Method Article

Hücre Çevrimiyle Düzenlenen Gen İfadesini İki Tamamlayıcı Hücre Senkronizasyon Protokolü İle Çalışmak

DOI:

10.3791/55745

⸱

June 6th, 2017

 ,  , 
1Department of Cell Biology and Histology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 2Department of Genetics, Physical Anthropology and Animal Physiology, University of the Basque Country, UPV/EHU, 3Department of Molecular Mechanisms of Disease, University of Zurich

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsünün belirli evreleriyle ilgili olayları incelemek için bir bağlam sağlayan iki hücre senkronizasyon protokolünü bildiriyoruz. Bu yaklaşımın, pertürbüssüz bir hücre döngüsünde spesifik genlerin düzenlenişini analiz etmek için veya hücre döngüsünü etkileyen maddelere maruz kaldığında yararlı olduğunu göstermektedir.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsünün gen ekspresyon programı, hücre döngüsüne bağımlı süreçleri ve kanser gibi hastalıklarda rollerini anlamak için kritik bir aşamayı temsil eder. Hücre döngüsü düzenleyen gen ekspresyon analizi, belirli fazlara hücre senkronizasyonuna bağlıdır. Burada, hücre döngüsü boyunca gen ifadesinin periyodik değişimini incelemek için yaygın olarak kullanılan iki tamamlayıcı senkronizasyon protokolünü kullanan bir yöntemi açıklıyoruz. Her iki prosedür, tanımlanmış bir noktada hücre döngüsünün geçici olarak bloke edilmesine dayanır. Hidroksiüre (HU) muamelesiyle senkronizasyon protokolü geç G1 / erken S evresinde hücrenin durması ve HU aracılıklı tutuklamadan salınma, S ve G2 / M boyunca düzgün bir şekilde ilerleyen hücresel bir nüfusu sağlar. Timidin ve nokodazol (Thy-Noc) tedavisinin erken mitozda hücreleri bloke ettiği ve Thy-Noc aracılı arrestten salındığı senkronizasyon protokolü, G1 fazı ve S fazı için uygun senkronize edilmiş bir hücre popülasyonu sağlarÇalıştırmayı deneyin. Her iki prosedürün uygulanması, tipik olarak, hücrelerin propidyum iyodür (PI) boyaması ve akış sitometrisinin aracılık ettiği DNA içeriğinin analizinden sonra gerçekleştirilen hücre döngüsü dağıtım profillerinin izlenmesini gerektirir. İki senkronizasyon protokolünün kombine kullanımının, hücre döngüsünde ( örn. E2F1 ve E2F7) farklı şekilde regüle edilen genlerin transkripsiyonel profillerini açıkça belirlemek ve sonuç olarak hücre döngüsündeki rollerini daha iyi anlamak için sağlam bir yaklaşım olduğunu gösteriyoruz süreçler. Ayrıca, bu yaklaşımın, ilaç kökenli terapileri ( yani , bir anti-kanser ajanı olan mitomisin C) altında yatan mekanizmaların incelenmesi için yararlı olduğunu göstermekteyiz, çünkü genotoksik ajana yanıt veren genleri hücre döngüsünün bozulmalarından etkilenen genlerden ayırt etmeye imkan tanır Aracı tarafından dayatılan.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsünün tüm aşamalarına geçiş, sıkı düzenlenen bir gen ifade programı ile birleştirilir. Hücre döngüsü boyunca gen transkripsiyonunun "açık ve kapalı" koordine edilmesinin, kompleks transkripsiyon düzenleyici sistemlerin kontrolü altında olduğuna, sadece zamanlamayı değil aynı zamanda gen ifadesinin seviyelerini de düzenlediğine inanılmaktadır. Anahtar hücre döngüsü bileşenlerinin düzenlenmesinin çeşitli hastalıkların gelişimine katkıda bulunduğu bilinmektedir ve bu, tümörojenezin iyi bilinen bir özelliktir 1 , 2 . Maya ve memeli hücrelerinde gerçekleştirilen genom çapındaki transkriptomik analizler,....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Hücresel Senkronizasyon, Hücre Döngüsü Progresyonunun Yayımı ve İzlenmesi

  1. Timidin ve nokodazol esaslı (Thy-Noc) senkronizasyon ve Mitozdan U2OS hücrelerinin salınımı
    1. Gerekli hücre kültürü ortamı hazırlayın. U2OS hücreleri,% 10 (hac / hac) FBS ile tamamlanan DMEM-Glutamine ortamında rastgele büyütülür (isteğe bağlı olarak:% 1 penisilin / streptomisin). Tüm orta hazırlama ve manipülasyonu steril koşullar altında gerçekleştirin ve tamamlanıp hazırlanan ortamı (bundan böyle "eksiksiz ortam" olarak anılacaktır), kullanımdan önce 37 ° C'ye ısıtın.
    2. Tohum 10 ml komple kültür ortamında 100 mm çanak başına 2 x 10 6

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre senkronizasyonu için Thy-Noc ve HU tabanlı protokollerin şematik gösterimi.

Şekil 1 , hücre döngüsü boyunca ilerlemeyi doğrulamak ve gen ekspresyon analizleri gerçekleştirmek için U2OS hücre senkronizasyonu ve takip eden örnek toplanması için gerekli olan aşamaları özetlemektedir.

Phospho-H3 ve PI boyama, senkronizasyon yöntemlerini seçmek için iyi .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hücre döngüsünde geçici ve spesifik rollerde bulunan ince ayarlı regüle genlerin analizi, hücre popülasyonunun düzgünlüğünü gerektirir. Birçok araştırmacı, bu amaçlar için uzun süredir kurulmuş tümör hücresi çizgileri rutin olarak kullanmaktadır ve belirli hücre döngüsü evrelerinde mümkün olduğunca çok hücre biriktirmek amacıyla senkron (veya kısmen senkron) hücre popülasyonları elde etmek için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir. Dahası, iyi kurulmuş senkronizasyon yaklaşımlarını iyileştirmek ve optimize etmek için çok .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Yararlı tartışmalar ve teknik destek için Zubiaga ve Altmeyer laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, İspanyol Bakanlığından (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), Bask Hükümeti'nden (IT634-13 ve KK-2015/89) ve Bask Ülkesi UPV / EHU Üniversitesinden hibelerle desteklendi UFI11 / 20).

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM, yüksek glikoz, GutaMAX takviyesiThermo Fisher Scientific61965-059
FBS, nitelikli, AB onaylı, Güney Amerika menşeliThermo Fisher Scientific10270-106
Penisilin-Streptomisin (10.000 U/mL)Thermo Fisher Scientific15140-122
%0.25 Tripsin-EDTA (1x), fenol kırmızısıThermo Fisher Scientific25200-072
ThymidineSIGMAT1895-5GTaze hazırlanmış. Hafif ısınma timidinin çözülmesine yardımcı olabilir.
NocodazoleSIGMAM-1404DMSO'da -20 >m'de depolanan stok çözeltisi; Küçük alikotlarda C
HidroksiüreSIGMAH8627
Streptomyces caespitosusSIGMAM4287'denSteril H2< / sub>O'da 1.5 mM stok çözeltisi, ışıktan korunur ve 4 &m'de saklanır; C
Dimetil sülfoksitSIGMAD2650
Propidyum iyodürSIGMAP41705 mg / ml'de steril PBS'de stok çözeltisi, 4 >m'de saklanır; C ışıktan korunmuştur.
PBS pH 7.6Ev yapımı
EtanolPANREACA3678,2500
KloroformSIGMAC2432
Sodyum SitratPANREAC131655
Triton X-100SIGMAT8787
RNAseA Thermo Fisher ScientificEN0531
TRIzol ReaktifiLifeTechnologies15596018
RNeasy Mini kitiQIAGEN74106
Yüksek Kapasiteli cDNA Ters Transkripsiyon KitiThermo Fisher Scientific4368814
Anti-Siklin E1 antikoruHücre Sinyali41291:1000 %5 sütte seyreltme, o / n, 4 & ordm; C
Anti-Siklin B1 antikoruHücre Sinyali41351:1000 %5 süt, o / n, 4 & C
Anti-β-aktinSIGMAA-54411:3000 % 5 sütte seyreltme, 1 saat, RT
Anti-pH3 (Ser 10) antibotiMillipore06-570Protokolde belirtilmiştir
İkincil anti-tavşan AlexaFluor 488 antikoruInvitrogenR37116Protokolde belirtilmiştir
İkincil anti-fare-HRP antikoruSanta Cruz Biyoteknolojisc-3697% 5 sütte 1:3000 seyreltme, 1 saat, RT
Forward E2F1 antikoru (insan)                                      PrimerQuest aracı tarafından tasarlanan TGACATCACCAACGTCCTTGABiolegio(https://eu.idtdna.com/site)
Ters E2F1 antikoru (insan)                                      CTGTGCGAGGTCCTGGGTCBiolegioPrimerQuest aracı tarafından tasarlandı (https://eu.idtdna.com/site)
İleri E2F7 antikoru (insan)                                      GGAAAGGCAACAGCAAACTCTBiolegioPrimerQuest aracı tarafından tasarlanmıştır (https://eu.idtdna.com/site)
Ters E2F7 antikoru (insan)                                      TGGGAGAGCACCAAGAGTAGAAGABiolegioPrimerQuest aracı tarafından tasarlanmıştır (https://eu.idtdna.com/site)
İleri p21Cip1 antikor (insan)                                      AGCAGAGGAAGACCATGTGGACBiolegioPrimerQuest aracı tarafından tasarlanmıştır (https://eu.idtdna.com/site)
Ters p21Cip1 antikor (insan)                                      TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAGBiolegioPrimerQuest aracı tarafından tasarlanmıştır (https://eu.idtdna.com/site)
İleri TBP antikoru (insan) referans geni                                       PrimerQuest aracı tarafından tasarlananBiolegio
Ters TBP antikoru (insan)                                       PrimerQuest aracı tarafından tasarlananBiolegio
İleri Oxa1L antikoru (insan) referans geni    CACTTGCCAGAGATCCAGAAG                                 BiolegioDesigned by PrimerQuest aracı (https://eu.idtdna.com/site)
Ters Oxa1L   Antikor (insan)      CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG                               PrimerQuest aracı tarafından tasarlananBiolegio
Power SYBRGreen PCR Master MixThermo Fisher Scientific4368702
FACS Tüpleri Sarstedt551578
MicroAmp Optik 96 Kuyulu Reaksiyon PlakasıThermo Fisher ScientificN8010560
Corning 100 mm TC ile İşlem Görmüş Kültür KabıCorning
Corning Costar hücre kültürü plakaları 6 kuyuluCorning3506
Soğutmalı Tezgah Üstü MikrosantrifüjEppendorf5415 R
Soğutmalı Tezgah Üstü Santrifüj Jouan CR3.12Jouan743205604
NanoDrop Lite SpektrofotometreThermo ScientificND-LITE-PR
BD FACSCalibur Akış SitometresiBD Bioscience
QuantStudio 3 Gerçek Zamanlı PCR SistemiThermo Fisher ScientificA28567
taze hazırlanmış Mitomisin C: (https://eu.idtdna.com/site) (https://eu.idtdna.com/site) (https://eu.idtdna.com/site)

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas. Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).
  2. Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control. Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).
  3. Cho, ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Cell Cycle SynchronizationHydroxyurea TreatmentThymidine NocodazoleFlow Cytometry AnalysisGene Expression AnalysisRNA Extraction ProtocolPropidium Iodide StainingU2OS CellsMitotic Cell ArrestG1 S Boundary

Related Articles