etkisinin analizi2 faz veya M girişi Hücreleri 1.2.2'de açıklandığı gibi senkronize edin. 1.2.5'e. 1.2.6'da açıklandığı gibi HU'dan hücreleri serbest bırakın. Ve ajan hemen ekleyin. Daha önce 1.8'de açıklanan şekilde örnekleri toplayın. Propidyum iyodür (PI) boyama ve FACS analizi ile hücre döngüsü boyunca hücre senkronizasyonu ve ilerlemesinin izlenmesi NOT: FACS ayarlarını tanımlamak için gerekli olanlarla birlikte tüm zaman noktalarında toplanan numuneler, düzeltildikten sonra 4 ° C'de saklanabilir (1.1.8.2'de belirtildiği gibi). Aynı anda deneyin tüm numuneleri için PI çözeltisi ile lekelenmeyi ve bunu takiben FACS analizi uygulayın. PI, 600 nm civarında geniş bir emisyon pikiyle 535 nm'de uyarıldığında yüksek derecede floresan bir sinyal üreten çift sarmallı DNA'nın ana oluk içine interkale yapar. PI, aynı zamanda çift sarmallı RNA'ya bağlanabildiğinden optimal DNA çözünürlüğü için hücreleri RNaz ile tedavi etmek gerekir. Yeni yapılmış PI boyama özümü hazırlayın. PI stok solüsyonu PI tozu PBS'de ( örn. 5 mg / mL) çözülerek hazırlanabilir. Stok solüsyonunu 4 ° C'de (karanlıkta) saklayın. Boyama çözeltisi PI (140 uM), sodyum sitrat (38 mM) ve Triton X-100 (% 0.01 v / v) içerir. Uygun bir yüzeyi ( örn. Fırın) 37 ° C'ye ısıtın. Sabit hücreleri (450 xg, 5 dak, RT), çökelti süpernatant (etanol) santrifüjleyin ve 1x PBS ile bir kez yıkayın. Hücreleri tekrar santrifüjleyin, PBS'yi çıkarın ve numune başına 300 pL PI boyama çözeltisi ekleyin (FACS ayarları için örneklerden biri hariç, bunun yerine bu örneği PBS ekleyin). Hücreleri FACS Tüplerine aktarın (5 mL yuvarlak tabanlı polistren tüpleri). Her bir numuneye 1 uL RNaz A ekleyin, 37 ° C'de karanlıkta 30 dakika boyunca numuneleri karıştırın ve inkübe edin. Numuneler 4 ° C'de ışığa karşı maksimum 2 – 3 gün saklanabilir. Akışa göre örneklerdeki DNA içeriğini analiz etmesitometrisi. FACS analiz kompanzasyonu ayarlarını PI boyalı asenkron numune ile tanımlayın. Otofloresansı kontrol etmek için boş örnek (PI boyama çözümü olmadan) kullanın. Akış sitometrisi ile DNA içeriğinin PI boyama aracılı analizinin temelleri daha önce anlatılmıştır 9 . Çift fosfo-H3 (Ser 10) / PI boyama ile mitotik indeksin belirlenmesi NOT: Mitozdan geçen hücreler, Serin 10'da (pH3) fosfo-histon H3'e spesifik antikorlar ile akış sitometrisi ile kolayca tespit edilebilir. Birbirine eşlik eden PI boyaması hücre popülasyonunun DNA içeriğine dayalı dağılımını belirlemek için yararlıdır. FACS ayarlarının en uygun konfigürasyonları için 5 numune gereklidir: boş, yalnızca PI-sadece pH-3, ikincil antikor-only ve çift boyama. Sabit hücreleri (450 xg, 5 dakika, 4 ° C) santrifüjleyin ve süpernatantı atın. Aşağıdaki adımlar, 15 mL'lik tüplerde boyamanın gerçekleştirilmesi için tanımlanmıştır. Hücreleri 1Pellet ve santrifüjde (450 xg, 5 dakika, 4 ° C) bir mL PBS-T (PBS +% 0.05 Tween-20) ilave edin. Süpernatanı alın. 100-200 μL PBS-T +% 3 BSA içinde seyreltilmiş (1: 500) anti-pH3 antikoru ilave edin ve oda sıcaklığında 2 saat boyunca sallanan ile inkübe edin (veya 4 ° C'de O / N). 2 mL PBS-T (PBS +% 0.05 Tween-20) ve santrifüj (450 xg, 5 dakika, 4 ° C) ekleyin. Süpernatanı alın. Pelet içine 2 mL PBS-T ekleyerek bir kez daha yıkayın, santrifüjleyin ve süpernatantı atın. 100-200 μL PBS-T +% 3 BSA içerisinde seyreltilmiş (1: 500) ikincil antikor (seçilen pH3 antikoru için anti-tavşan AlexaFluor 488) ilave edin ve oda sıcaklığında 1 saat süreyle sallanan kuluçkaya yatırın 4 ° C'de). Örnekleri ışığa karşı koruyun. Adım 1.5.4'te tarif edildiği gibi santrifüjleme ile iki kez PBS-T (2 mL) ile yıkayın. Tarif edilen şekilde PI boyanmasını yapın (basamaklar 1.4.1 ila 1.4.6). 2. Gen Ekspresyon Analizi için Örnek Toplama ve İşleme almak1.5 mL'lik mikrosantrifüj numunelerini, RNA izolasyon reaktifini dondurucudan çıkarın ve kimyasallar için bir emniyet dolabı içerisinde oda sıcaklığında çözdürün. Her bir numuneye 400 μL kloroform ekleyin ve karıştırma tamamlanıncaya kadar kuvvetli bir şekilde sallayın (ancak vorteks kullanmayın). Numuneleri oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Tezgah üstü bir mikrosantrifüjde 15 dakika tüpleri (≥8,000 xg, 4 ° C) santrifüjleyin. Sulu (üst) fazı yeni bir 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve aktarılan hacmi kaydedin (prosedürü basitleştirmek için deneyin tüm numunelerinde eşit hacimlerin toplanması önerilir). Karıştırırken yavaş yavaş sulu faza (damla damla) 1 hacim% 100 etanol ilave edin. Santrifüj etmeyin. Ticari RNA mini hazırlık seti ile bir sonraki adımları gerçekleştirin. Oluşmuş olabilecek herhangi bir çökelti de dahil olmak üzere, her numuneden 700 μL'ye kadar bir pik ekleyin (üretici tarafından sağlanan) 2 mL'lik bir toplama tüpünde bir döner kolona yerleştirilir. KapatKapak ve santrifüj (≥ 8,000 g, RT) 15 s. Akışı atın. Kalan numuneyle (varsa) önceki adımları tekrarlayın. RNA yıkama ve elüsyon için üreticilerin talimatlarını uygulayın (bir sonraki adım için uygun bir RNA konsantrasyonu elde etmek için her bir örneği 30 – 40 μl nükleaz içermeyen H20 ile elüe edin). Absorpsiyon ölçümleri ile örneklerin RNA konsantrasyonunu ve saflığını belirleyin ( 2.0-2.1 A 260/280 oranı, RNA örneğinin iyi saflığını gösterir). RT-qPCR analizi için kullanılacak kadar RNA örnekleri -80 ° C'de saklayın. RNA'ya cDNA'ya dönüştürmek ve ardından niceliksel PCR için örnek başına 1 μg RNA alın ve imalatçıların talimatlarına göre retrotranscriptase reaksiyonu hazırlayın. Elde edilen cDNA örnekleri 4 ° C'de (birkaç gün için) veya -20 ° C'de (daha uzun süreyle) saklanabilir. NOT: Örnek hazırlama, primer tasarımı ve gerçek zamanlı PCR için diğer hususlar eski olmuşturLiteratürde yoğun bir şekilde anlatılmıştır 22,23.

Representative Results

Hücre senkronizasyonu için Thy-Noc ve HU tabanlı protokollerin şematik gösterimi. Şekil 1 , hücre döngüsü boyunca ilerlemeyi doğrulamak ve gen ekspresyon analizleri gerçekleştirmek için U2OS hücre senkronizasyonu ve takip eden örnek toplanması için gerekli olan aşamaları özetlemektedir. Phospho-H3 ve PI boyama, senkronizasyon yönteml…

Discussion

Hücre döngüsünde geçici ve spesifik rollerde bulunan ince ayarlı regüle genlerin analizi, hücre popülasyonunun düzgünlüğünü gerektirir. Birçok araştırmacı, bu amaçlar için uzun süredir kurulmuş tümör hücresi çizgileri rutin olarak kullanmaktadır ve belirli hücre döngüsü evrelerinde mümkün olduğunca çok hücre biriktirmek amacıyla senkron (veya kısmen senkron) hücre popülasyonları elde etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Dahası, iyi kurulmuş senkronizasyon yakla…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yararlı tartışmalar ve teknik destek için Zubiaga ve Altmeyer laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, İspanyol Bakanlığından (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), Bask Hükümeti'nden (IT634-13 ve KK-2015/89) ve Bask Ülkesi UPV / EHU Üniversitesinden hibelerle desteklendi UFI11 / 20).

Materials

DMEM, high glucose, GutaMAX supplement Thermo Fisher Scientific 61965-059
FBS, qualified, E.U.-approved, South America origin Thermo Fisher Scientific 10270-106
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Thermo Fisher Scientific 15140-122
0.25% Trypsin-EDTA (1X), phenol red Thermo Fisher Scientific 25200-072
Thymidine SIGMA T1895-5G Freshly prepared. Slight warming might help dissolve thymidine.
Nocodazole SIGMA M-1404 Stock solution in DMSO stored at -20 ºC in small aliquots
Hydroxyurea SIGMA H8627 Freshly prepared
Mitomycin C from Streptomyces caespitosus SIGMA M4287 1.5mM stock solution in sterile H2O protected from light and stored at 4ºC
Dimethyl sulfoxide SIGMA D2650
Propidium iodide SIGMA P4170 Stock solution in sterile PBS at 5 mg/ml, stored at 4º C protected from light.
PBS pH 7.6 Home made
Ethanol PANREAC A3678,2500
Chloroform SIGMA C2432
Sodium Citrate PANREAC 131655
Triton X-100 SIGMA T8787
RNAse A Thermo Fisher Scientific EN0531
TRIzol Reagent LifeTechnologies 15596018
RNeasy Mini kit QIAGEN 74106
High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Thermo Fisher Scientific 4368814
Anti-Cyclin E1 antibody Cell Signaling 4129 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-Cyclin B1 antibody Cell Signaling 4135 1:1000 dilution in 5% milk, o/n, 4 ºC
Anti-β-actin SIGMA A-5441 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antiboty Millipore 06-570 Specified in the protocol
Secondary anti-rabbit AlexaFluor 488 antibody Invitrogen R37116 Specified in the protocol
Secondary anti-mouse-HRP antibody Santa Cruz Biotechnology sc-3697 1:3000 dilution in 5 % milk, 1 hr, RT
Forward E2F1 antibody (human)                    TGACATCACCAACGTCCTTGA Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F1 antibody (human)                    CTGTGCGAGGTCCTGGGTC Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward E2F7 antibody (human)                    GGAAAGGCAACAGCAAACTCT Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse E2F7 antibody (human)                    TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGA Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward p21Cip1 antibody (human)                    AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse p21Cip1 antibody (human)                    TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward TBP antibody (human) reference gene                     Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse TBP antibody (human)                     Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Forward Oxa1L antibody (human) reference gene   CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                  Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Reverse Oxa1L  antibody (human)    CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                 Biolegio Designed by PrimerQuest tool (https://eu.idtdna.com/site)
Power SYBRGreen PCR Master Mix Thermo Fisher Scientific 4368702
FACS Tubes  Sarstedt 551578
MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate Thermo Fisher Scientific N8010560
Corning 100mm TC-Treated Culture Dish Corning
Corning Costar cell culture plates 6 well Corning 3506
Refrigerated Bench-Top Microcentrifuge Eppendorf 5415 R
Refrigerated Bench-Top Centrifuge Jouan CR3.12 Jouan 743205604
NanoDrop Lite Spectrophotometer Thermo Scientific ND-LITE-PR
BD FACSCalibur Flow Cytometer BD Bioscience
QuantStudio 3 Real-Time PCR System Thermo Fisher Scientific A28567
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, R. J., et al. Transcriptional regulation and function during the human cell cycle. Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).
  4. Peña-Diaz, J., et al. Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication. Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).
  5. Grant, G. D., et al. Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors. Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).
  6. Minderman, H., et al. In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells. Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).
  7. McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence. Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).
  8. Infante, A., et al. E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence. Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).
  9. Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. Analysis of cell cycle position in mammalian cells. J Vis Exp. (59), (2012).
  10. Schorl, C., Sedivy, J. M. Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells. Methods. 41 (2), 143-150 (2007).
  11. Lalande, M. A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle. Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).
  12. Park, S. Y., et al. Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells. Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).
  13. Ikegami, S., et al. Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha. Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).
  14. Baranovskiy, A. G., et al. Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin. Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).
  15. Adams, R. L., Lindsay, J. G. Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent. J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).
  16. Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation. Nucleic Acids Res. , (2016).
  17. Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE. Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).
  18. Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization. CSH Protoc. (2), (2006).
  19. Edwin Taylor, W. Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine. J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).
  20. Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells. Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).
  21. Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression. Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).
  22. Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. Quantification of mRNA using real-time RT-PCR. Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).
  23. Thornton, B., Basu, C. Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software. Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).
  24. Abbas, T., Dutta, A. p21 in cancer: intricate networks and multiple activities. Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).
  25. Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis. Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).
  26. Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis. J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).
  27. Knehr, M., et al. A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases). Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).
  28. Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription. EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).
  29. Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7. Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).
  30. Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis. J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).
  31. Thomas, D. B., Lingwood, C. A. A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures. Cell. 5 (1), 37-42 (1975).
  32. Whitfield, M. L., et al. Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors. Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).
  33. Lim, S., Cdks Kaldis, P. cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation. Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).
  34. Tapia, C., et al. Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity. Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).
  35. Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state. Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).
  36. Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation. Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).
  37. Kubota, S., et al. Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage. J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).
  38. Hartwell, L. H., Weinert, T. A. Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events. Science. 246 (4930), 629-634 (1989).
  39. St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha. Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).
  40. Min, A., et al. RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib. Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).

Tags

Cell CycleGene ExpressionCell SynchronizationU2OS CellsThymidine BlockNocodazoleMitotic Cell ArrestG2-MRNA ExtractionFACS Analysis

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Apraiz, A., Mitxelena, J., Zubiaga, A. Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols. J. Vis. Exp. (124), e55745, doi:10.3791/55745 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image